二肽基肽酶-Ⅳ抑制劑通過激活ERK1/2和NF-κB信號通路促進2型糖尿病小鼠主動脈血管鈣化

王 征，伍成文，陳 豪，施 森，曾 宏，劉 勇

在全球范圍內(nèi)，糖尿病患者人數(shù)呈快速增長趨勢，其中伴有心血管疾病的糖尿病患者死亡率風(fēng)險是正常人群的1.7倍[1]。糖尿病患者血管中普遍存在鈣化情況，而血管鈣化是引起心血管高發(fā)病率與死亡率的重要原因[2]。伴有血管鈣化的糖尿病患者病情復(fù)雜，引發(fā)的并發(fā)癥種類多，治療難度大，因而對于糖尿病患者采取血管鈣化預(yù)防及相關(guān)作用機制的研究十分重要。二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)是一種腺苷脫氨酶結(jié)合蛋白，能參與胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)和抑胃肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP)的降解，從而維持人體血糖穩(wěn)定，在糖尿病的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[3]。Choi等[4]研究顯示，在給予糖尿病小鼠DPP-4抑制劑干預(yù)后，小鼠體內(nèi)血糖含量明顯降低，同時其血管鈣化程度也顯著減輕，提示抑制DPP-4能有效改善糖尿病小鼠血管鈣化程度。Yang等[5]研究證實血管鈣化程度與細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)通路的激活相關(guān)，而Song等[6]認(rèn)為kappa基因相結(jié)合的核因子(nuclear factor-kappa gene binding，NF-κB)信號通路參與血管鈣化的全過程。但是，在糖尿病中，通過抑制DPP-4改善的主動脈血管鈣化是否與激活ERK1/2與NF-κB信號通路相關(guān)尚且未知。本研究在建立小鼠2型糖尿病模型后，通過對比研究DPP-4調(diào)控糖尿病小鼠主動脈血管鈣化與ERK1/2、NF-κB信號通路的關(guān)系，旨在為臨床預(yù)防及治療糖尿病主動脈鈣化提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購自北京維通利華生物科技有限公司，動物合格證：SYXK(京)2016-0038。動物適應(yīng)環(huán)境3 d后，直接腹腔注射鏈脲霉素(STZ)溶液(150 mg/kg)，3 d后尾靜脈取血測量血糖，選擇血糖濃度超過16.7 mmol/L造模成功的糖尿病小鼠進行隨機分組，分為糖尿病組：糖尿病小鼠+高糖高脂飼料；西格列汀組：糖尿病小鼠+高糖高脂飼料+西格列汀飲食[高糖高脂飼料混合0.3%西格列汀，劑量為200 mg/(kg·d)]；PD98059組：糖尿病小鼠+高糖高脂飼料+ERK抑制劑[腹腔注射PD98059，10 mg/(kg·d)]；BAY117082組：糖尿病小鼠+高糖高脂飼料+NF-κB抑制劑(腹腔注射BAY117082，5 mg/kg，每周3次)；PD+BAY組：糖尿病小鼠+高糖高脂飼料+ERK與NF-κB抑制劑[腹腔注射PD98059，10 mg/(kg·d)；腹腔注射BAY117082，5 mg/kg，每周3次]。選擇未進行STZ溶液腹腔注射的小鼠作為對照組：非糖尿病小鼠+高糖高脂飼料。每組6只，持續(xù)喂養(yǎng)4周。

1.1.2 主要試劑與儀器 4%多聚甲醛(谷歌生物科技有限公司)；水合氯醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；品紅溶液(美國AMRESCO公司)；辣根過氧化物酶、BCA蛋白定量試劑盒、AB顯影液、ERK/p-ERK/NF-κB抗體(美國Cell Signaling公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 血糖、血清因子含量測定 直接摘取小鼠眼球進行取血，一部分直接用于血糖檢測；另一部分，4 ℃靜置2 h后離心10 min，3 000 r/min，移取血清，留作用于測定血清中DPP-4濃度。

