轉(zhuǎn)錄因子ZBTB18對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

田 力，劉 波，彭朝勝，夏 菁，呂貫廷

結(jié)直腸癌是目前世界上常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤之一，每年大約有50萬(wàn)患者死于結(jié)直腸癌[1-2]。在我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤中，結(jié)直腸癌死亡率在男性中居第五位，女性中居第六位[3]。隨著我國(guó)居民飲食和生活習(xí)慣的改變，近二十年來(lái)結(jié)直腸癌的發(fā)病率在逐漸升高[4]。肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌主要的死亡原因之一[2]，約20%的結(jié)直腸癌患者在確診的同時(shí)發(fā)現(xiàn)有肝轉(zhuǎn)移，40%的結(jié)直腸癌患者在確診后一段時(shí)間后出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，如不及時(shí)治療，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者生存5～10個(gè)月的比例為50%，2年生存率僅為3%[5]，由此可見(jiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移是控制結(jié)直腸癌的關(guān)鍵。

ZBTB18(又被稱(chēng)為ZNF238、RP58、TAZ-1和C2H2-171)是一種含有C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白，可抑制腦細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的基因表達(dá)，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，該基因的突變會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常[6-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，ZBTB18在腦瘤中的高表達(dá)可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，具有腫瘤抑制因子的作用[9-10]。

然而ZBTB18在結(jié)腸癌中的作用尚不明確。為了研究ZBTB18是否在結(jié)直腸癌中發(fā)揮腫瘤抑制的功能，我們從NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載腫瘤基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)ZBTB18在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，并在具有不同轉(zhuǎn)移水平的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合Transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)分析ZBTB18在結(jié)直腸癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料 從NCBI GEO(Gene Expression Omnibus)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中下載人基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE1035129[11]。該數(shù)據(jù)集包括了65個(gè)乳腺癌組織及10個(gè)對(duì)照組織、57個(gè)結(jié)直腸癌組織及12個(gè)對(duì)照組織、60個(gè)非小細(xì)胞肺癌組織及9個(gè)對(duì)照組織和60個(gè)前列腺癌組織及7個(gè)對(duì)照組織，以上樣本使用Affymetrix HT-U133plus-2-PM芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)進(jìn)行檢測(cè)。我們從GSE1035129數(shù)據(jù)中，收集結(jié)直腸癌樣本中ZBTB18的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 細(xì)胞系 結(jié)直腸癌細(xì)胞系DLD1、HCT116、HCC2998、SW480、HCT115、KM12、HT29、COLO205和SW620購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心或美國(guó)全球生物資源中心。采用含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3 ZBTB18短發(fā)夾RNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 通過(guò)Ambion網(wǎng)站，針對(duì)ZBTB18 mRNA序列(NM_205768)設(shè)計(jì)了3組短發(fā)夾RNA(short-hairpin RNA，shRNA)，以便從中篩選得到最優(yōu)的序列(表1)。把shRNA-F(Foward)和shRNA-R(Reverse)等量混合后，置于沸水中，讓其緩慢降至室溫進(jìn)行復(fù)性，短暫離心后置于4 ℃保存；將pLKO.1-puro慢病毒載體用限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoRI進(jìn)行酶切及膠回收；把復(fù)性的shRNA雙鏈與酶切處理的pKLO.1-puro質(zhì)粒進(jìn)行連接，連接反應(yīng)用DNA ligation kit(6022Q，Takara)進(jìn)行，具體操作參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。連接成功的質(zhì)粒進(jìn)行Sanger測(cè)序鑒定并制備慢病毒。

表1 ZBTB18 shRNA核酸序列

1.4 熒光定量PCR檢測(cè) 利用SYBR Green PCR Master Mix(4309155，Applied Biosystems)通過(guò)ABI 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems,Waltham,MA,USA)來(lái)進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)引物見(jiàn)表2。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，陰性對(duì)照中cDNA模板以三蒸水代替。采用ΔΔCt法作相對(duì)定量，計(jì)算出目的基因在不同細(xì)胞中表達(dá)量的相對(duì)比率。其中Ct值指的是目的基因的量達(dá)到域值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，因此Ct值越大則模板量越小。相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算根據(jù)下列公式：Ratio=2-ΔΔCt=2-[ΔCt(sample)-ΔCt(control)]。其中ΔCt=Ct(ZBTB18)-Ct(GAPDH)，以此除去起始模板量所引起的差異。

表2 熒光定量PCR檢測(cè)引物

1.5 Transwell細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn) 用4 ℃預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1 mg/mL，在Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板的chamber上室底部中央垂直加入100 μL稀釋后的Matrigel，37 ℃溫育30 min使其成膠狀；把細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整濃度為2×105/mL；在下室加入600～800 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，上室加入200 μL細(xì)胞懸液，繼續(xù)在37 ℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)12 h；取出chamber，吸干上室液體，用甲醇室溫固定30 min；加入約800 μL蘇木精染液,室溫染色30 min；取出chamber，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞；小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹(shù)膠封片；顯微鏡下取9個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)不需鋪Matrigel，其他步驟相同。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行處理，基因在結(jié)直腸癌組織和正常對(duì)照組織中的差異表達(dá)使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中ZBTB18表達(dá)數(shù)據(jù)分析 通過(guò)對(duì)NCBI GEO(Gene Expression Omnibus)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)直腸癌樣本表達(dá)芯片數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)ZBTB18在結(jié)直腸癌組織樣本中的表達(dá)水平顯著高于正常組織(P=0.000 99,圖1A)。進(jìn)一步分析ZBTB18在結(jié)直腸癌中的表達(dá)量，挑選了9種不同的結(jié)直腸癌細(xì)胞系(表3)，其中7種為原發(fā)性結(jié)直腸癌細(xì)胞系，2種為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌細(xì)胞系。用定量PCR檢測(cè)不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系中ZBTB18的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，ZBTB18的表達(dá)水平高于原發(fā)性結(jié)直腸癌細(xì)胞，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021 5，圖1B)，提示ZBTB18與結(jié)直腸細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力正相關(guān)。

