特征性峰位法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)構(gòu)建奶粉脂肪含量定量模型

楊 澤， 馮佳麗， 張 宏, 馬玉涵*， 趙 巖

(1. 安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2. 中國科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230031)

奶粉是一種常見的乳制品,富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦質(zhì)元素等多種營養(yǎng)物質(zhì)[1]。奶粉中的脂肪含量是乳制品研究的重點之一,也是奶粉中的主要成分之一。相關(guān)研究顯示，41種奶粉的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.06%,在中老年和嬰幼兒奶粉中含量最高,接近30%,而在女士奶粉及脫脂奶粉中含量較低,最低僅1.2%。在嬰幼兒配方奶粉中,脂肪具有重要作用:(1)提供了40%～50%嬰兒生長發(fā)育和維持健康需要的能量;(2)是脂肪酸的主要來源,構(gòu)成機體的重要成分;(3)是脂溶性營養(yǎng)的重要載體[2]。

對奶粉營養(yǎng)物質(zhì)的檢測主要基于化學(xué)測定法,但其存在一定的弊端。如化學(xué)試劑使用會污染環(huán)境,檢測往往需要比較復(fù)雜昂貴的檢測儀器(凱氏定氮儀、高效液相色譜儀、原子吸收分光光度計等),檢測費用和時間成本較高等[3]。除此之外,以間接產(chǎn)物為目標(biāo)的檢測方法會為不法分子摻假提供便利,比如此前引發(fā)了重大食品安全問題的三聚氰胺事件就是由于凱氏定氮法在檢測中存在的漏洞所致[4]。

傅里葉變換中紅外(FTIR)光譜具有檢測速度快、操作簡便、適合于高通量多種成分的快速分析,并具有指紋特征,可以對備選成分有效檢測的同時對非法添加的成分進(jìn)行判斷識別。因此,FTIR光譜廣泛應(yīng)用于化學(xué)、材料科學(xué)、農(nóng)業(yè)和食品科學(xué)領(lǐng)域[5]。紅外光譜可分為近紅外(1 333-4 000 cm-1)、中紅外區(qū)(400-4 000 cm-1)和遠(yuǎn)紅外區(qū)(10-400 cm-1)3個譜段[6]。大多數(shù)有機化合物和無機離子的基頻振動吸收都落在中紅外區(qū)內(nèi)。因為化合物分子中所含的化學(xué)鍵或官能團(tuán)不同,或者官能團(tuán)所處的化學(xué)環(huán)境不同,所以振動能級從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)所需能量不同,因而會吸收不同波長的紅外光,形成不同的紅外光譜圖[7]。FTIR光譜可以實現(xiàn)對物質(zhì)某些特定基團(tuán)的鑒定和指認(rèn),其吸收峰峰高(峰面積)與該基團(tuán)的濃度成正比例關(guān)系,符合朗伯-比爾定律。因此,也可以利用FTIR光譜對物質(zhì)進(jìn)行定量分析[8]?；诖死碚摰淖钪饕椒ň褪俏辗宸甯?峰面積)定量法[9]。但是這種定量關(guān)系存在一定的問題,最主要的就是對于復(fù)雜的多組分體系,FTIR光譜峰位往往會疊加,互相干擾,給定量分析造成不便[10]。

為解決這些問題，一種方法是對復(fù)雜體系的FTIR光譜進(jìn)行分峰擬合,將一個寬峰經(jīng)過變換,獲得更為精細(xì)的峰位信息[11]。另一種方法是基于化學(xué)計量學(xué)的方法。隨著計算機計算能力的提升,對大量光譜進(jìn)行矩陣分析成為可能,也產(chǎn)生了多種算法實現(xiàn)對光譜的定量分析。其中應(yīng)用最廣的是偏最小二乘法(PLS)[12]。本試驗利用光譜特征峰位法和PLS法對奶粉的脂肪含量進(jìn)行定量分析,以分析二者在FTIR光譜定量分析方面的優(yōu)劣,并將二者結(jié)合起來,以期獲得更為高效穩(wěn)定的定量分析模型。

