GNB2L1對惡性黑素瘤細胞增殖和遷移的影響

鄭舒丹 程詩萌 董亞兵 李孟森 劉天一 朱寧文

[摘要]目的：探討支架蛋白重組人鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白beta多肽2樣蛋白1（guanine nucleotide-binding protein subunit Beta 2-like 1，GNB2L1）對小鼠惡性黑素瘤B16F10細胞增殖和遷移的影響。方法：用靶向GNB2Ll的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒液和空載體慢病毒液感染惡性黑素瘤B16F10細胞，分別獲得穩(wěn)定感染細胞株B16F10-GNB2L1-shRNA（陽性實驗組）和B16F10-NC（陰性對照組），未感染病毒液的細胞株B16F10設(shè)為空白對照組。Western blot檢測GNB2Ll以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志蛋白E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）的表達水平;CCK-8檢測細胞的增殖能力;劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。結(jié)果：與B16F10和B16F10-NC相比，B16F10-GNB2L1-shRNA中GNB2Ll蛋白表達水平明顯下調(diào);GNB2L1敲降可明顯抑制B16F10細胞的增殖和劃痕遷移能力;Western blot特異性抗體檢測發(fā)現(xiàn)GNB2L1敲降的細胞中N-cadherin的蛋白表達水平明顯降低，而E-cadherin的蛋白表達水平明顯升高。結(jié)論：下調(diào)GNB2Ll蛋白表達可有效抑制惡性黑素瘤B16F10細胞的增殖和遷移能力。

[關(guān)鍵詞]GNB2Ll;惡性黑素瘤;shRNA;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;增殖;遷移

[中圖分類號]R739.5? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）06-0059-05

Abstract： Objective? To investigate the effect of scaffold protein Guanine nucleotide-binding protein subunit Beta 2-like 1 （GNB2L1） on proliferation and migration of mouse malignant melanoma B16F10 cells. Methods? Malignant melanoma B16F10 cells were infected with short hairpin RNA （shRNA） lentiviral solution and empty vector lentiviral solution targeting GNB2L1 to obtain stable infected cell line B16F10-GNB2L1-shRNA （positive experimental group） and B16F10-NC （negative control group）， cell line B16F10 not infected with virus solution was set as a blank control group. Western blot was used to detect the expression levels of GNB2L1 and epithelial-mesenchymal transition marker proteins E-cadherin and N-cadherin; CCK-8 was used to detect the cells proliferation ability; scratch test was used to detect cells migration ability. Results? Compared with B16F10 and B16F10-NC， the expression of GNB2L1 protein was down-regulated in B16F10-GNB2L1-shRNA; GNB2L1 knockdown significantly inhibited the proliferation and scratch migration ability of B16F10 cells; Western blot specific antibody detection found that GNB2L1 knockdown the expression level of N-cadherin protein was significantly decreased in cells， while the expression level of E-cadherin protein was significantly increased. Conclusion? Down-regulation of GNB2L1 protein expression can effectively inhibit the proliferation and migration of malignant melanoma B16F10 cells.

Key words： GNB2Ll; malignant melanoma; shRNA; EMT; proliferation; migration

惡性黑素瘤（malignant melanoma，MM）是一種來源于黑素細胞的侵襲性皮膚惡性腫瘤，盡管其發(fā)病率僅占所有皮膚病的4%，卻占皮膚腫瘤相關(guān)死亡疾病的90%，是皮膚癌相關(guān)死亡的最主要原因[1]，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。2018年最新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示美國皮膚惡性黑素瘤新增病例91 270例[2]，相比2017年癌癥統(tǒng)計[3]顯示的惡性黑素瘤新增病例87 110例要高。而且惡性黑素瘤在我國發(fā)病率近年來成倍增長，每年新發(fā)病例約2萬人[4]，已經(jīng)成為嚴重危及我國人民健康的疾病之一。

GNB2L1又稱激活的蛋白激酶C受體1（receptor for Activated C Kinase l，RACKl），是一種36KDa的蛋白質(zhì)，屬于色氨酸-天冬氨酸重復(fù)序列（tryptophan-aspartate repeat，WD-repeat）β-螺旋槳蛋白家族成員，含有7個WD-40的重復(fù)序列，高度保守地存在于哺乳動物和人類的肝、腦和脾等組織中。GNB2L1屬于支架蛋白，被認為是多種功能信號通路的樞紐，提供蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的平臺，并在細胞的生長、黏附、增殖、侵襲和遷移等過程中發(fā)揮重要的作用。目前已有研究表明GNB2L1在多種腫瘤細胞中表達上調(diào)，包括乳腺癌[5]、非小細胞肺癌[6]、結(jié)腸癌[7]、腦膠質(zhì)瘤[8]和胰腺導(dǎo)管腺癌[9]等，被認為不良預(yù)后的因素。由此可見，GNB2L1在腫瘤細胞的產(chǎn)生、增殖、分化、惡變、侵襲和遷移等方面發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。因此，筆者推測GNB2L1支架蛋白可能參與了惡性黑素瘤的發(fā)生與發(fā)展過程，對惡性黑素瘤的增殖和遷移等生物學(xué)行為發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