1.2.2 主動脈鈣離子含量測定 分離得到小鼠腹主動脈血管后，按照鈣離子測定試劑盒操作說明書操作。

1.2.3 主動脈Von Kossa鈣化染色 分離小鼠腹主動脈血管，4%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋、切片、脫蠟、酒精脫水后浸泡于5%硫代硫酸鈉溶液中，強陽光下光照射1 h，蒸餾水沖洗3次后加入2.5%濃度的硫代硫酸鈉溶液反應(yīng)5 min進行定影，依次進行中性品紅復(fù)染3 min、脫水、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 免疫組化測定 將組織進行石蠟包埋后切片，進行脫蠟處理，緩沖液清洗2次(每次5 min)，滴加一抗液體，依次孵育ERK/NF-κB，37 ℃2 h，緩沖液重復(fù)沖洗2次，滴加PAE增強子，室溫孵育20 min，緩沖液重復(fù)沖洗2次后孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育0.5 h(避光)，滴加DAB顯色，自來水反復(fù)沖洗后復(fù)染、脫水、封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 Westerrn blot實驗測定 將組織用手術(shù)剪盡量剪碎后，加入液氮進行研磨，加入RIPA裂解液提取蛋白。選用BCA試劑盒繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。依次進行加樣，接通電源后，經(jīng)過分離膠與濃縮膠的分離作用后，進行聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST緩沖液沖洗3次后，依次加入ERK/p-ERK/NF-κB一抗，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液沖洗3次，依次常溫孵育二抗2 h，TBST緩沖液沖洗后，加入顯影液，應(yīng)用Image J軟件進行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量測定結(jié)果 從第1到第4周，各組小鼠的體質(zhì)量均呈增加趨勢；與對照組比較，糖尿病組小鼠體質(zhì)量增加差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與糖尿病組比較，其他治療組小鼠體質(zhì)量增加差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。圖1。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量測定結(jié)果

2.2 各組小鼠血糖濃度測定結(jié)果 從第1到第4周，與對照組小鼠比較，糖尿病組小鼠血糖濃度顯著升高(P<0.05)；與糖尿病組比較，予以不同抑制劑及西格列汀組小鼠血糖濃度明顯降低(P<0.05)。圖2。

與對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，#P<0.05圖2 各組小鼠血糖測定結(jié)果

2.3 各組小鼠主動脈鈣離子濃度測定結(jié)果 與對照組比較，其他組小鼠主動脈鈣離子濃度顯著增加(P<0.05)；與糖尿病組比較，予以不同抑制劑及西格列汀組小鼠主動脈鈣離子濃度顯著降低(P<0.05)。圖3。

與對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，#P<0.05圖3 各組小鼠主動脈鈣離子濃度測定結(jié)果

2.4 小鼠主動脈血管Von Kossa鈣化染色結(jié)果 對照組與西格列汀組小鼠血管內(nèi)無鈣化的黑色沉積；糖尿病組小鼠主動脈血管內(nèi)膜鈣化的黑色非常明顯；PD+BAY組血管內(nèi)黑色沉積明顯少于PD98059組及BAY117082組(圖4)。與對照組比較，糖尿病組主動脈鈣化細胞占比明顯升高(P<0.05)；與糖尿病組比較，西格列汀組及各抑制劑組主動脈鈣化細胞占比明顯降低(P<0.05)。圖5。

2.5 ELISA試劑盒測定血清DPP-4濃度結(jié)果 與對照組比較，糖尿病組血清DPP-4濃度升高(P<0.05)；與糖尿病組比較，西格列汀組及各抑制劑組血清DPP-4濃度降低(P<0.05)。圖6。

圖4 小鼠主動脈血管Von Kossa鈣化染色結(jié)果(×100倍)

與對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，#P<0.05圖5 各組小鼠主動脈鈣化細胞占比比較

與對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，#P<0.05圖6 ELISA試劑盒測定血清DPP-4濃度結(jié)果

2.6 免疫組化測定各組小鼠血管組織ERK和NF-κB蛋白表達結(jié)果 與對照組比較，糖尿病組血管ERK及NF-κB蛋白表達量均明顯上升(P<0.05)。與糖尿病組比較，西格列汀組及各抑制劑組血管ERK及NF-κB蛋白表達量均明顯下降(P<0.05)。圖7和圖8。

2.7 Western blot 實驗檢測結(jié)果 各組小鼠ERK蛋白表達量差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，糖尿病組小鼠p-ERK/ERK比值及NF-κB、OPG、RUNX2、BMP2蛋白表達量均明顯升高(P<0.05)。與糖尿病組比較，西格列汀組小鼠p-ERK/ERK比值及NF-κB、OPG、RUNX2、BMP2蛋白表達量均明顯降低(P<0.05)；PD98059組小鼠p-ERK/ERK比值及RUNX2、BMP2蛋白表達量均明顯降低(P<0.05)；BAY117082組小鼠NF-κB、RUNX2、BMP2蛋白表達量均明顯降低(P<0.05)；PD+BAY組小鼠NF-κB、OPG、RUNX2、BMP2蛋白表達量均明顯降低(P<0.05)。圖9。

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與糖尿病組比較，#P<0.05圖7 各組小鼠血管組織ERK蛋白表達情況(×100)

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與糖尿病組比較，#P<0.05圖8 各組小鼠血管組織NF-κB蛋白表達情況(×100)

