廣西云耳物種學名探究

祁亮亮 韋仕巖 藍桃菊 郎 寧

（廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院微生物研究所，廣西南寧530007）

云耳是云南、貴州和廣西等地特色的木耳屬食用菌，隸屬于木耳目（Auriculariales），木耳科（Auriculariaceae）。木耳屬真菌分布廣泛，主要生長在闊葉樹倒木或腐木上，偶見于腐朽的竹子上[1]，是重要的食藥用菌[2-4]。我國對木耳屬的研究始于1939年，鄧叔群記載了中國木耳屬真菌6種[5]；20世紀80年代后，國內學者相繼發(fā)現報道了4個木耳屬新種[6-8]；近些年，基于形態(tài)學與分子系統(tǒng)學，諸多木耳屬新種被發(fā)現[9-13]。截至目前，木耳屬有效名稱75個[13]，中國有15個。云耳在廣西多個市縣有廣泛栽培。

從宋代起，廣西百色地區(qū)已開始人工栽培云耳。因此，云耳是廣西特有的種質資源[14]，一般發(fā)生在桂西、桂西北[15]。據記載，野生云耳大多發(fā)生于櫟木腐木與麻櫟林交界的混交林中，偶有在米椎（Castanopsisspp.）等其他樹種上[14]，多被描述為廣西特有的木耳品種[16-19]，學名常寫作為Auricularia auricu-lar[14，19]或者A.auricular-judae[17]，但缺乏有力證據。在宏觀形態(tài)學上與云耳相似的物種多為近些年發(fā)表的新種或新記錄種，如闊葉樹木耳A.angiospermarumY.C.Dai，F.Wu﹠D.W.Li、黑木耳A.heimuerF.Wu，B.K.Cui﹠Y.C.Dai、小木耳A.minutissimaY.C.Dai，F.Wu﹠Malysheva、脆木耳A.fibrilliferaKobayasi等[12]。因此，筆者旨在通過比較云耳與其他相似種的形態(tài)學及分子系統(tǒng)學，完善廣西云耳的形態(tài)學特征，明確廣西云耳準確的物種名稱及分類地位，對云耳的栽培育種及地方食用菌品種的保護具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

研究材料為筆者從廣西天峨縣（云耳712：GXMRI_YE1、GXMRI_YE2、GXMRI_YE3、）、南丹縣（黑木 耳 916：GXMRI_ME1、GXMRI_ME2、GXMRI_ME3）、龍州縣（GXMRI_0613、GXMRI_0627）采集的8個木耳屬標本，標本存放于廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院微生物研究所（GXMRI）。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)學研究方法

采用傳統(tǒng)形態(tài)學研究方法對新鮮及干標本進行宏觀形態(tài)及微觀顯微結構的觀察并記錄。5%KOH溶液作為干標本的浮載劑，剛果紅作為染色劑，Melzer試劑檢驗標本是否有淀粉質反應；測量30個成熟孢子的大小，得出所有孢子的長寬平均值，計算擔孢子的Q值。顏色描述的依據是《Color standards and color nomenclature》[20]以及《Methuen handbook of color》[21]。

1.2.2 分子系統(tǒng)學研究方法

1.2.2.1 DNA提取、PCR擴增、測序

取干凈無污染的木耳屬干標本提取總DNA，提取方法依據DNA提取試劑盒SK8224（上海生工生物工程股份有限公司）使用說明。ITS序列的引物為通用引物[22]，擴增反應體系為25 μL，包括1 μL模板，0.5 μL 正 反向引物 ，0.5 μL dNTP（10 mM），2.5 μL Tap Buffer，0.2 μL Tap 酶 ，20 μL ddH2O。PCR擴增反應條件為：95℃預變性3 min，94℃變性60 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃修復延伸10 min，4℃終止反應[23]。PCR產物送至上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結果經驗證后，上傳至GenBank數據庫。

1.2.2.2 數據處理及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

基于NCBI數據庫，將目標序列進行BLAST比對，下載其Ident值高于97%的序列組成矩陣。運用Bio Edit v.7.0.9[24]、CLUSTALX[25]和 PAUP 4.0[26]對 矩陣進行比對和編輯、Modeltest v.3.7[27]計算最適的堿基替換模型，MrBayes v.3.1.2[28]構建系統(tǒng)發(fā)育樹。最終當運行100萬代或分裂頻率的平均標準偏差（Average standard deviation of split frequencies）低于0.01時停止運行，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 云耳形態(tài)學

宏觀形態(tài)（圖1）：子實體新鮮時膠質，不透明，耳狀，偶不規(guī)則，具3～5 mm短小菌柄，邊緣常具淺裂或偶具深裂，最寬處直徑可達5.5 cm，厚0.50～1.46 mm，干后易碎，耳基及周圍半透明（對光），耳緣不透明；不孕面淺黃褐色、深黃褐色，或木棕色（ⅩⅩⅤⅢ11″k），幼時具明顯淺黃色柔毛，老后具黃棕色柔毛，干后淺灰棕色；耳緣不具柔毛，顏色不同，煙褐色、深紅褐色，干后灰褐色；子實層光滑，具皺褶，幼時幾乎與耳緣同色，基部色淡；老后子實層淺橙黃色（4A2），干后中部木棕色至淡黃棕色，邊緣深灰色。

