白芍多糖體內(nèi)、外抗氧化活性組分篩選研究

秦亞東， 汪榮斌， 周娟娟

(1.安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校 藥學(xué)系，安徽 蕪湖 241002；2.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院 制劑室，安徽 蕪湖 241000)

人體的氧化與抗氧化作用應(yīng)處于一個(gè)相對(duì)平衡狀態(tài)。由于種種原因產(chǎn)生過量的自由基和活性氧與人體的衰老、細(xì)胞的損傷等有密切關(guān)系，自由基過多會(huì)使細(xì)胞發(fā)生超氧化，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的改變[1]，最終導(dǎo)致人體皮膚、內(nèi)臟、大腦等組織器官衰老并引發(fā)多種嚴(yán)重疾病[2]。人體具有系統(tǒng)的抗氧化防御機(jī)制，可以最大限度的將體內(nèi)的自由基和活性氧清除。其中酶系統(tǒng)抗氧化物包括身體自身的細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷肽甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(POD)等；非酶系統(tǒng)抗氧化物包括金屬結(jié)合蛋白、還原性谷胱甘肽(GSH)、各種維生素、激素等。

機(jī)體自由基的清除除依靠自身的抗氧化系統(tǒng)外，自然來源的藥物植物提取物也逐漸應(yīng)用于抗氧化保健產(chǎn)品領(lǐng)域。研究表明植物中的多糖類物質(zhì)具有明顯的生物活性, 是一種潛在的天然的抗氧化物質(zhì)[3-5]。傳統(tǒng)中藥多糖抗氧化作用對(duì)預(yù)防和治療心腦血管系統(tǒng)疾病發(fā)揮重要作用，從傳統(tǒng)中藥多糖中尋求能夠清除體內(nèi)自由基或能抑制機(jī)體氧化作用的活性組分或成分是中醫(yī)藥大健康行業(yè)發(fā)展的熱點(diǎn)領(lǐng)域。相關(guān)研究[6-7]已經(jīng)證實(shí)白芍多糖在體內(nèi)、外均具有一定的抗氧化作用[8]。為進(jìn)一步探索白芍多糖體內(nèi)、外抗化作用活性組分，本研究采用熱水回流提取后分步醇沉法，通過控制醇沉條件，將白芍多糖按分子量大小分為PRPS20、PRPS40、PRPS60、PRPS80四個(gè)組分，通過對(duì)四個(gè)組分的白芍多糖進(jìn)行體內(nèi)、外抗氧化活性組分篩選研究，明確白芍多糖抗氧化作用的活性多糖成分群所處組分，以期為白芍老藥新用及保健產(chǎn)品開發(fā)提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試藥與試劑 白芍飲片購(gòu)于安徽亳州中藥材大市場(chǎng)(批號(hào)：201607);抗壞血酸(VC),1,1-二苯代苦味肼基自由基(DPPH)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-葡萄糖對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：110833-201603)；維生素E(VE)膠丸購(gòu)于廣州白云山制藥總廠(批號(hào)：2015021106)；無水乙醇，乙醚，丙酮等均為市售分析純；丙二醛(MDA，批號(hào)：20150211)，超氧化物歧化酶(SOD，批號(hào)：20150507)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px, 批號(hào)：20150507)均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 受試動(dòng)物 ICR小鼠，雄性，20±2 g，SPF級(jí)，購(gòu)于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001，動(dòng)物合格證號(hào)：NO.201711181。

1.1.3 儀器 RE-5002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(西安比諾儀器設(shè)備有限公司)；Cary60型紫外-可見分光光度儀(美國(guó)Agilent公司)；Sigma3-18K型臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；CAP124S型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同組分白芍多糖的制備 在前期研究基礎(chǔ)，取白芍適量，粉碎后，經(jīng)無水乙醇已經(jīng)浸泡過夜處理2次，以除去小分子物質(zhì)及色素等成分，藥渣自然晾干后熱水提取2次，合并濾液，水浴蒸發(fā)至原體積的三分之一，向?yàn)V液中緩慢加入無水乙醇使含醇量達(dá)到20%(v/v)，置冰水浴中12 h，收集下層沉淀，離心處理(3 000 r/min,5 min)，沉淀經(jīng)丙酮、乙醚反復(fù)沖洗后，揮干溶劑即得PRPS20組分；繼續(xù)向上述濾液中加入無水乙醇使含醇量達(dá)到40%(v/v)，其余操作方法相同，以此類推，分別制得PRPS40組分、PRPS60組分、PRPS80組分。

