慢性心力衰竭患者外周血細胞中線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的表達

李碩 李曉慧 黎百志 嚴(yán)亞琪 董文超 單偉超 劉超 王鵬飛 丁振江王瑞鵑

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院本部心臟內(nèi)科（河北承德067000）

慢性心力衰竭是導(dǎo)致患者死亡的一個非常重要的原因［1-3］，是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的終末階段，形勢尤為嚴(yán)峻。心室重塑、心肌能量代謝障礙、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)等多種機制共同作用引起慢性心力衰竭，其中心肌細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)導(dǎo)致以線粒體為靶點的漸進性細胞改變，誘發(fā)線粒體凋亡通路，進而引發(fā)慢性心力衰竭的病理過程是重要的機制之一［4-5］。

心臟是個高耗能器官，正常的心肌細胞需要不斷地合成ATP 從而提供充足的能量，進而維持心臟正常的細胞活力和泵功能。線粒體占心肌細胞總體積的30%，能夠為心臟提供大約90%的能量，在細胞生命活動中發(fā)揮著舉足輕重的作用。因此，一旦線粒體功能障礙必然會影響心肌細胞的功能［6］。

線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）位于人和小鼠10 號染色體長臂21 區(qū)上，長度為10～25 kb，是一種對DNA 有高親和力的高遷移率（HMG）蛋白，能夠通過與線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的LSP 和HSP 上游的識別位點的特異性結(jié)合來刺激轉(zhuǎn)錄［7］，是調(diào)控mtDNA 拷貝數(shù)和影響線粒體功能的重要轉(zhuǎn)錄因子［8］。小鼠模型中，TFAM 基因敲除導(dǎo)致mtDNA 拷貝數(shù)缺失及線粒體轉(zhuǎn)錄能力下降，進而引起擴張型心肌病。而TFAM 基因過表達能夠改善mtDNA拷貝數(shù)缺失，維持線粒體功能，抑制心肌細胞肥大，間質(zhì)纖維化及心肌凋亡［9］?；谶@些發(fā)現(xiàn)，筆者認為TFAM 可能是慢性心力衰竭患者中線粒體功能障礙的線索。本研究通過利用RT-PCR 技術(shù)分析線粒體功能障礙的外周血細胞TFAM mRNA表達，闡明其與慢性心力衰竭的關(guān)系，評估其臨床應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 連續(xù)納入2017年8月至2018年8月于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科住院的慢性心力衰竭患者63 例作為心衰組，其中男32 例，女31 例。根據(jù)患者既往是否患有冠心病史，分為缺血性心衰組33 例、非缺血性心衰組30 例。并依據(jù)美國紐約心臟病協(xié)會（NYHA）分級標(biāo)準(zhǔn)將心衰患者分為NYHA Ⅱ級8 例、Ⅲ級16 例、Ⅳ級39 例。入選標(biāo)準(zhǔn)：參考2014年中國心力衰竭診斷和治療指南［10］。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有重度瓣膜病、肥厚或限制性心肌病、縮窄性心包炎、心源性休克、急性心肌梗死、嚴(yán)重肝功能不全［丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）或門冬氨酸基轉(zhuǎn)移酶（AST）＞5 倍正常上限］、嚴(yán)重腎功能不全（肌酐＞220 mmol/L）、各種惡性腫瘤、結(jié)締組織病、心肌炎、外傷、線粒體相關(guān)疾病、妊娠、哺乳。同期住院心功能正?；颊?4例作為對照組，其中男44 例，女50 例?；颊呔炇鹬橥鈺?，并且本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 流行病學(xué)與臨床資料收集 記錄研究對象的資料：（1）一般資料：年齡、性別、身高、體質(zhì)量、收縮壓、舒張壓、心率、體質(zhì)量指數(shù)、心功能分級、基礎(chǔ)疾病、既往病史、口服用藥等情況；（2）常規(guī)生化指標(biāo)：白細胞計數(shù)、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、肌酐（Cre）、尿酸、ALT、AST、腦鈉肽（BNP），采用我院生化室檢測值，日立全自動7600 生化分析儀，試劑為中生公司有效期內(nèi)產(chǎn)品；（3）超聲心動圖：由我院超聲科進行檢查，收集左室射血分數(shù)（LVEF）、左室舒張末期前后徑（LVEDD）等數(shù)據(jù)。