顯微結構：擔孢子臘腸形，無色，薄壁，光滑，具1或2個液泡（圖2），非淀粉質，無嗜藍反應，（3.0～5.5）μm×（7.0～12.0）μm，平均長度 L=10.18 μm，平均寬度W=4.20 μm，長寬比Q=2.42。擔子棒狀，3橫隔，擔孢子梗少見，（25.0～57.0）μm×（2.0～3.5）μm。子實層末端無擬囊狀體。橫切面具髓層，偶不明顯，處于切面中間位置，無結晶體。柔毛單生或簇生，淺黃色，基部稍膨大，厚壁，具窄內腔，頂部鈍圓，偶漸尖，大小為（46.0～99.0）μm ×（3.0～5.0）μm。菌絲具鎖狀聯合，在5%KOH試劑中菌絲寬度為1.5～3.5 μm。

圖1 云耳宏觀形態(tài)

圖2 云耳微觀結構

在外觀形態(tài)學上，云耳與闊葉樹木耳、小孢木耳以及小木耳有很多相似之處，但是仍具有細微的差別（表1）。野生條件下，脆木耳很容易被誤認為是云耳的野生物種，但是脆木耳新鮮時耳片較薄，易碎，呈半透明狀。

2.2 云耳分子系統(tǒng)學

共得到26條ITS序列（表2），18條序列下載于GenBank，其余8條序列是自測序列。經對26條序列進行編輯整理后，矩陣中每條ITS序列堿基數為508個（包含空位）。最適堿基替代模型為TIMef，經過100萬代的運行最終的分裂頻率約為0.009，停止運行。貝葉斯方法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

表1 云耳與相似種的形態(tài)學比較

表2 供試標本信息以及其GenBank登錄號與采集地

圖3 基于ITS運用貝葉斯方法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

運用貝葉斯方法，對26條ITS序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，其中15條序列是公認的黑木耳Auricularia heimuer，2條序列為脆木耳A.fibrillifera，1條序列為外群截形黑耳Exidia truncataFr.。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以明顯看出，基于ITS構建的系統(tǒng)發(fā)育樹將木耳屬序列分為兩個大的分支CladeⅠ和CladeⅡ。其中，0613、0627分布在CladeⅠ中，為脆木耳A.fibrillifera，屬廣西新記錄種。YE1、YE2、YE3、ME1、ME2、ME3聚在CladeⅡ分支上，均為黑木耳。但是采自廣西天峨縣的云耳和南丹縣的黑木耳并沒有具在同一個小的分支上，云耳與中國及俄羅斯的黑木耳關系較近（GroupⅠ），分支支持率為0.70，且分支長相似，系統(tǒng)進化關系較近；而采自南丹的黑木耳標本單獨形成一個小的分支（GroupⅡ）。因此可以確定采自天峨縣和南丹縣的6個標本均屬于黑木耳A.heimuer，而并非是A.auricular或者A.auricularjudae。

3 小結與討論

廣西“百色云耳”具有悠久的栽培歷史，距今已經1000余年。利用經典形態(tài)學研究方法，發(fā)現云耳在形態(tài)學上具有較為獨特的特征，宏觀上，其耳緣顏色、柔毛等與黑木耳不同；微觀上，云耳的孢子、擔子和柔毛均略小于黑木耳。野外采集調查時，脆木耳很容易被誤認為是云耳，因為其子實體顏色十分接近，但新鮮脆木耳質地較薄，采摘容易開裂；脆木耳在光線稍暗的情況下，子實體近白色。在分子系統(tǒng)學方面得到的結果與吳芳研究結果相似[12]。云耳與來自俄羅斯及中國的部分菌株均聚在一個大的組內（GropeⅠ），但與俄羅斯的黑木耳在形態(tài)學上具有明顯的區(qū)別，后者新鮮時具有棕黃色至紅褐色的絨毛，干后黃綠色；擔子和孢子也較云耳略大[29]。另外，黑木耳常規(guī)栽培種黑山A（KM396782）以及在廣西的栽培種916（ME1-3）、云耳712（YE1-3）被分在不同的3個分枝上，由此可以推斷，基于ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹能較好地對現有部分黑木耳品種進行區(qū)分[23]。另外，值得一提的是，AB615232是源于日本的黑木耳標本，在系統(tǒng)樹中也能夠明顯的區(qū)分開來，可以推測出黑木耳種內具有復雜的遺傳多樣性。

綜上所述，雖然在形態(tài)學上云耳與黑木耳存在部分差異，形成了廣西地方特有的木耳栽培品種，但是綜合形態(tài)學及分子系統(tǒng)學的觀點支持將廣西的云耳學名定為黑木耳Auricularia heimuerF.Wu，B.K.Cui﹠Y.C.Dai。另外，由于最初記載的云耳歷史久遠且未有形態(tài)學原始描述，并未獲得野生子實體，故在子實體形態(tài)方面有待于今后進一步補充研究。