寶寶樂顆粒對幼鼠脾胃虛寒型非特異性功能性腹痛作用研究

石 菊，白 冰，許艷茹，倫宗慧，曲曉峰，邊 雨，鄭麗紅，徐 建*

功能性胃腸?。‵GIDs）［1］，又稱腸腦互動異常，是一組因動力紊亂、內(nèi)臟高敏感、黏膜免疫功能改變、腸道菌群改變、中樞神經(jīng)系統(tǒng)處理功能異常［2］等因素引起的以腹痛、惡心嘔吐、腹瀉便秘、難以排出食物或糞便為特征的非器質(zhì)性消化道紊亂性疾病.根據(jù)2016年發(fā)表兒童功能性胃腸病羅馬Ⅳ標準，F(xiàn)AP-NOS的患兒經(jīng)常有非特異性的胃腸道外軀體癥狀，應(yīng)特別關(guān)注的是自主神經(jīng)癥狀.目前研究認為，F(xiàn)AP-NOS可能是一種中樞性疼痛，由于多種因素影響了中樞神經(jīng)對正常腸道功能的生理調(diào)控，導(dǎo)致正常的內(nèi)調(diào)節(jié)信號在中樞神經(jīng)系統(tǒng)放大，產(chǎn)生異常感覺，從而導(dǎo)致腹痛等癥狀.寶寶樂顆粒由白芍、黃芪、大棗、桂枝、干姜、山楂、六神曲、麥芽等八味藥材組成.溫中補虛，和里緩急，開胃消食，用于脾胃虛寒，脘腹隱痛，喜溫喜按，胃納不香，食少便溏.供試品口服，一次5～10g，一日2～3次，故6～9歲兒童臨床最大使用劑量為30g/人/日，按70kg人和60g幼鼠等效劑量折算系數(shù)法可得幼鼠等效劑量為9.3g生藥/kg/d.幼鼠按臨床等效劑量1倍（A）、2倍（B）、4倍（C）設(shè)計3個劑量，即是10.0g生藥/kg/d、20.0g生藥/kg/d、40.0g生藥/kg/d.

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar幼鼠70只，SPF級，體重180～220g，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司［合格證號：SCXK（吉）2016-0003］.

1.2 實驗藥品與試劑

寶寶樂顆粒［修正藥業(yè)集團股份有限公司，5g/袋］；P物質(zhì)、5-羥色胺、腫瘤壞死因子α試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；乙醚（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；石蠟油（天津市華東試劑廠）.

2 實驗方法

2.1 造模方法

參照《中醫(yī)實驗動物學(xué)》和文獻報道［3］的綜合造模方法加以改進，具體如下：Wistar幼鼠70只，空白對照組10只，每天喂養(yǎng)維持飼料，自由飲水，其余幼鼠進行造模.造模過程分為兩大階段（均自由飲水）.第一階段為前6天，單日喂精煉豬脂2mL/200g，雙日喂飼甘藍l0g/200g；每日38℃溫水中游泳至疲勞；第二階段為7～21天，每日再加灌100%番瀉葉水浸液2mL/200g.

2.2 分組及給藥劑量

將造模成功的Wistar幼鼠50只，隨機分為5組，分為模型組、陽性藥物對照組（黃芪建中丸組）、寶寶樂顆粒低、中、高劑量組（10g生藥/kg/d、20g生藥/kg/d、40g生藥/kg），每組10只.從實驗第22d開始，空白對照組、模型組均給予等量純化水，給藥體積為10mL/kg/d，持續(xù)給藥14d.

2.3 檢測指標

（1）一般情況.在實驗過程中，觀察幼鼠外觀及活動情況，如精神萎靡、蜷臥、扎堆、反應(yīng)遲鈍、皮毛枯槁散亂、肛周污濁、飲食減少，消瘦等表現(xiàn).記錄給藥前、后攝食量和體重變化.

（2）內(nèi)臟敏感性檢測［4］.檢測前24h禁食、不禁水.乙醚麻醉后，將用石蠟油潤滑的8F導(dǎo)尿管經(jīng)肛門插入，氣囊末端距肛門1cm，將導(dǎo)尿管固定于大鼠尾部.大鼠蘇醒后，將其放在特制的塑料籠內(nèi)，大鼠只能上下運動，無法前后活動和轉(zhuǎn)身.30min適應(yīng)期后通過觀察不同的壓力（20mmHg、30mmHg、40mmHg）條件下的結(jié)直腸擴張刺激下的AWR評分，用來反映幼鼠內(nèi)臟敏感性的變化.結(jié)直腸擴張（Colorectal Distention，CRD）刺激時，每個CRD壓力持續(xù)時間為20s，并且重復(fù)3次，最后取三次所測得的AWR評分的平均值，作為該擴張壓力下最終的腹壁回撤反射（AWR）得分［5］.