1.3 方法

1.3.1 收集外周血樣本 外周血采集：所有入選患者均在入院后于次日晨起靜臥1 h 后，采集2 mL外周靜脈血，用肝素鈉抗凝，混勻后置于2 mL EP管內(nèi)，標(biāo)記后放入實驗室-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 實時RT-PCR檢測兩組外周血TFAM mRNA的表達水平 按照Qiagen 血液基因組RNA 提取試劑盒（QIAamp RNA Blood Mini Kit）說明書操作提取外周血總RNA，UV240 紫外分光光度儀讀取其OD260/OD280 的比值。cDNA 合成嚴(yán)格按照FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒（Fast Quant RT Kit）說明書進行，合成的cDNA 儲存在-20 ℃用于Combasz 480 實時PCR 定量。根據(jù)引物（由生工生物工程股份有限公司提供）設(shè)計的原則，TFAM上游引物：5′-GCATCTGGGTTCTGAGCTTT-3′，下游引物：5′-CCGAGGTGGTTTTCATCTGT-3′。管家基因上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，管家基因下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR 流程：PCR 溶液系統(tǒng)置于熒光PCR 儀行PCR 擴增，反應(yīng)條件：預(yù)熱95 ℃15 min ，變性、退火、延伸反復(fù)45 循環(huán)可擴增得到大量位于兩條引物之間序列的DNA 片段。實驗測得TFAM 的特異性擴增曲線和溶解曲線。得到每個樣本的CT值，分別計算對照組目的基因和管家基因的平均CT 值，以此為參照，依據(jù)公式2-ΔΔCT計算出每個標(biāo)本TFAM mRNA 的表達水平［11］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0 軟件包，計量資料：正態(tài)分布：均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2 組間均數(shù)比較選擇t檢驗。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。偏態(tài)分布：四分位數(shù)表示，選擇秩和檢驗。計數(shù)資料：例（%）表示，率或構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗。兩者間相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)性分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 實驗組和對照組一般資料比較：結(jié)果顯示兩組在性別、高血壓病史、收縮壓、舒張壓、總膽固醇、飲酒史、ALT 方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組TFAM mRNA 表達（1.144±0.565）低于對照組（1.431 ± 0.868），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與非缺血性實驗組（n=30）相比，缺血性實驗組（n=33）年齡偏大［（72.606 ± 10.97）vs.（60.867±12.54），P＜0.05］、BNP較低［（1 184.57± 900.52）vs.（1 416.16 ± 852.662），P＜0.05）］、LVEF 較高［（46.12 ± 11.185）vs.（43.30 ± 15.257），P＜0.05］，TFAM mRNA 表達較高［（1.242 ± 0.526）vs.（1.036±0.594），P＜0.05］。見表1。

2.2 不同心功能NYHA分級組TFAM mRNA、BNP水平 不同心功能NYHA 分級組患者外周血BNP、TFAM mRNA 水平比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），外周血BNP 水平隨著NYHA 分級升高而升高，TFAM mRNA 表達隨著NYHA 分級升高而降低，見表2。

表1 各組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data in groups ±s

表1 各組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data in groups ±s

注：與非缺血性心衰組相比，*P ＜0.05；與對照組相比，#P ＜0.05

臨床資料年齡（歲）男性［例（%）］高血壓?。劾?）］糖尿?。劾?）］吸煙史［例（%）］飲酒史［例（%）］體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）TC（mmol/L）TG（mmol/L）Cre（mmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）BNP（pg/mL）TFAMmRNA LVEF（%）LVEDD（mm）心衰組（n=63）63.36±9.51 32（50.79）38（60.32）27（42.86）#10（15.87）#15（23.81）23.28±3.587#133.23±23.06 82.75±15.27 3.86±1.055 1.34±0.682#98.58±52.194#43.97±69.666 40.259±72.351#1 294.85±878.755#1.144±0.565#44.778±13.246#57.762±12.721#缺血性心衰組（n=33）72.606±10.97*16（48.48）20（60.61）16（48.48）5（15.15）8（24.24）22.448±2.69 136.06±21.68 81.54±13.299 3.842±0.894 1.396±0.653 103.55±50.83 33.936±18.165 26.936±17.897 1 184.57±900.52*1.242±0.526*46.12±11.185*55.818±13.987非缺血性心衰組（n=30）60.867±12.54 16（53.33）18（60.00）11（36.67）5（16.67）7（23.33）24.196±4.220 130.13±24.46 84.06±17.314 3.874±1.224 1.281±0.721 93.11±53.98 55.073±98.850 54.913±102.048 1 416.16±852.662 1.036±0.594 43.30±15.257 59.900±11.002對照組（n=94）61.74±7.31 44（46.8）54（57.45）10（10.64）28（29.79）24（25.53）25.33±3.223 136.83±21.33 83.40±11.17 4.26±0.896 2.03±1.508 63.82±14.462 31.26±14.261 22.991±8.974 37.77±28.25 1.431±0.868 63.440±5.192 49.223±4.494