1? 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器：DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS緩沖液及0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國）;GNB2L1 shRNA和NC shRNA（金維智生物科技有限公司，中國）;Lipofectamine2 000 （Invitrogen公司，美國） ;兔RACK1單克隆抗體、兔N-cadeherin 多克隆抗體和鼠E-cadeherin 單克隆抗體（Abcam公司，美國）;鼠β-actin單克隆抗體、鼠GAPDH單克隆抗體、增強型CCK-8試劑盒（上海Beyotime生物技術(shù)有限公司，中國）;HRP標記山羊抗兔IgG和抗鼠IgG抗體（Cell Signaling公司，美國）;RIPA細胞裂解液（北京索萊寶技術(shù)有限公司，中國）;BCA法蛋白濃度檢測試劑盒（Thermo公司，美國）;基本型ECL發(fā)光底物A液、B液（上海圣爾生物科技有限公司，中國）;質(zhì)粒中抽試劑盒（天根生化科技北京有限公司，中國）;NcmDH5α感受態(tài)細胞（新賽美生物科技有限公司，中國）;CO2恒溫培養(yǎng)箱（Haier公司，中國）;Mini-P TET蛋白電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)GelDoc XR+ （Bio-Rad公司，美國）;電泳轉(zhuǎn)移槽（上海Tanon有限公司，中國）;多功能酶標儀Infinite M200 Pro（Tecan公司，瑞士）。

1.2 細胞培養(yǎng)：惡性黑素瘤B16F10細胞源自上海復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院重點實驗室，用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次。當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底壁面積的80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 GNB2L1干擾寡核苷酸序列的合成和慢病毒包裝：將針對GNB2L1干擾靶點的shRNA序列克隆到慢病毒表達載體質(zhì)粒上，正義鏈：5'-CACCGAGATAAGACCATCATCATGTTTCAAGAGAACATGATGATGGTCTTATCTCTTTTTTG-3'，反義鏈：5'-AGCTCAAAAAAGAGATAAGACCATCATCATGTTCTCTTGAAACATGATGATGGTCTTATCTC-3'。293T細胞接種于6cm培養(yǎng)皿中，將病毒包裝質(zhì)粒和核心質(zhì)粒與Lipofectamine 2 000脂質(zhì)體混合，質(zhì)粒質(zhì)量：脂質(zhì)體體積比為1：2，加入適量的無血清的OPTI培養(yǎng)基，輕輕晃動培養(yǎng)皿使其充分混勻，置于37℃、CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育，6～8h后更換含有血清的新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后收集上清液。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染細胞：B16F10細胞接種于6孔板，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育，當細胞貼壁后，所占面積達80%～90%時，吸棄6孔板舊的培養(yǎng)基，加入新收集的病毒液繼續(xù)感染24h。更換新鮮的完全培養(yǎng)基，加入嘌呤霉素，使其濃度為1.5?g/ml，篩選嘌呤霉素抗性基因表達陽性的細胞，無嘌呤霉素抗性基因的細胞被殺死，每天更換新鮮的含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，以獲得轉(zhuǎn)染GNB2L1 shRNA序列的細胞株（B16F10-GNB2L1-shRNA），用于后續(xù)實驗。

1.5 CCK8測量細胞增殖活性：將生長對數(shù)期B16F10細胞接種至96孔板，接種濃度1 500個/孔，每孔150?l培養(yǎng)基，每組6個復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，當細胞融合率達80%～90%，每孔加入150?l的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h，用酶標儀測波長為450nm的OD值。

1.6 劃痕試驗：將B16F10細胞接種于6孔板，每組3個復(fù)孔，在6孔板底面的外壁用標記筆劃縱向黑線，用黃色槍頭在細胞上垂直于縱向黑線劃痕，PBS緩沖液沖洗清除劃下的細胞，加入無血清的DMEM細胞培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下拍照，記為0h。將細胞放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24～48h，利用倒置顯微鏡，保持與0h拍照一致的位置，記錄24h和48h劃痕寬度變化。