圖1 ZBTB18結(jié)直腸癌組織及不同的腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

細(xì)胞系分化情況DLD1原發(fā)性腸癌HCT116分化差的原發(fā)性腸癌HCC2998分化較好的原發(fā)性腸癌SW480原發(fā)性腺癌HCT15初中度分化的腸癌KM12中度分化的腸癌HT29分化差的原發(fā)性腸癌COLO205轉(zhuǎn)移的腸腺癌SW620淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腸腺癌

2.2 shRNA對(duì)ZBTB18的沉默 成功構(gòu)建了3組針對(duì)ZBTB18的shRNA質(zhì)粒，利用慢病毒包轉(zhuǎn)質(zhì)粒感染HT29細(xì)胞，嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定干擾ZBTB18表達(dá)的細(xì)胞系，利用定量PCR及半定量PCR檢測(cè)設(shè)計(jì)的3組shRNA對(duì)ZBTB18表達(dá)的影響。結(jié)果表明，3組shRNA都顯著降低了ZBTB18的表達(dá)，尤其shRNA1與shRNA3的影響更加明顯(圖2)。

A:定量PCR檢測(cè)shRNA對(duì)ZBTB18的沉默效果；B:半定量PCR檢測(cè)shRNA對(duì)ZBTB18的沉默效果圖2 shRNA對(duì)ZBTB18表達(dá)的沉默效果

2.3 ZBTB18沉默后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響 利用Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)pLKO.1-ZBTB18-shRNA3穩(wěn)轉(zhuǎn)的HT29細(xì)胞的遷移和侵襲能力進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，當(dāng)ZBTB18沉默后，HT29細(xì)胞的遷移和侵襲有顯著的降低(P<0.05，圖3)。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是涉及多基因變化的一系列復(fù)雜過(guò)程，包括腫瘤從原發(fā)部位脫落，進(jìn)入血管淋巴，粘附于內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)血管生成對(duì)抗宿主，在遠(yuǎn)端部位增殖形成轉(zhuǎn)移灶，整個(gè)過(guò)程受到許多基因的調(diào)控。與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因可以分為腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因及腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，目前認(rèn)為，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的激活或腫瘤轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)基因的失活均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞性狀發(fā)生轉(zhuǎn)變而發(fā)生轉(zhuǎn)移[12-13]。研究表明，至少有10余種癌基因可誘發(fā)或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，如MYC[14]、KRAS[15]、BRAF[16]、FES[17]、FMS[18]、WWOX[19]等，相對(duì)的轉(zhuǎn)移抑制基因主要包括參與細(xì)胞生理活動(dòng)調(diào)節(jié)的NM23[20]、PTEN[21]、TIMP1[22]等。

ZBTB18蛋白在正常腦組織中高表達(dá)，但在腦瘤呈低表達(dá)，增加ZBTB18的表達(dá)水平則可抑制腫瘤的生長(zhǎng)[10]。在腦膠質(zhì)瘤中，ZBTB18基因的啟動(dòng)子被異常甲基化，導(dǎo)致其表達(dá)沉默；ZBTB18的缺失可調(diào)控預(yù)后不良相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤出現(xiàn)侵襲表型[9]。目前有關(guān)ZBTB18的研究主要集中于腦發(fā)育方面。ZBTB18基因的功能缺失性突變(錯(cuò)義突變和拷貝數(shù)缺失)可導(dǎo)致腦新皮層和海馬發(fā)育不良、皮層成熟神經(jīng)元數(shù)量減少以及由于皮質(zhì)板內(nèi)神經(jīng)元的異常遷移而導(dǎo)致的層狀組織缺陷為主要特征的1q43q44微缺失綜合征[7-8,23]。

然而ZBTB18基因在其他組織和腫瘤中的功能研究尚未明確。我們通過(guò)對(duì)NCBI GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)直腸癌樣本表達(dá)芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，ZBTB18在結(jié)直腸癌樣本中高表達(dá)，與正常對(duì)照樣本相比具有顯著差異，這一發(fā)現(xiàn)提示，ZBTB18可能在不同的癌癥中發(fā)揮著不同的作用。隨后在不同的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移性腸癌細(xì)胞中ZBTB18的表達(dá)水平要顯著高于原發(fā)性腸癌(P=0.021 5)。當(dāng)把ZBTB18表達(dá)水平敲低后，HT29細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力均顯著降低。這表明，在腸癌細(xì)胞系中，ZBTB18的功能與腦膠質(zhì)瘤相反，具有促進(jìn)腫瘤的功能，為癌基因。而該基因在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)理還需進(jìn)一步詳細(xì)研究，為結(jié)直腸癌及其他癌癥提供重要線索和依據(jù)。