表2 心衰患者不同心功能分級組TFAM mRNA、BNP 水平Tab.2 TFAM mRNA and BNP levels in heart failure patients with different cardiac function grading groups ±s

表2 心衰患者不同心功能分級組TFAM mRNA、BNP 水平Tab.2 TFAM mRNA and BNP levels in heart failure patients with different cardiac function grading groups ±s

注：與NYHA 分級Ⅱ級組比較，*P＜0.05；與NYHA 分級Ⅲ級組比較，△P＜0.05

NYHA 分級ⅡⅢⅣ例數(shù)8 16 39 BNP 155.66±25.57 720.81±319.72*1 764.04±762.60△TFAM mRNA 1.91±0.178 1.48±0214*0.849±0.486△

2.3 不同LVEF、LVEDD 分組與TFAM mRNA水平 分別按LVEF 和LVEDD 進行分組分析，研究表明LVEF ≤40%組外周血TFAM mRNA 水平低于LVEF＞40%組（P＜0.05）。LVEDD 50 ～70 mm組外周血TFAM mRNA 水平低于LVEDD ＜50 mm組（P＜0.05）；LVEDD ＞70 mm 組外周血TFAM mRNA 水平低于LVEDD ＜50 mm 組及LVEDD 50～70 mm 組（P＜0.05），見表3。

2.4 TFAM mRNA 水平與不同變量的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示TFAM mRNA 水平與LVEF 呈正相關(guān)（r=0.429，P＜0.001），與LVEDD、BNP、糖尿病呈負相關(guān)（r=-0.277、-0.242、-0.173，P＜0.05）。見表4。

3 討論

慢性心力衰竭患者發(fā)病率呈逐年上升趨勢，是當(dāng)今臨床研究中重要的課題之一［10］。近年來HUANG 等［12］研究表明，外周血mtDNA 拷貝數(shù)與慢性心力衰竭呈負相關(guān)，外周血mtDNA 拷貝數(shù)越低，慢性心力衰竭患者心功能越差。明確了mtDNA 與慢性心力衰竭之間具有相關(guān)性。但是TFAM mRNA 在慢性心力衰竭中的表達及作用尚未明確。本研究旨在通過橫斷面分析，探討慢性心力衰竭患者外周血TFAM mRNA 的表達，評估其臨床價值。結(jié)果顯示與對照組相比，慢性心力衰竭患者外周血TFAM mRNA 的表達水平降低。同時隨著NHYA 分級升高，外周血TFAM mRNA 表達逐漸降低。

表3 心衰患者不同LVEF、LVEDD 分組TFAM mRNA 水平Tab.3 TFAM mRNA level in different LVEF and LVEDD groups of heart failure patients ±s

表3 心衰患者不同LVEF、LVEDD 分組TFAM mRNA 水平Tab.3 TFAM mRNA level in different LVEF and LVEDD groups of heart failure patients ±s

分組LVEF（%）＞40≤40 LVEDD（mm）＜50 50 ～70＞70例數(shù)TFAM mRNA 40 23 1.389±0.434 0.717±0.514*15 39 9 1.737±0.250 1.011±0.507△0.730±0.444#

表4 TFAM mRNA 水平與不同變量的相關(guān)性分析Tab.4 Analysis of correlation between TFAM mRNA level and different variables

TFAM 在細胞核內(nèi)產(chǎn)生，被轉(zhuǎn)移進入線粒體基質(zhì)，通過與mtDNA D 環(huán)內(nèi)的啟動子區(qū)結(jié)合而激活線粒體轉(zhuǎn)錄。在調(diào)控mtDNA 穩(wěn)定性、維持其完整性中起著關(guān)鍵性作用［13-15］。近年來，已有研究報道TFAM 作為線粒體核蛋白的主要蛋白，能夠保護線粒體免遭損傷，不僅因為大量存在的TFAM能夠包繞mtDNA 形成環(huán)狀球體，并能將數(shù)個球體壓縮形成類核從而減少ROS 的產(chǎn)生［16］，而且進入線粒體內(nèi)的TFAM 還可以刺激抗氧化酶的產(chǎn)生，如谷胱甘肽過氧化物酶［17］，同時還可以抑制鈣離子通道，減少細胞內(nèi)鈣內(nèi)流［18］。TFAM 除了上述作用外，還參與多種疾病，如線粒體腦病、癌癥等。有較多關(guān)于TFAM 表達升高或降低參與這些疾病中的報道。NISHIO 等［19］研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌細胞由于TFAM 與mtDNA 啟動子結(jié)合活性的降低，導(dǎo)致線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激增加，從而使TFAM 表達下降。