1.7 Western blot檢測E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達水平：RIPA細胞裂解液裂解細胞提取轉(zhuǎn)染GNB2L1 shRNA的蛋白，根據(jù)BCA法蛋白濃度檢測試劑盒說明書在570nm波長處測量蛋白標準品的OD值，制作蛋白標準品的標準曲線，算出待測蛋白濃度，SDS樣品緩沖液（5×）100℃加熱5min，使蛋白變性。配膠完成后上樣，電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，含4%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1h，再分別與E-cadherin和N-cadherin一抗（ 稀釋比分別為1‥2 000和1‥3 000） 及GAPDH一抗（ 稀釋比為1：1 000） 4℃溫育過夜。TBST緩沖液洗膜3次，HRP耦聯(lián)的IgG作為二抗（稀釋比為1：10 000）室溫溫育1h，重復(fù)洗膜3次，ECL發(fā)光法顯色，利用Image Lab軟件進行圖像分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析：采用Graphpad prism 6軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x?±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 GNB2L1 shRNA的B16F10細胞下調(diào)GNB2L1支架蛋白的表達：與空白組B16F10和陰性對照組B16F10-NC相比，B16F10細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GNB2L1 shRNA中GNB2L1支架蛋白的條帶顏色明顯較淺（見圖1）。該結(jié)果顯示B16F10-GNB2L1-shRNA組細胞的GNB2L1表達量明顯下降，表明GNB2L1 shRNA轉(zhuǎn)染成功，GNB2L1敲除成功。

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GNB2L1 shRNA的B16F10細胞增殖活性顯著下降：在相同初始接種濃度下和觀察時間段內(nèi)（24～72h），三組的OD值持續(xù)增加，48～72h的增加速率高于24～48h增加速度;其中空白組B16F10細胞和陰性對照組B16F10-NC細胞的OD值增加速率接近，都較B16F10-GNB2Ll-shRNA細胞的OD值高;尤其在接種72h后，空白組B16F10細胞的OD值顯著高于實驗組B16F10-GNB2Ll-shRNA細胞，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;盡管此時陰性對照組B16F10-NC細胞的OD值亦較高，與空白對照組B16F10細胞的OD值相比，兩組差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（見表1，圖2）。該結(jié)果證實穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GNB2L1 shRNA的B16F10細胞增殖活性顯著下降。

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GNB2L1 shRNA的B16F10細胞的遷移速度顯著減慢：劃痕實驗顯示起始狀態(tài)下三組的劃痕寬度近似，隨著時間的推移劃痕間距明顯減小（見圖3）。在24h，B16F10空白組細胞遷移率（82.67±1.4530）和B16F10-NC陰性對照組細胞遷移率（75.00±1.7320）比實驗組B16F10-GNB2Ll-shRNA細胞的遷移率（33.00±1.7320）顯著增加，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;特別在48h，B16F10空白組細胞遷移率（91.67±1.6670）與B16F10-NC陰性對照組細胞遷移率（91.33±2.1860）較實驗組B16F10-GNB2Ll-shRNA細胞的遷移率（41.33±1.8560）顯著增加，B16F10空白組細胞和B16F10-NC陰性對照組細胞幾乎填滿整個劃痕空隙，兩組之間的差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;B16F10空白組細胞遷移率和B16F10-NC陰性對照組細胞遷移率之間無明顯差異（P>0.5）（見圖4）。該實驗結(jié)果表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GNB2L1shRNA能顯著抑制鼠黑素瘤B16F10細胞的遷移運動能力。

2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GNB2L1 shRNA的B16F10細胞中E-cadherin蛋白表達水平：Western blot分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B16F10-GNB2L1-shRNA細胞內(nèi)E-cadherin蛋白的表達量（0.8654±0.0331）明顯高于空白對照組B16F10細胞（0.1234±0.0179），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖5。

2.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GNB2L1 shRNA的B16F10細胞中N-cadherin蛋白表達水平：B16F10-GNB2L1-shRNA細胞內(nèi)N-cadherin蛋白的表達量（0.01081±0.0007）明顯低于空白對照組B16F10細胞（0.2309±0.0295），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;而陰性對照組B16F10-NC細胞內(nèi)N-cadherin細胞的表達量（0.1943±0.0228）與空白對照組B16F10的表達量無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。見圖6。

3? 討論

早期發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大多數(shù)黑素瘤患者死亡的主要原因，轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的中位生存時間為8～9個月，3年總體生存率不足15%[10]。轉(zhuǎn)移性黑素瘤是人類第五大最常見并被診斷的癌癥[11]之一。惡性黑素瘤的高轉(zhuǎn)移特性一直是其治療的難點，盡早發(fā)現(xiàn)并阻斷惡性黑素瘤的轉(zhuǎn)移成為提高患者生存率的關(guān)鍵因素。因此，尋找一種靶向惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移的位點對提高患者治療效果和預(yù)后發(fā)揮重要作用。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟過程，涉及到腫瘤細胞與宿主之間的相互作用。腫瘤細胞通過改變自身細胞骨架和細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移到周圍組織、血管和淋巴管而進入血液循環(huán)并向遠處組織和器官播散遷移。本實驗研究顯示下調(diào)GNB2L1支架蛋白的表達后，B16F10-GNB2L1-shRNA組與兩對照組相比，細胞增殖活性明顯受到抑制;劃痕實驗結(jié)果也表明B16F10-GNB2L1-shRNA組的細胞爬滿劃痕的速率明顯低于對照組。根據(jù)這些結(jié)果推斷GNB2L1在促進惡性黑素瘤細胞的增殖和遷移中發(fā)揮著重要的作用。