1 材料與方法

1.1 供試材料

對市售的41種奶粉進(jìn)行FTIR光譜分析,其中的奶粉包含了全脂奶粉、脫脂奶粉、高蛋白奶粉、高鈣奶粉、中老年奶粉、嬰幼兒奶粉等各個品類,脂肪含量呈現(xiàn)明顯的梯度變化(表1)。

1.2 奶粉脂肪含量檢測

實驗嚴(yán)格按照GB 5413.3-2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪的測定》中蓋勃乳脂計方法測定[13]。

1.3 試驗方法

采用奶粉稀釋氟化鈣薄膜法,將各奶粉樣品加蒸餾水充分溶解后,調(diào)整濃度為40 mg/mL,取15 μL滴加到CaF2紅外光譜窗片上,40 ℃干燥過夜,將載有樣品的CaF2紅外光譜窗片上光譜儀檢測。所用光譜儀為Perkin Elmer公司的Spectrum GX傅里葉變換紅外光譜儀,DTGS檢測器,分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)累加32 次。

表1 試驗所用奶粉品牌及脂肪含量

1.4 FTIR光譜擬合

利用Peakfit 4進(jìn)行特征峰區(qū)擬合;去卷積處理(Deconvolution);基線類型:Linear,D2;峰位類型:Gauss Amp;可變寬度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

FTIR光譜利用OPUS 7.0軟件進(jìn)行基線校正、矢量歸一化和PLS定量模型構(gòu)建;線性回歸利用IBM SPSS 19計算分析;Origin Pro 2016繪圖[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶粉的FTIR光譜圖

奶粉的FTIR光譜如圖1所示,特征性峰位的歸屬見表2。其中脂肪的特征性峰位為2 925、2 855、1 745 cm-1。

圖1 奶粉的FTIR光譜圖

波數(shù)/cm-1基團(tuán)歸屬 3 800～3 200O-H伸縮振動糖的吸收峰 2 925CH2的非對稱伸縮振動(主要來源于脂肪) 2 854CH2的對稱伸縮振動(主要來源于脂肪) 1 745C=O伸縮振動(主要來源于脂肪) 1 651酰胺I帶C=O吸收峰(主要來源于蛋白質(zhì)) 1 543酰胺II帶的N-H和C-N吸收峰(主要來源于蛋白質(zhì)) 1 456CH2/CH3彎曲振動(脂肪、蛋白質(zhì)) 1 200～1 030C-O伸縮振動 930～900環(huán)振動

2.2 奶粉脂肪FTIR光譜特征性峰位的確定

通過對普通奶粉、全脂奶粉、脫脂奶粉、嬰兒奶粉FTIR光譜分析,我們發(fā)現(xiàn),奶粉脂肪含量在2 925、2 855、1 745 cm-1峰位有顯著差異,上述峰位在25號嬰兒配方奶粉>7號伊利全脂奶粉>1號完達(dá)山益生元中老年奶粉>5號完達(dá)山脫脂奶粉(圖2)。此結(jié)果證實了表2結(jié)論,并體現(xiàn)出上述峰位峰高與脂肪含量之間似乎存在劑量依賴關(guān)系。

圖2 普通奶粉、全脂奶粉、脫脂奶粉和嬰兒奶粉的FTIR光譜比較

2.3 奶粉FTIR光譜脂肪特征性峰的峰高和峰面積擬合計算結(jié)果

為對此劑量依賴關(guān)系進(jìn)行定量分析判斷,對41種奶粉FTIR光譜進(jìn)行峰位擬合處理,以1號完達(dá)山益生元中老年奶粉為例,其峰區(qū)擬合結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示,脂肪含量與2 925、2 855、1 745 cm-1峰位的積分面積和峰高均存在相關(guān)性,且各峰峰高和峰面積之間也存在相關(guān)性(P<0.001)(表3),其線性回歸分析方程結(jié)果如所示。