1.2.2 多糖得率及多糖含量的測(cè)定 將1.2.1節(jié)下所得的PRPS20、PRPS40、PRPS60、PRPS80組分在60 ℃低溫干燥至恒重后稱定重量，分別計(jì)算各組分的多糖得率和多糖含量。多糖得率=不同組分多糖干燥后重量(g)/白芍取樣量(g)×100%；以D-葡萄糖為對(duì)照品，采用硫酸-苯酚顯色，紫外分光光度計(jì)于490 nm下測(cè)定[9]，計(jì)算白芍各組分多糖含量。

1.2.3 體外DPPH清除作用 參考文獻(xiàn)方法[5-7]，精密稱取白芍各組分多糖，以蒸餾水為溶劑，配制濃度為0.8 mg/mL溶液，然后梯度稀釋后分別得到濃度分別為0.8、0.4、0.20、0.10、0.05 mg/mL的多糖樣品溶液。分別取各樣品溶液與等體積的DPPH溶液加入同一具塞棕色試管中，震搖均勻后避光反應(yīng)30 min，于517 nm下測(cè)定吸光度T，同時(shí)測(cè)定DPPH溶液與等體積純水混合液的吸光度C，以及待測(cè)液與等體積95%乙醇混合液的吸光度T0，清除率=[1-(T-T0)/C]×100%，本試驗(yàn)采用抗壞血酸作為對(duì)照，同時(shí)計(jì)算半數(shù)清除率IC50。

1.2.4 體內(nèi)抗氧化作用 受試小鼠隨機(jī)分為6 組：正常對(duì)照組、D-半乳糖模型組(100 mg/kg)、VE對(duì)照組(50 mg/kg)、白芍多糖PRPS20、PRPS40、PRPS60、PRPS80組(200 mg/kg)，每組10 只。白芍多糖組、VE對(duì)照組均使用0.3% CMC-Na配制成混懸液，10 mL/kg每天灌胃給藥1 次，正常組及D-半乳糖模型組給予等體積0.3% CMC-Na溶液灌胃給藥。除正常對(duì)照組外，其余各組每天頸背部皮下注射D-半乳糖(100 mg/kg)，注射劑量為0.01 mL/g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始給藥，連續(xù)21 d。末次給藥后，禁食不禁水，16 h后取眼底靜脈血約1.0 mL收集與EP管中，靜置后低溫離心處理，取上層血清，按試劑盒操作說明，測(cè)定血清中MDA、SOD和GSH-Px活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 白芍不同多糖組分得率及含量

分步醇沉對(duì)白芍多糖得率和含量的影響見圖1。醇沉濃度為20%時(shí)，多糖得率最高為1.69%，依次是40%和60%，最后當(dāng)醇沉濃度為80%時(shí)多糖得率最低僅為0.67%，因此多糖得率有隨著醇沉濃度升高而下降的趨勢(shì)，同時(shí)也說明白芍多糖不同醇沉部分多糖的分布是不均勻的，20%和40%(高分子量多糖部分)醇沉部分占全部多糖的61%，80%醇沉部分(小分子量多糖)所占多糖比例較低為12.8%；各部分多糖含量的變化趨勢(shì)是先增加后降低，40%醇沉部分含量最高，80%多糖組分含量最低，可能與含有色素等小分子雜質(zhì)有關(guān)。

圖1 分步醇沉對(duì)白芍多糖得率和含量的影響

2.2 體外清除DPPH作用

白芍多糖不同組分系列濃度對(duì)DPPH的清除作用呈現(xiàn)不同的規(guī)律，由圖2可見，PRPS20、PRPS40對(duì)DPPH的清除率隨濃度的增加無明顯變化；PRPS60、PRPS80隨著濃度的增加對(duì)DPPH的清除率逐漸增加，尤其是PRPS80組分更是顯示出了明顯的濃度依賴性。PRPS60、PRPS80和抗壞血酸的IC50分別為0.355、0.086、0.002 mg/mL，而抗壞血酸對(duì)照樣品在0.008 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH的清除率達(dá)到50%。與抗壞血酸相比，白芍不同組分多糖對(duì)DPPH的清除能力較弱。

