廣東省中山地區(qū)漢族精神類疾病患者藥物基因型及代謝表型分布研究*

平軍嬌，高永雙，鄧順順，章 杰，萬 靜，杜寶國，錢 剛

(1.中山市第三人民醫(yī)院a.檢驗(yàn)科；b.藥劑科；c.早期干預(yù)科，廣東中山 528451；2.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，貴州遵義 563099)

藥物是精神分裂癥、雙相情感障礙等重性精神疾病的臨床主要治療方法。目前，重性精神疾病的藥物治療有效率僅為30%～50%，這不僅阻礙了患者的疾病康復(fù)，同時(shí)增加了患者家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。在影響藥物療效的諸多因素中，抗精神病藥物相關(guān)受體效應(yīng)基因表型和肝臟藥物代謝酶基因特征是影響藥物生物學(xué)活性和體內(nèi)代謝速率的關(guān)鍵因素。受體效應(yīng)表型的基因多態(tài)性參與了重性精神疾病發(fā)病過程并部分影響了抗精神病藥物的受體結(jié)合程度。Ⅰ 相代謝和 Ⅱ 相代謝能力的個(gè)體差異性是維持精神病治療藥物有效血藥濃度的基礎(chǔ)條件。既往研究結(jié)果證實(shí)，肝臟Ⅰ相代謝主要由細(xì)胞色素氧化酶(CYP450)和N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(N-acetyltransferase 2，NAT2)承擔(dān)。其中，CYP450酶系及其多種同工酶(CYP2D6，CYP2C19，CYP3A4，CYP3A5和CYP1A2)參與了絕大多數(shù)精神科藥物的代謝過程[2]。細(xì)胞色素氧化酶活性的個(gè)體差異主要受其基因多態(tài)性影響。少量研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ 相代謝中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP glucuronosyl transferase，UGT)酶系家族成員(UGT2B7和UGT2B15)主要參與了丙戊酸鈉、卡馬西平等情感穩(wěn)定劑的代謝過程，其基因突變類型可能與藥物的不良反應(yīng)或中毒有關(guān)[3]。

既往關(guān)于精神疾病患者藥物代謝酶類基因?qū)W研究多存在目標(biāo)基因范圍局限、基因位點(diǎn)缺乏臨床相關(guān)性、疾病研究病種單一等不足，尚缺乏多種精神疾病間基因組學(xué)特征的研究結(jié)果。本研究擬利用基因組學(xué)分析技術(shù)，同時(shí)對(duì)精神類疾病患者進(jìn)行基因組學(xué)(包括8個(gè)藥物代謝基因及5個(gè)藥物效應(yīng)基因)檢測(cè)，分析中山市重性精神疾病中藥物基因型及代謝表型分布特征，分析疾病間的基因表型差異，為臨床重性精神疾病的個(gè)體化治療提供基因組學(xué)研究依據(jù)。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年1月～2019年2月在中山市第三人民醫(yī)院住院患者155例，其中精神分裂癥患者95例，對(duì)其臨床資料進(jìn)行回顧性分析。男性62例，女性33例，平均年齡37.68歲。所有患者均為漢族，且居住于中山地區(qū)，符合《國際疾病分類》第10版(ICD-10)精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除并發(fā)有其他精神障礙患者。該研究患者均已簽署知情同意書，將此精神分裂癥患者設(shè)為研究組A。心境障礙患者30例，對(duì)其臨床資料進(jìn)行回顧性分析。男性19例，女性11例，平均年齡38.45歲。所有患者均為漢族，且居住于中山地區(qū)，符合《國際疾病分類》第10版(ICD-10)心境障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除并發(fā)有其他精神障礙患者。將此心境障礙患者設(shè)為研究組B。精神類疾病患者(排除精神分裂癥和心境障礙患者)30例，對(duì)其臨床資料進(jìn)行回顧性分析。男性16例，女性14例，平均年齡33.40歲，所有患者均為漢族，且居住于中山地區(qū)，此類患者為研究組C。