圖3 完達(dá)山益生元中老年奶粉FTIR光譜2 750～3 000 cm-1和1 500～1 800 cm-1光譜擬合圖

脂肪含量2 925 cm-1峰面積2 925 cm-1峰值2 855 cm-1峰面積2 855 cm-1峰值1 745 cm-1峰面積1 745 cm-1峰值 脂肪含量 2 925 cm-1峰面積0.749?? 2 925 cm-1峰值0.815??0.985?? 2 855 cm-1峰面積0.762??0.947??0.950?? 2 855 cm-1峰值0.799??0.981??0.993??0.962?? 1 745 cm-1峰面積0.725??0.848??0.881??0.8080.862?? 1 745 cm-1峰值0.818??0.948??0.989??0.942??0.988??0.873??

Fat Content=6.937+14.975×Area1 745+6.661×Area2 855-6.29×Area2 925

(回歸方程1)

Fat Content=6.979+1 054.486×Height1 745-419.825×Height2 855+104.62×Height2 925

(回歸方程2)

(回歸方程1)R=0.83,R2=0.688 3;(回歸方程2)R=0.831,R2=0.688 5。

以上述公式計算的奶粉脂肪含量計算值和真值(表1)比較,其對應(yīng)關(guān)系如圖4所示?？梢钥闯?雖然脂肪含量與2 925、2 855、1 745cm-1峰位的積分面積和峰高存在較強的相關(guān)性,但通過簡單的線性回歸獲得的方程1和2計算值與真實值之間仍存在著比較明顯的差距。說明僅僅以特征峰位法構(gòu)建奶粉的脂肪含量方程效果不甚理想。

圖4 由線性回歸公式獲得的奶粉脂肪含量計算值和真值對應(yīng)圖(a)峰積分面積;(b)峰高

2.4 奶粉FTIR光譜脂肪含量PLS定量自動優(yōu)化模型

為改善FTIR光譜定量分析效果,嘗試?yán)没瘜W(xué)計量學(xué)手段,以O(shè)PUS軟件的自動優(yōu)化功能,獲得的PLS法構(gòu)建脂肪含量的定量模型,結(jié)果如圖5所示。從此圖可以看出,定量模型的R2=0.943,RMSECV=1.71,RPD=3.88,維數(shù)=10。雖然獲得了較高的R2值和較低的RMSECV結(jié)果,但從RMSECV/維數(shù)結(jié)果可以看出,該模型很不穩(wěn)定,在樣本擴大的情況下可能會造成定量誤差增大。該定量模型的光譜范圍為(3 689.33～376.9)+(3 070.32～757.8)+(2 449.32～138.8)+(1 521.6～900.6) cm-1,范圍分散,說明該自動優(yōu)化模型沒有能夠特異性的選擇與脂肪相關(guān)的特異性峰位,造成了定量模型維數(shù)的過飽和現(xiàn)象。

圖5 奶粉脂肪含量FTIR自動優(yōu)化定量模型

2.5 基于奶粉脂肪特征峰位的FTIR光譜脂肪含量定量分析模型

為改善定量分析模型的分析效果,避免光譜范圍選擇的過飽和現(xiàn)象,我們以脂肪特征性的2 925、2 855、1 745 cm-1峰位作為備選峰位,經(jīng)過優(yōu)化,獲得了新的定量分析模型。所選用的光譜范圍為(2 997-2 781)+(1 795.5-960.4) cm-1,預(yù)處理方式為一階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正。校正集計算結(jié)果如圖6所示。從上圖可以看出,定量模型的R2=0.931,RMSECV=1.69,RPD=4.01,維數(shù)=6,其RMSECV/維數(shù)呈現(xiàn)平滑下降曲線,模型穩(wěn)定,分析效果理想。