評分標準：0分，大鼠對結(jié)直腸擴張無行為學(xué)反應(yīng)；1分，結(jié)直腸擴張時身體靜止不動，頭部運動減少或抬高；2分，結(jié)直腸擴張時腹肌收縮，但腹部未抬離桌面；3分，結(jié)直腸擴張時腹肌收縮且腹部抬離桌面，嘶叫；4分，結(jié)直腸擴張時骨盆抬起，身體呈弓形.

（3）血中致痛物質(zhì)P物質(zhì)（SP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）含量的測定嚴格按規(guī)定程序進行，取靜脈血3mL，注入含30uL 0.5M EDTA-Na2和抑肽酶1500KIU抗凝試管中混勻，離心，取血漿放-20℃保存?zhèn)溆?，待測血漿中致痛物質(zhì)P物質(zhì)（SP）、神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）含量；常規(guī)靜脈取血，分離血清，置-20℃保存?zhèn)溆?，測定TNF-α水平.

2.4 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用t檢驗，結(jié)果用均值±標準差表示，p＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異.

3 實驗結(jié)果

3.1 一般情況

造模開始前，幼鼠皮毛潔白有光澤，精神狀態(tài)良好.造模后，精神萎靡、瞇眼、蜷臥、反應(yīng)遲鈍、行走不穩(wěn)、皮毛枯槁散亂、肛周污濁、飲食減少，消瘦等表現(xiàn).各組給藥前后動物體重及攝食量變化未見明顯差異.詳見表1～2.

3.2 內(nèi)臟敏感性評價

結(jié)果表明，模型組幼鼠在各個CRD壓力（20mmHg、30mmHg和40mmHg）刺激下的AWR評分與空白對照組比較明顯升高（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001）；寶寶樂顆粒低、中、高劑量可降低幼鼠在CRD壓力為20mmHg、30mmHg和40mmHg時的AWR評分，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001）.詳見表3.

3.3 對血中致痛物質(zhì)P（SP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）含量的影響

結(jié)果表明，與空白對照組比較，模型組幼鼠血漿中SP、5-HT和血清中TNF-α含量明顯升高（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001）；寶寶樂顆粒低、中、高劑量組幼鼠血漿中SP和5-HT含量降低，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05，p＜0.01）；寶寶樂顆粒高劑量組幼鼠血清中TNF-α含量降低，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）.詳見表4.

4 討論

脾胃虛寒型功能性腹痛（FAP-NOS）發(fā)病機制尚未完全闡明，但腦-腸軸功能失調(diào)被公認為是其主要的發(fā)病機制之一.多種神經(jīng)遞質(zhì)的分泌異常影響胃腸道運動、感覺和分泌功能.實驗證實［6］，結(jié)直腸擴張刺激活化大腦多個區(qū)域一級邊緣神經(jīng)系統(tǒng)并對壓力呈依賴性，使中樞性感覺高度敏感，加上后續(xù)反應(yīng)引起胃腸功能失調(diào).本研究結(jié)果表明，寶寶樂顆粒低、中、高劑量可降低幼鼠在CRD壓力為20mmHg、30mmHg和40mmHg時的AWR評分，降低胃腸道內(nèi)臟敏感性，使得大部分的胃腸道平滑肌運動増強.SP作為重要的痛覺興奮性傳導(dǎo)遞質(zhì)之一［7-8］，主要通過向上傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也可逆向釋放入損傷局部組織中，啟動神經(jīng)源性雙向可逆炎癥反應(yīng)［9］，調(diào)節(jié)多種細胞產(chǎn)生各種細胞因子.Ansel［10］證實SP能促進肥大細胞釋放炎癥介質(zhì)，刺激單核-巨噬細胞系統(tǒng)產(chǎn)生TNF-α；同時TNF-α還能刺激神經(jīng)生長因子的合成和促進SP的釋放［11］.5-HT可作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與調(diào)節(jié)腦-腸軸的互動過程［12-13］，臨床研究發(fā)現(xiàn)功能性腹痛患者5-HT的合成、釋放和再攝取異常，可導(dǎo)致腸道感覺過敏和動力異常.本研究發(fā)現(xiàn)，脾胃虛寒型FAP-NOS模型鼠血漿5-HT水平明顯升高，這與國外Simon等［14］發(fā)現(xiàn)功能性腹痛患者血中5-HT含量升高的結(jié)果一致.本研究結(jié)果表明，寶寶樂顆?？梢哉{(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和SP的興奮性，降低致痛物質(zhì)SP的釋放，刺激膽堿能神經(jīng)元，其藥理作用呈量效關(guān)系.寶寶樂顆粒在其溫胃化濕行氣的基礎(chǔ)上佐以少量滋陰性寒的干姜，溫而不燥，從而達到調(diào)節(jié)腦-腸軸功能，從根本上解決改善機體虛寒證候［15］.

表1 幼鼠給藥前后體重變化表（s，n=10）

表2 對幼鼠攝食量的影響（s，n=10）

表3 各組幼鼠在不同擴張容量下AWR評分比較（s，n=10）

表4 對脾胃虛寒型幼鼠血漿中SP、5-HT和血清中TNF-α含量的影響（s，n=10）