本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意。

1.2 試劑和儀器 本研究共對(duì)13個(gè)基因的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，包含8個(gè)藥物代謝基因及5個(gè)藥物效應(yīng)基因。本研究采用Agena Bioscience MassARRAY DNA 質(zhì)譜基因分析系統(tǒng)、AB Sciex 3200MD液質(zhì)串聯(lián)(LC/MS/MS)三重四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)、Therom Fisher Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)、飛行時(shí)間質(zhì)譜儀等來進(jìn)行檢測(cè)，儀器分析系統(tǒng)和檢測(cè)由上?？道栳t(yī)學(xué)檢驗(yàn)所提供。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：本研究所用實(shí)驗(yàn)標(biāo)本為口腔拭子，從采樣盒內(nèi)取出口腔拭子套管，小心撕開外包裝，拔掉保護(hù)套，握住手柄，將棉棒頭放入口內(nèi)腮幫處，分別由兩側(cè)上下剮蹭并旋轉(zhuǎn)棉棒10～20次左右，刮取口腔內(nèi)脫落細(xì)胞，將保護(hù)套蓋回。

1.3.2 標(biāo)本DNA提?。菏褂锰旄腄NA提取試劑盒(離心柱型)來提取基因組，具體操作步驟參照試劑說明書。

1.3.3 PCR擴(kuò)增：采用Agena公司全套iPLEX Pro基因分型試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，進(jìn)行45次循環(huán)；最后72℃延伸5 min，4℃保存。

1.3.4 SAP反應(yīng)：PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR反應(yīng)液中每孔加入SAP buffer：0.17 μl，SAP Enzyme：0.3 μl，ddH2O：1.53 μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃40 min，85℃5 min，4 ℃保存。

1.3.5 單堿基延伸反應(yīng)：反應(yīng)體系為純化后PCR產(chǎn)物7 μl，iPLEX緩沖液0.2 μl，iPLEX特異性終止反應(yīng)液0.2 μl，延伸引物0.94 μl，iPLEX酶0.041 μl，ddH2O 0.619 μl共9 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s，共進(jìn)行40次循環(huán)(其中52 ℃退火5 s及80 ℃延伸5 s進(jìn)行5次循環(huán))；最后72 ℃延伸3 min。樣本脫鹽調(diào)節(jié)及點(diǎn)樣到芯片。

1.3.6 質(zhì)譜結(jié)果分析：采用TyperAnalyzer軟件分析基因分型數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間藥物基因型及表型比較用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 藥物基因多態(tài)性檢測(cè)位點(diǎn) 本研究共檢測(cè)8個(gè)藥物代謝基因的多態(tài)性和5個(gè)藥物效應(yīng)基因的多態(tài)性，藥物代謝基因分別為：CYP2D6，CYP1A2，CYP3A4，CYP2C19，CYP3A5，N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(N-acetyltransferase 2，NAT2)，葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶2B7(glucuronosyltransferase，UGT2B7)和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶2B15(glucuronosyltransferase，UGT2B15)。藥物效應(yīng)基因分別為：黑素皮質(zhì)素受體-4(melanocortin-4 receptor，MC4R)，多巴胺D2受體(dopamine D2 receptor，DRD2)，5-羥色胺受體2A(5-hydroxytryptamine，HTR2A)，5-羥色胺受體2C(5-hydroxytryptamine，HTR2C)和他克莫司結(jié)合蛋白(FK506 binding protein 5，F(xiàn)KBP5)。13個(gè)藥物基因多態(tài)性檢測(cè)位點(diǎn)，見表1。

表1 藥物基因多態(tài)性檢測(cè)位點(diǎn)

2.2 精神類藥物基因代謝表型分布 經(jīng)檢測(cè)結(jié)果分析，155例(男性=97例，女性=58例)精神疾病患者5個(gè)藥物基因代謝表型分布頻率見表2。CYP2D6，CYP2C19和NAT2基因中間代謝型頻率最多，其次為廣泛代謝型；CYP3A4基因表型全部為廣泛代謝型；CYP1A2基因只發(fā)現(xiàn)兩個(gè)表型，即超快代謝型和廣泛代謝型，頻率分別為50.3%和49.7%。

表2 藥物基因代謝表型分布頻率[n(%)]