圖2 白芍多糖對(duì)DPPH清除作用

2.3 白芍多糖對(duì)衰老小鼠血清中SOD、MDA及GSH-Px的影響

各組試驗(yàn)小鼠血清中SOD、MDA及GSH-Px活力測(cè)定結(jié)果見表1，由于中、低劑量組(100 mg/kg、50 mg/kg)對(duì)小鼠血清中SOD、MDA及GSH-Px活力影響不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表1為高劑量組(200 mg/kg)試驗(yàn)結(jié)果。D-半乳糖模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px活力比正常對(duì)照組明顯降低，MDA活力明顯升高，均且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，說明小鼠衰老造模成功；PRPS40組能顯著升高小鼠血清中SOD、GSH-Px活性，同時(shí)顯著降低MDA活性，具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，其他多糖組作用不明顯。提示PRPS40組是白芍多糖體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，可能是白芍多糖體內(nèi)抗氧化的活性多糖組分。

表1 PRPS對(duì)衰老小鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px的影響

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01。

3 結(jié)論與討論

隨著對(duì)中藥多糖研究的不斷深入，越來越多的中藥多糖被證實(shí)具有多方面的生物學(xué)活性。傳統(tǒng)中藥多糖具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此中藥多糖均一成分的提取分離難度較大。為降低白芍多糖體內(nèi)外抗氧化活性組分的研究難度，結(jié)合課題組前期研究確定白芍多糖在體內(nèi)、外均具有一定的抗氧化作用[6-7]，為尋求白芍多糖抗氧化藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究利用分步醇沉手段，通過控制醇沉濃度，將白芍多糖按分子量大小分為PRPS20、PRPS40、PRPS60、PRPS80四個(gè)組分，通過對(duì)4個(gè)分子量范圍不同的白芍多糖組分進(jìn)行體內(nèi)、外抗氧化作用比較，以確定白芍多糖抗氧化活性組分。

本研究利用經(jīng)典體外抗氧化作用試驗(yàn)DPPH自由基清除率測(cè)定試驗(yàn)，由于其穩(wěn)定性高、結(jié)果重現(xiàn)性好，且在同一測(cè)試條件下結(jié)果具有極大的可比性。由研究結(jié)果可見白芍多糖4個(gè)組分在體外抗氧化活性總體效果較弱，如圖2所示。PRPS80和PRPS60在試驗(yàn)所用濃度范圍內(nèi)尚呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，尤其是PRPS80可以說是白芍多糖體外抗氧化的活性組分，但和抗壞血酸相比，其抗氧化作用較弱(PRPS80組分的IC50為0.086 mg/mL，抗壞血酸的IC50為0.008 mg/mL)。白芍多糖體外抗氧化作用雖然較弱，但不能代表白芍多糖在體內(nèi)抗氧化的真實(shí)情況，任何體外抗氧化的化學(xué)模式都不可能完全模擬體內(nèi)真實(shí)生理環(huán)境下的抗氧化作用。白芍多糖體內(nèi)抗氧化作用結(jié)果提示PRPS40組分高劑量組(預(yù)試驗(yàn)表明200 mg/kg作用明顯，中低劑量組(50、100 mg/kg)效果不顯著，P>0.05)在對(duì)抗衰老小鼠試驗(yàn)中表現(xiàn)出了一定的抗氧化作用，PRPS40組分多糖可以升高SOD、GSH-Px活力，降低MDA水平，體現(xiàn)出了明顯的體內(nèi)抗氧化作用，而其他3個(gè)組分作用則不明顯，提示PRPS40組分是白芍多糖是體內(nèi)抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，是起到體內(nèi)抗氧化的活性多糖組分[10]。PRPS40組分仍不是分子量均一的多糖化學(xué)成分，課題組將進(jìn)一步對(duì)PRPS40組分進(jìn)行分離純化，繼續(xù)尋求分子量均一的多糖化學(xué)成分，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和生物學(xué)活性的深入研究。通過本試驗(yàn)研究，以期為多糖抗氧化活性成分的深入研究提供思路和借鑒。