A：對照組；B：糖尿病組；C：西格列汀組；D：PD98059組；E：BAY117082組；F：PD+BAY組。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與糖尿病組比較，#P<0.05圖9 Western blot實驗結(jié)果

3 討論

研究指出，糖尿病易引起動脈粥樣硬化，血管纖維減小，彈性減弱，造成動脈硬化，動脈壁上鈣鹽過量沉積，最后以動脈鈣化的病理形式呈現(xiàn)[7]。而糖尿病患者在出現(xiàn)動脈鈣化后，其并發(fā)心肌梗死、心源性猝死等急性心血管事件的風(fēng)險將顯著增加[8]。因此，對于糖尿病患者采取血管鈣化預(yù)防及相關(guān)作用機制的研究十分重要。DPP-4是T細胞表面活化抗原CD26，可與腺苷脫氨酶結(jié)合，直接干擾GLP-1和GIP活性，影響體內(nèi)血糖代謝穩(wěn)定[9]。體內(nèi)血糖升高，小腸黏膜細胞分泌GLP-1與GIP刺激胰腺中β細胞釋放胰島素，抑制體內(nèi)胰高血糖素分泌，抑制肝糖元分解，提高機體對胰島素的敏感性，達到降低血糖的作用[10]。西格列汀是新型的有效抗糖尿病藥物，可直接作用于DPP-4分子，通過升高GLP-1活性與抑制GLP-1分解以達到抑制DPP-4活性效果[11]。有研究者提出，西格列汀在通過提高胰島素細胞活性而起到降低血糖作用的同時，直接干擾甘油三酯與膽固醇的生成與分泌，起到降低血脂的作用[12]。西格列汀除控制血液中血糖血脂，還可直接對組織器官具有保護作用：可直接保護受損的心肌及出現(xiàn)動脈粥樣化后的血管[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠比較，糖尿病組小鼠血清中DPP-4濃度顯著升高，西格列汀藥物治療后，小鼠體內(nèi)DPP-4濃度顯著降低，其血糖濃度及主動脈血管鈣化程度也明顯減輕，提示西格列汀能通過抑制DPP-4改善糖尿病小鼠主動脈血管鈣化程度。

有研究指出糖尿病患者的體內(nèi)存在明顯炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)與血管鈣化密切相關(guān)，炎性因子可調(diào)控血管平滑肌細胞的成骨性分化，促進動脈粥樣化血管出現(xiàn)鈣化情況[14-15]。NF-κB信號通路是機體炎癥反應(yīng)的必經(jīng)之路，糖尿病并發(fā)炎癥反應(yīng)時，NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，可通過IκBs的降解而被活化，活化后的NF-κB進入細胞核，啟動基因DNA，通過增加OPG及RUNX2含量使骨骼破骨細胞活性不斷增加，機體內(nèi)血管鈣化嚴(yán)重、骨量丟失凸顯，出現(xiàn)炎癥型的軟化與發(fā)生硬化的“軟組織”，進而導(dǎo)致動脈粥樣硬化型的動脈血管鈣化[16-17]。在本研究中，給予小鼠西格列汀，其NF-κB、OPG及RUNX2蛋白表達量降低，血糖含量及血管鈣化程度均降低，其作用效果與給予NF-κB抑制劑后效果一致，說明DPP-4對血糖及血管鈣化的調(diào)節(jié)作用是通過激活NF-κB信號通路完成的。

有學(xué)者猜測，血管鈣化可能與ERK1/2通路相關(guān)[18]。正常情況下，機體中主要為ERK的形式，當(dāng)受到外界刺激時，發(fā)生磷酸化反應(yīng)，ERK主要以p-ERK的形式出現(xiàn)，將信息從細胞表面?zhèn)鬟f至細胞核內(nèi)，啟動基因的調(diào)控[19]。有研究者證實，ERK1/2通路的磷酸化水平被降低后，內(nèi)皮細胞的鈣化情況可明顯減少[20]。在本研究中，給予小鼠西格列汀干預(yù)后，小鼠p-ERK/ERK比值明顯降低，其血管鈣化程度也相應(yīng)減輕，與給予ERK抑制劑后效果一致，說明DPP-4對血糖及血管鈣化的調(diào)節(jié)作用是通過ERK1/2信號通路介導(dǎo)的。

綜上所述，糖尿病小鼠體內(nèi)DPP-4含量明顯增多，從而激活ERK1/2與NF-κB信號通路，發(fā)揮對主動脈血管鈣化的調(diào)節(jié)作用。但是，如何確定DPP-4激活的ERK1/2與NF-κB信號通路是上下游關(guān)系還是平行關(guān)系，仍需后續(xù)研究作進一步探討。