2.3 精神類藥物基因型分布 見表3。經(jīng)檢測(cè)結(jié)果分析，CYP3A5，UGT2B7，UGT2B15和FKBP5基因型中突變純合型頻率最多，其次為突變雜合型，野生純合型頻率最少。MC4R和DRD2基因型中野生純合型出現(xiàn)頻率最高，其次為突變雜合型，突變純合型出現(xiàn)頻率最少；HTR2A基因突變雜合型出現(xiàn)頻率最高，HTR2C基因型在所測(cè)樣本中突變雜合型頻率為99.4%，只出現(xiàn)1例突變純合型。

表3 藥物基因型分布頻率[n(%)]

2.4 組間藥物基因代謝表型差異分析 見表4。本研究入組精神分裂癥患者95例(A組)，心境障礙患者30例(B組)，其他精神類疾病30例(C組)，對(duì)其進(jìn)行藥物代謝基因表型差異性分析。經(jīng)三組間差異性統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)CYP2C19基因慢代謝型和NAT2基因慢代謝型組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002，0.040)。

表4 組間藥物基因代謝表型分析[n(%)]

2.5 組間藥物基因型差異分析 見表5。CYP3A5基因野生純合型，UGT2B15基因突變雜合型，MC4R基因野生純合型和突變雜合型組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02，0.029，0.048，0.049)。

3討論遺傳因素對(duì)抗精神病藥物療效的影響至關(guān)重要，藥物基因組學(xué)隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的日新月異得到快速發(fā)展，目前多種抗精神病藥物添加了藥物基因組學(xué)的信息，逐漸成為指導(dǎo)臨床合理用藥的必要手段和強(qiáng)有力的工具。

由于藥物基因的變異引起藥物在體內(nèi)藥效及代謝過程改變，進(jìn)而引起臨床治療效果改變和產(chǎn)生藥物不良反應(yīng)，本研究綜合國內(nèi)外精神類藥物基因的有關(guān)報(bào)道，對(duì)13個(gè)藥物基因的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。CYP2C19和CYP2D6參與多種抗精神病藥物在體內(nèi)的代謝，其基因具有高度遺傳多態(tài)性[4]。CYP2C19功能缺失型等位基因表現(xiàn)為慢代謝型，會(huì)導(dǎo)致酶活性降低和代謝能力下降，常規(guī)劑量藥物治療出現(xiàn)較高血藥水平，且存在著廣泛的地域和種族差異[5-8]，因此調(diào)查不同人群的CYP2C19基因多態(tài)性的分布特征有助于指導(dǎo)臨床用藥。本研究結(jié)果提示中山地區(qū)精神分裂癥患者中有較多的慢代謝型，在使用經(jīng)CYP2C19基因代謝的藥物時(shí)，應(yīng)結(jié)合患者基因代謝類型和血藥濃度水平調(diào)整藥物劑量。研究發(fā)現(xiàn)CYP2D6是細(xì)胞色素P450家族中唯一不能被誘導(dǎo)的酶，參與了抗精神分裂癥藥和抗抑郁藥在體內(nèi)的代謝[9]。CYP2D6基因在不同國家和地區(qū)中各代謝型的分布比例不同[10-11]，據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)在亞洲人口中50%表現(xiàn)為中間代謝型(IMs)[12]，僅1%左右出現(xiàn)慢代謝型(PMs)，而西方人口中表現(xiàn)出較多的PMs型。本研究結(jié)果提示51.5%的精神類患者在服用經(jīng)CYP2D6代謝的藥物時(shí)存在藥物代謝速率減慢，血藥濃度升高，因此應(yīng)結(jié)合患者的代謝類型調(diào)整藥物劑量。NAT2在肝臟內(nèi)可參與多種藥物的代謝，并可引起肝損害[13]，國內(nèi)對(duì)精神類疾病NAT2基因多態(tài)性的研究鮮見，本研究結(jié)果推測(cè)57.4%的患者在服用經(jīng)NAT2代謝的藥物時(shí)會(huì)出現(xiàn)藥物代謝減慢，藥物濃度升高導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)增加，應(yīng)結(jié)合血藥濃度監(jiān)測(cè)，必要時(shí)更換其他藥物。組間比較發(fā)現(xiàn)NAT2基因慢代謝型有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，心境障礙組有較多的慢代謝型患者，因此心境障礙患者應(yīng)密切觀察臨床治療效果和不良反應(yīng)的發(fā)生。

表5 組間藥物基因型分析[n(%)]

