巴戟天抗疲勞功效成分的研究

詹 積，徐德平

江南大學(xué)食品學(xué)院，無錫 214122

巴戟天(MorindaofficinalisHow)又名雞腸風(fēng)、雞眼藤、黑藤鉆，為雙子葉植物茜草科巴戟天的干燥根，味甘、微澀，性微溫，是我國著名四大南藥之一[1]。巴戟天提取物作為天然抗氧化劑，它含有蒽醌類物質(zhì)、環(huán)烯醚萜苷類化合物、糖類以及生物堿等有效化學(xué)成分，具有補腎助陽、強健筋骨、祛風(fēng)除濕、抗疲勞、抗抑郁等功效[2,3]。其中，蒽醌類成分包括甲基異茜草素-1-甲醚、大黃素甲醚、2-羥基-3-羥甲基蒽醌、甲基異茜草素；環(huán)烯醚萜類成分，如四乙酰車葉草苷酸、四乙酰車葉草苷以及同分異構(gòu)體水晶蘭苷和去車葉草苷酸等；糖類成分，如蔗果三糖、耐斯糖、菊淀粉型低聚糖類等[4-6]。目前對巴戟天抗疲勞方面的研究國內(nèi)少見報道，龍碧波[7]等研究表明巴戟天提取物可延長小鼠負重游泳時間，能增加小鼠肝糖原含量，降低血清乳酸和尿素氮含量。朱超[8]等研究表明巴戟天具有提高大鼠運動能力和心肌線粒體抗氧化酶活性的作用，可以延緩疲勞發(fā)生?？梢妵鴥?nèi)研究內(nèi)容上仍停留在提取和分析作用階段，并未提及巴戟天抗疲勞的功效成分。本文通過小鼠跑臺實驗和負重游泳實驗[3]，來研究巴戟天提取物對增強運動能力，強壯身體、抗疲勞的影響，同時也旨在明確抗疲勞的功效成分，為其在運動領(lǐng)域的研究開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 材料與試劑

巴戟天：購于安徽亳州中藥材市場；分析純有機試劑無水乙醇、濃硫酸、茴香醛、冰醋酸、正丁醇、甲醇(色譜純)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；GF254硅膠板：山東煙臺芝罘化工廠；AB-8型大孔吸附樹脂：天津南開大學(xué)化學(xué)工廠產(chǎn)品；Octadecylsilyl(ODS)填料：Nacalai Tosoh Inc；Middle Chromatogram Isolated Gel(MCI GEL)填料：Mitsubishi Chemical Corporation；雄性ICR小白鼠：上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 實驗儀器

RAT-100型萃取罐：無錫申科儀器有限公司；R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申順生物科技有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器廠；SHZ-95型循環(huán)水式多用真空泵：上海丞明儀器設(shè)備有限公司；SYB106-100型恒流泵：天津市科器高新技術(shù)公司；AB 204-N精密電子天平：Mettler-Toledo Group；BW-TDW709動物實驗跑臺：上海軟隆科技發(fā)展有限公司；核磁共振儀：Avance 500 MHz,Bruer 公司。

2 實驗方法

2.1 巴戟天乙醇提取物的制備

稱取巴戟天10 kg，粉碎后過40目篩，置于100 L提取罐，按1∶10(g/mL)料液質(zhì)量體積比加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇，60 ℃條件下攪拌提取6 h，過濾，取濾液減壓濃縮，濾渣按上述方法再次醇提，取濾液。合并兩次濾液，減壓濃縮至適宜體積，即為巴戟天乙醇提取物，冷凍保存。向巴戟天醇提后的濾渣中按上述方法加100 L去離子水，并于70 ℃條件下攪拌6 h，重復(fù)提取兩次，過濾，取濾液減壓濃縮至膏狀物，即為巴戟天水提物，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 巴戟天具有抗疲勞功效的成分分離及鑒定

取適量巴戟天醇提物上AB-8型大孔樹脂柱(10×150 cm)，依次用濃度為10%、45%、75%和95%得乙醇進行梯度洗脫，薄層色譜法(TLC)跟蹤監(jiān)測洗脫液中的成分，并根據(jù)TLC檢測結(jié)果將具有相同成分得洗脫液合并，將洗脫液分成A(10%洗脫)、B(45%洗脫)、C(75%洗脫)和D(95%洗脫)五個部分。分別減壓濃縮后，低溫冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