本研究結(jié)果顯示慢性心力衰竭患者外周血TFAM mRNA 的表達降低，可能因為慢性心力衰竭中，線粒體內(nèi)通過電子傳遞鏈產(chǎn)生的ROS 增多，其能夠通過攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和mtDNA，導(dǎo)致細胞功能障礙和/或死亡［20-21］，從而進一步導(dǎo)致ROS 產(chǎn)生增加并形成mtDNA 損傷的惡性循環(huán)。研究［14，22-23］結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFAM 過表達能夠改善mtDNA 拷貝數(shù)缺失。因此，在心力衰竭初期，TFAM通過補償機制過量產(chǎn)生調(diào)控mtDNA 拷貝數(shù)，維持mtDNA 的完整性和穩(wěn)定性，這些反過來又有助于減少氧化應(yīng)激的產(chǎn)生［14］。但隨著心力衰竭程度逐漸加重大量產(chǎn)生ROS時，反而導(dǎo)致TFAM表達降低［24］。因此，慢性心力衰竭時TFAM mRNA表達下降。這一結(jié)果與心梗后心力衰竭小鼠模型中的研究結(jié)果相一致［25］。

此外，研究發(fā)現(xiàn)缺血性心肌細胞中TFAM表達水平下降，這與筆者既往所做的研究結(jié)論一致［26-27］。然而本研究結(jié)果顯示，與非缺血性實驗組相比，缺血性實驗組TFAM mRNA 表達較高，可能因為缺血性實驗組年齡偏大、BNP 較低、LVEF 較高，因此與非缺血性實驗組相比，缺血性實驗組中患者心功能嚴(yán)重程度較輕，從而有可能導(dǎo)致缺血性實驗組中TFAM mRNA 表達較高。

端粒缺陷小鼠線粒體生物合成受損，包括mtDNA 含量下降，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如左室直徑增加、左室壁變薄、部分縮短減少。KNEZ等［28］的研究表明外周血mtDNA 含量與心臟結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)，能夠作為左室直徑及體積重要預(yù)測因子。TFAM 作為mtDNA 的調(diào)控因子，其與心力衰竭中心臟結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)性研究已有報道。研究［29-30］顯示在組織特異性TFAM 敲除小鼠中，mtDNA 耗盡后呼吸鏈功能下降導(dǎo)致線粒體心肌病，其特點是左室擴張和心肌重量增加。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著LVEF 減低、LVEDD 增大，TFAM mRNA 含量逐漸減少，TFAM mRNA 水平與LVEF 呈正相關(guān)，與LVEDD 呈負相關(guān)。因此，本研究發(fā)現(xiàn)，在一定程度上能夠說明TFAM 與左室重構(gòu)有聯(lián)系［23］。值得注意的是，CHENG 等［31］研究發(fā)現(xiàn)中年時某些危險因素的存在，包括高血壓和糖尿病，也與左室結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。因此，闡明TFAM 在左室重構(gòu)和功能障礙進展到癥狀性心力衰竭中的作用需要進一步的研究。

BNP 是心肌細胞分泌的一種激素［32］。BNP 水平與心力衰竭嚴(yán)重程度相關(guān)，是整個心力衰竭階段的預(yù)測因素［33］。本研究結(jié)果表明BNP 與TFAM mRNA 呈負相關(guān)，因此通過聯(lián)合檢測BNP、TFAM mRNA 水平能夠更加準(zhǔn)確地診斷及評估心力衰竭，為臨床醫(yī)師提供更全面的診療信息。

本研究的局限性在于：本研究中樣本量偏小，使檢驗效能減低。本研究是一個橫斷面研究，雖然本文的數(shù)據(jù)表明慢性心力衰竭患者外周血TFAM mRNA 表達下降，但是是由于外周血TFAM mRNA 表達下降導(dǎo)致慢性心力衰竭，還是慢性心力衰竭引起患者外周血TFAM mRNA 表達下降，目前尚未見明顯闡述，并且本研究對于藥物治療后沒有進行進一步研究，針對治療后外周血TFAM mRNA 表達是否存在變化，需要進行深入研究。

綜上所述，在慢性心力衰竭進展過程中，外周血TFAM mRNA 表達進行性下降，TFAM 在各種病因引起的心肌的病理變化中起著重要的作用，可能成為慢性心力衰竭的新型標(biāo)志物及治療的靶點。但慢性心力衰竭和TFAM 之間的因果關(guān)系還需進一步研究。