CYP3A是藥物代謝反應(yīng)中主要的限速酶，其中CYP3A5參與了約50%常用藥物的代謝，是CYP3A亞家族中最主要的肝外表達(dá)形式，其活性和表達(dá)主要由單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)所決定，CYP3A5*3(rs776746) 是影響CYP3A5個(gè)體化差異和底物血藥濃度的主要原因[14]，本研究結(jié)果顯示51.6%的突變純合型患者會(huì)發(fā)生藥物代謝減慢，血藥濃度升高導(dǎo)致不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)增加，三組間CYP3A5基因野生純合型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。心境障礙患者中有較多的野生純合型，推測(cè)心境障礙患者在服用經(jīng)CYP3A5代謝的藥物時(shí)藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較小。在已鑒定的多個(gè)細(xì)胞色素P450同工酶中，CYP1A2存在于肝臟，為“增毒”同工酶，研究發(fā)現(xiàn)其基因多態(tài)性與抗精神病藥療效及發(fā)生遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙有關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示CYP1A2基因超快代謝型低于陳柯霖等[16]報(bào)道的68.1%，與美籍非洲精神分裂癥患者(52%)和日本患者(49.7%)接近，提示該多態(tài)性存在地區(qū)和種族差異。

FKBP5基因多態(tài)性與抑郁癥及自殺癥狀有顯著相關(guān)性，增加抑郁癥復(fù)發(fā)及藥物抵抗的風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)測(cè)抑郁癥藥物的治療應(yīng)答率[17]。國內(nèi)關(guān)于MC4R和FKBP5基因多態(tài)性與精神類藥物之間的研究比較鮮見，本研究結(jié)果提示中山地區(qū)3.9%的突變純合型患者發(fā)生體重增加、高脂血癥等不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較高，在臨床治療中應(yīng)密切觀察不良反應(yīng)發(fā)生情況；91.0%的患者FKBP5基因表現(xiàn)為突變型，對(duì)藥物應(yīng)答不佳，可適量增加劑量并結(jié)合血藥濃度觀察臨床療效。既往研究發(fā)現(xiàn)，藥物效應(yīng)基因DRD2基因多態(tài)性與抗精神病藥物療效相關(guān)[18-19]。本研究結(jié)果顯示49%的突變型精神類疾病患者對(duì)利培酮等藥物的應(yīng)答不佳，治療過程中應(yīng)結(jié)合血藥濃度水平調(diào)整藥物劑量。UGT 酶系家族中UGT2B7和UGT2B15參與了丙戊酸鈉、卡馬西平、勞拉西泮、奧沙西和米格列奈等精神類藥物的代謝，UGT2B7基因突變型個(gè)體藥物應(yīng)答較差，可能引起藥物不良反應(yīng)或藥物中毒[3]。本研究結(jié)果顯示94.2%的突變型患者藥物應(yīng)答和效果較差，應(yīng)密切觀察臨床療效和不良反應(yīng)發(fā)生情況；45.8%的突變純合型藥物清除率增加，可能導(dǎo)致療效降低，可根據(jù)臨床實(shí)際反應(yīng)適當(dāng)增加劑量。HTR2A和HTR2C基因多態(tài)性同時(shí)和精神分裂癥發(fā)病易感性以及抗精神病藥物療效聯(lián)系緊密[20]。氯氮平通過拮抗HTR2A受體和HTR2C受體在難治性精神分裂癥的治療中發(fā)揮療效[21]。血漿藥物濃度水平是影響重性精神病治療藥物療效和安全性的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)攜帶有HTR2A基因突變型患者使用抗精神病藥物療效好于野生型患者[20]，本研究結(jié)果提示6.5%的野生純合型患者治療過程中結(jié)合代謝類型和血藥濃度監(jiān)測(cè)，密切觀察臨床療效，必要時(shí)調(diào)整藥物劑量或更換其他藥物。

綜上，本研究通過薈萃分析中山市重性精神疾病中藥物基因型及代謝表型分布特征，以及疾病間的基因表型差異，為臨床重性精神疾病的個(gè)體化治療提供基因組學(xué)研究依據(jù)，今后本課題組將增加藥物基因型與臨床療效方面的研究，將藥物基因組學(xué)檢測(cè)與臨床實(shí)踐密切結(jié)合，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)治療。