取適量巴戟天水提物，按醇水比為4∶1加入無水乙醇，并且不斷攪拌使得濃縮液充分醇沉，至酒精濃度達到70%以上，靜置過夜，過濾得到濾液相(E)經(jīng)減壓濃縮至浸膏，以及醇沉相(F)經(jīng)干燥得到固態(tài)顆粒，兩者低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1 巴戟天提取物A、B、C、D、E、F的抗疲勞功效

按2.3動物行為學(xué)實驗，分別檢測A、B、C、D、E和F六個樣品的抗疲勞功效。其中實驗組分別按劑量1.0 g/kg/天灌胃，小鼠的灌胃體積是0.1 mL/10 g/只。

2.2.2 具有抗疲勞功效成分的分離

取適量具有抗疲勞功效的巴戟天醇提物大孔樹脂柱分離10%乙醇洗脫物(A)上樣到MCI柱(5×100 cm)，依次用去離子水、8%和50%的乙醇進行梯度洗脫，流速10 mL/min，自動收集器每管20 mL收集洗脫液，用TLC薄層法跟蹤檢測洗脫液中的成分，根據(jù)Rf值和顯色反應(yīng)的結(jié)果，分析合并相同組分，得到L(水)、M(8%)和N(50%)三個部分。按2.3動物行為學(xué)實驗進一步確定抗疲勞活性組分。將具有抗疲勞活性的部分反復(fù)上樣ODS-A柱(3×100 cm)和ODS-AQ柱(3×100 cm)，不斷分離純化，直至得到4個單體化合物1～4。

2.2.3 單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

得到的4個單體化合物1、2、3、4，用重水(D2O)為溶劑，經(jīng)1H NMR和13C NMR等光譜方法鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.3 巴戟天不同組分抗疲勞活性研究

2.3.1 實驗動物分組及給藥

三周齡 SPF級雄性ICR小白鼠，體重16±2.0 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，觀察小鼠狀態(tài)，對小鼠進行標(biāo)記和隨機分組。每組10只，分為空白組與實驗組?？瞻捉M給正常飲用水，灌胃體積是0.1 mL/10 g/只，連續(xù)給藥30天。對抗疲勞實驗組給以劑量1.0 g/kg/天灌胃，小鼠的灌胃體積是0.1 mL/10 g/只，連續(xù)給藥30天。

2.3.2 訓(xùn)練及測試方法

2.3.2.1 小鼠跑臺實驗

實驗前一周，在喂食30 min后，先進行15 min跑步機適應(yīng)訓(xùn)練；給藥30 天后，在末次給藥后30 min，將實驗動物放在跑步機上進行動物體能測試。訓(xùn)練和測試均采用逐漸增加速度與坡度的方法(見表1)，且測試時以20 m/min速度使動物奔跑直至力竭。若小鼠落入電擊區(qū)，而經(jīng)過多次電擊仍無法起身往前跑即判定已經(jīng)力竭，記錄開始跑步至力竭的跑步時間。過程中實驗動物會因受電擊后離開刺激源，繼續(xù)在跑帶上活動，此時通道計時繼續(xù)累加。實驗用時到達設(shè)定時間2 h后，實驗停止[9,10]。實驗動物體能較好者電擊次數(shù)相對較少，而奔跑時間相對較長。

表1 實驗動物訓(xùn)練及測試方案Table 1 Training and measurement plan of laboratory animals

注：10 min之后保持20 m/min速度和10°坡度至結(jié)束。

Note:After 10 min,keep 20m/min speed and 10°degree.

2.3.2.2 小鼠負重游泳實驗[4,5]

跑臺實驗測試結(jié)束24 h后展開負重游泳實驗。給藥30 min后，將小鼠放入水箱(50×50×50 cm)內(nèi)進行游泳實驗。水深 35 cm，水溫 25±1 ℃，每只小鼠尾部負重5%體重的鉛皮，記錄小鼠入水至頭部全部入水持續(xù)8 s不能浮出水面的時間，記為小鼠力竭時間。