圖6 奶粉脂肪含量FTIR定量模型

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)有的檢測奶粉脂肪的方法包括羅茲·哥特里法、索氏提取法、巴布考克法、蓋勃氏乳脂計測量法、色譜技術(shù)等[15]。但上述方法實驗操作復(fù)雜,儀器設(shè)備昂貴,實驗試劑對環(huán)境會造成污染,不適應(yīng)常規(guī)快速高通量的質(zhì)檢檢測,光譜分析技術(shù)可以有效避免上述缺陷,是具有潛在應(yīng)用價值的適宜方法[16]。常用用于乳制品定性和定量分析的光譜技術(shù)包括中紅外光譜和近紅外光譜[15-17]。

中紅外光譜特征性峰位特征明顯,以往主要用于物質(zhì)的鑒定和定性分析,但最近隨著計算機技術(shù)的發(fā)展和化學(xué)計量學(xué)的進(jìn)步,開展了越來越多的定量分析嘗試。主要包括兩大類,第一類是對特征性峰區(qū)面積、峰高等根據(jù)朗伯-比爾定律進(jìn)行回歸分析,例如楊妮娜等[18]利用特征性峰面積方法對傣藥燈臺葉中藥用成分含量進(jìn)行測定,朱亞明等[19]用分峰擬合法定量分析精制煤瀝青熱轉(zhuǎn)化過程的結(jié)構(gòu)變化等。第二類是利用化學(xué)計量學(xué)手段,采用PLS、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、主成分分析、支持向量機等方法對中紅外光譜進(jìn)行定量分析。例如吳迪等[15]利用LS-SVM方法對奶粉脂肪含量予以分析,趙巖等[20]利用PLS方法對酸奶中的營養(yǎng)成分加以定量等。二者在定量方法和原理上存在一定的差異,本文對兩種方法進(jìn)行比較后結(jié)合使用,為奶粉脂肪的FTIR光譜定量分析方法的優(yōu)化做了嘗試。

從實驗結(jié)果可以看出,脂肪含量與2 925、2 855、1 745 cm-1峰位的積分面積和峰高存在較高的相關(guān)性,其相關(guān)系數(shù)均大于0.7,且上述峰高和峰面積之間也存在共線性關(guān)系。利用此峰高和峰面積獲得了2個回歸方程,這兩個回歸方程的R=0.832,R2=0.688 3和R=0.831,R2=0.688 5。說明該回歸方程能夠?qū)δ谭壑竞孔鲞m當(dāng)?shù)亩ㄐ耘袛?但尚無法達(dá)到合理的定量判斷能力。這說明對于奶粉這樣的復(fù)雜體系而言,單純依靠特征峰的面積或者峰高尚無法得到非?？煽康亩磕Ｐ?。從真值和計算值的對應(yīng)關(guān)系來看,該公式對脂肪含量較高的奶粉預(yù)測效果較差。這提示有些脂肪信息未得到有效提取,需要對光譜范圍適當(dāng)擴展。

但過寬的光譜范圍也可能對定量計算結(jié)果造成不利影響。雖然吳迪等對奶粉脂肪含量的中紅外光譜全譜范圍(4 000-400 cm-1)以LS-SVM構(gòu)建定量模型,其維數(shù)為8,R2=0.955 6,RMSECV=1.666 8[15]。但本研究發(fā)現(xiàn),如果對全譜范圍以PLS構(gòu)建定量模型,其R2=0.642 8,RMSECV=4.12,其RMSECV/維數(shù)結(jié)果不穩(wěn)定,尚不及線性回歸方程計算效果。

利用OPUS軟件自帶的自動優(yōu)化功能,所獲得的定量分析模型雖然有較高的R2值,較低的RMSECV結(jié)果,但選定的維數(shù)過高,選擇維數(shù)過飽和,模型不夠穩(wěn)定。而以脂肪的特征性峰位為基礎(chǔ),優(yōu)化獲得的定量分析模型有更低的維數(shù),更加穩(wěn)定的分析效果,其R2=0.931,RMSECV=1.69,RPD=4.01,維數(shù)=6,可以對奶粉的脂肪含量做比較準(zhǔn)確的定量分析。