上述發(fā)現(xiàn)與以往報道中觀察到的GNB2L1在其他腫瘤細胞中的作用一致，例如Shen等[12]研究表明GNB2L1在體外和體內(nèi)均促進前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，通過siRNA對GNB2L1敲低抑制了前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。Peng等[13]研究表明GNB2L1在鼻咽癌組織中高表達，GNB2L1的過表達促進鼻咽癌細胞的增殖、侵襲和遷移，而下調(diào)GNB2L1則抑制鼻咽癌細胞的增殖、侵襲和遷移。Hu等[14]GNB2L1在食管鱗狀細胞癌中上調(diào)，GNB2L1的過表達促進食管鱗狀細胞癌的增殖和遷移，而GNB2L1的下調(diào)在體內(nèi)和體外均抑制其增殖和遷移。Li等[15]研究表明GNB2L1在口腔鱗狀細胞癌中的沉默不僅可抑制細胞的增殖，還可抑制腫瘤細胞的侵襲、遷移和黏附的能力。

上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細胞獲得運動遷移能力的一個重要途徑，是促使細胞脫離原發(fā)病灶的關(guān)鍵步驟。發(fā)生EMT改變后不僅可以下調(diào)腫瘤細胞連接分子的表達，導(dǎo)致細胞極性缺失，細胞黏附能力下降、運動性提高、侵襲能力增強，還可以通過改變腫瘤生長狀態(tài)、侵襲和轉(zhuǎn)移以及血管形成的微環(huán)境，增強腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力[16]。此外，EMT還參與細胞外基質(zhì)和基底膜溶解，破壞組織之間正常的屏障，進入血液或淋巴循環(huán)，在種植部位形成轉(zhuǎn)移瘤[17]。因此，EMT是腫瘤細胞發(fā)生侵襲和遠處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。在EMT的過程中通常伴隨著E-cadherin上皮細胞標志物表達的下調(diào)和N-cadherin等間質(zhì)表型標志物表達的上調(diào)。

E-cadherin是一種介導(dǎo)同型細胞-細胞間黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，在維持上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性和極性中發(fā)揮重要的作用。在上皮細胞中E-cadherin正常表達，當E-cadherin表達下降時，上皮細胞之間會失去正常極性，發(fā)生黏附缺失，從而從上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型，導(dǎo)致腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，E-cadherin也稱為惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制因子。而N-cadherin與E-cadherin相反。N-cadherin主要在細胞質(zhì)中高表達，不表達于正常的上皮組織。當上皮組織中N-cadherin表達上調(diào)，導(dǎo)致上皮細胞的形態(tài)和生物學(xué)行為發(fā)生改變，促進細胞侵襲和遷移，即發(fā)生EMT。大量研究表明在惡性腫瘤中E-cadherin表達的缺失通常伴隨著N-cadherin表達的上調(diào)，E-cadherin和N-cadherin作為代表性的EMT標志物，與患者不良預(yù)后有關(guān)，包括膠質(zhì)瘤[18]、口腔鱗狀細胞癌[19]、膀胱移行細胞癌[20]和喉鱗狀細胞癌[21]等。本研究通過Western blot實驗特異性地檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)敲低GNB2L1支架蛋白的表達后，E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，而N-cadherin蛋白表達水平明顯降低。該結(jié)果與以往報道一致，這意味著GNB2L1調(diào)控這兩種蛋白表達，并可能在促進惡性黑素瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中起著重要的作用，進而促進腫瘤細胞的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移。因此，研究E-cadherin和N-cadherin在EMT過程中的相關(guān)機制有助于了解惡性黑素瘤細胞的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為。

綜上所述，筆者研究數(shù)據(jù)表明GNB2L1支架蛋白在惡性黑素瘤中表達，通過下調(diào)支架蛋白GNB2L1的表達可以有效抑制惡性黑素瘤細胞的增殖和遷移能力，并可能通過上調(diào)E-cadherin和下調(diào)N-cadherin抑制惡性黑素瘤細胞發(fā)生上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化實現(xiàn)的。因此，GNB2L1有望成為評估惡性黑素瘤發(fā)生、發(fā)展和遷移的臨床生物標志物，并可能為惡性黑素瘤提供新的治療靶點。

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[收稿日期]2018-11-19

本文引用格式：鄭舒丹，程詩萌，董亞兵，等.GNB2L1對惡性黑素瘤細胞增殖和遷移的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（6）：59-63.