2.3.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果與討論

3.1 巴戟天醇提物和水提物不同組分的抗疲勞功效研究結(jié)果

各組小鼠體重變化、跑臺實驗力竭時間和負重游泳實驗力竭時間的測定結(jié)果見表2。

由表2可知，各給藥組中，只有A組小鼠較空白對照組實驗前后的體重變化明顯增加(P<0.05)。動物行為學(xué)實驗方面，小鼠跑臺測試力竭時間顯著增加(P<0.05),負重游泳力竭時間顯著增加(P<0.05)，說明A組(大孔樹脂10%乙醇洗脫組分)含有具有強壯、抗疲勞的活性成分。B組、C組、D組、E組和F組小鼠跑臺測試力竭時間和負重游泳力竭時間與空白組相比均無顯著改善，說明不含抗疲勞活性成分?；诖耍瑢Π完齑继嵛锎罂讟渲?0%乙醇洗脫物(A)進行進一步的分離純化。

表2 樣品A～F對小鼠體重、跑臺測試和負重游泳的影響Table 2 Effect of A-F from M.officinalis on body weight,running time and swimming time (n =

注：與空白對照組比較，*P< 0.05；**P< 0.01。

Note:Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01.

3.2 巴戟天醇提物正丁醇萃取相經(jīng)MCI柱分離得各組分得抗疲勞功效研究結(jié)果

各組小鼠體重變化、跑臺實驗力竭時間和負重游泳實驗力竭時間的測定結(jié)果見表3。

由表3可知，各給藥組中，只有L組小鼠實驗前后的體重變化相較于空白組的增長趨勢更顯著(P<0.05)。動物行為學(xué)實驗方面，L組小鼠跑臺測試力竭時間增加非常顯著(P<0.01),負重游泳力竭

時間也增加非常顯著(P<0.01)，說明L組(MCI柱分離水洗脫部分)含有具有抗疲勞的活性成分。M、N組小鼠跑臺測試力竭時間和負重游泳力竭時間與空白組相比均無顯著提高，說明不含抗疲勞活性成分?；诖?，將MCI柱水洗脫物依次反復(fù)上ODS-A和ODS-AQ分離柱，TLC法跟蹤檢測，直至得到4個單體化合物1、2、3、4。

表3 樣品L、M、N對小鼠體重、跑臺測試和負重游泳的影響Table 3 Effect of L,M and N on body weight,running time and swimming time (n =

注：與空白對照組比較，*P< 0.05；**P< 0.01。

Note:Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01.

3.3 化合物1、2、3、4的結(jié)構(gòu)分析

化合物1 為淺黃色結(jié)晶，易溶于水，微溶于乙醇、甲醇，吸濕性強。從1H NMR(500 MHz，D2O)可見：(5.4(1H，d，J=4.5)為葡萄糖上的端基H信號；其余均為糖上H信號。從13C NMR可見：δ105.8、δ105.9、δ105.7、δ95.1有4個碳信號，這4個碳應(yīng)為糖的端基碳信號，δ60～δ84共有20個碳信號，可以判斷為四糖。結(jié)合135DEPT可見，只有δ95.1有信號峰，表明其余三個糖為呋喃果糖。經(jīng)文獻對比[5-8]，數(shù)據(jù)基本一致，依此判定該化合物1為耐斯糖。

化合物2 不定型白色粉末，易溶于水、甲醇，可溶于甲醇、丙酮等，難溶于氯仿、乙醚等有機溶劑，吸濕性較強。

從1H NMR(500 MHz，D2O)可見：δ7.4(1H，s)和δ6.0(1H，s)為雙鍵上的H信號；δ4.9(1H，d，J=11.5)為葡萄糖上的端基H信號。

從13C NMR可見： δ152.0、δ153.7、δ131.4、δ117.2有四個碳信號，應(yīng)為兩個雙鍵上的碳信號。δ101.6、δ75.6、δ78.4、δ72.2、δ78.8、δ62.9有六個碳信號，應(yīng)該是葡萄糖基上的碳信號。結(jié)合135DEPT可見，δ131.4、δ102.9、δ101.6、δ47.4、δ44.3有5個-CH-信號，δ72～δ78為葡萄糖基4個-CH-信號，δ63.3、δ62.9有2個-CH2-信號。13C核磁共振詳細數(shù)據(jù)見表4。綜合分析，該化合物為環(huán)戊烯型環(huán)烯醚萜苷類化合物，經(jīng)文獻對比[5-8]，并分析得出化合物2為4-羧基-7-羥基-8-羥甲基-3,6-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷。

化合物3不定型淺棕黃色粉末，易溶于水、甲醇，可溶于甲醇、丙酮等，難溶于氯仿、乙醚等有機溶劑，吸濕性較強。

從1H NMR(500 MHz，D2O)可見：δ7.2(1H，s)和δ5.8(1H，s)為雙鍵上的H信號；δ5.3(1H，d，J=7.0)為葡萄糖基上的端基H 信號。

從13C NMR可見：該化合物與化合物Ⅱ類似，含有葡萄糖基碳信號。δ150.7、δ143.9δ、δ131.8、119.5有四個碳信號，應(yīng)為兩個雙鍵碳信號。δ198.0為羰基碳信號，δ25.7為甲基碳信號，故推測有結(jié)構(gòu)CH3C=O-。結(jié)合135DEPT可見，δ150.7、δ101.3、δ131.8、δ98.8、δ49.0、δ40.9、δ37.3為六個-CH-信號， δ78.9～δ72.2為葡萄糖基上四個-CH-信號，δ63.3、δ62.4、δ40.9為三個-CH2-信號，δ25.7為一個-CH3-信號。13C核磁共振詳細數(shù)據(jù)見表4。綜合分析，該化合物為環(huán)戊烯型環(huán)烯醚萜苷類化合物，經(jīng)文獻對比[5-8]，并分析得出化合物3為4-乙酰基-8-羥甲基-3,7-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷。

化合物4 不定型淺棕黃色粉末，易溶于水，易溶于水、甲醇，可溶于甲醇、丙酮等，難溶于氯仿、乙醚等有機溶劑，吸濕性較強。

從1H NMR(500 MHz，D2O)可見：δ7.2(1H，s)和δ5.9(1H，s)為雙鍵上的H信號；δ5.5(1H，s)為葡萄糖基上的端基H信號。

從13C NMR可見：從13C NMR可見：該化合物與化合物2類似，含有葡萄糖基碳信號。δ151.7、δ150.9、δ128.3、δ116.6有四個碳信號，應(yīng)為兩個雙鍵碳信號。δ177.4為羧基碳信號；δ176.6為羰基碳信號，δ23.5為甲基碳信號，故推測有CH3C=O-結(jié)構(gòu)。結(jié)合135DEPT可見，δ150.9、δ128.3、δ101.1、δ98.2、δ85.8、δ48.5、δ43.2為七個-CH-信號，δ78.9～δ72.2為葡萄糖基上四個-CH-信號，δ63.3、δ62.0為兩個-CH2-碳信號，δ23.5為一個-CH3-碳信號。13C核磁共振詳細數(shù)據(jù)見表4。綜合分析，該化合物為環(huán)戊烯型環(huán)烯醚萜苷類化合物，經(jīng)文獻對比[5-8]，并分析得出化合物4為4-羧基-7-羥基-8-羥甲基-10-乙?；?3,6-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷。

對于巴戟天環(huán)烯醚萜苷的研究，廣州中醫(yī)藥大學(xué)李遠彬[5]、黃珍珍等[6]分離得到水晶蘭苷、乙酰車葉草苷酸和車葉草苷酸。但在本文研究鑒定圖譜中分析并未分離出相同化合物。

表4 化合物2、3、4的13C核磁共振數(shù)據(jù)Table 4 13C NMR Spectroscopic Data of Compound 2,3 and 4

通過以上測定分析2、3、4三種化合物的結(jié)構(gòu)如圖2所示：

圖1 化合物2、3、4的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 2,3 and 4

4 結(jié)論

本文實驗結(jié)果表明，巴戟天醇提物大孔樹脂10%乙醇洗脫物經(jīng)MCI分離，水洗脫組分對小鼠抗疲勞有顯著作用。對MCI柱水洗脫物進一步分離得到1、2、3、4四個化合物，經(jīng)NMR鑒定，分別為耐斯糖(1)、4-羧基-7-羥基-8-羥甲基-3,6-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷(2)、4-乙?；?8-羥甲基-3,7-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷(3)、4-羧基-7-羥基-8-羥甲基-10-乙?；?3,6-環(huán)戊烯環(huán)烯醚萜苷(4)?；衔?耐斯糖屬于寡糖類，并不具有抗疲勞功效。本文首次報道化合物2、3、4是從巴戟天具有抗疲勞功效部位中分離、鑒定的環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)。但有待進一步實驗證明巴戟天抗疲勞的主要功效成分及其抗疲勞的作用機制。