基于Nrf2/HO-1通路介導的及己根和雷公藤水提取物誘導的大鼠肺毒性比較研究

孫淑萍，任秀海，吳成華 ，張小平，董婷玉，鎖孝國

雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）系衛(wèi)矛科雷公藤屬木質藤本植物雷公藤的根.雷公藤作為一種常用中藥，味苦有大毒，具有清熱解毒、活血化瘀、消腫散結等功效，并具有抗炎、免疫調節(jié)及抗腫瘤等多種活性，被廣泛用于治療腎小球腎炎、類風濕關節(jié)炎或者紅斑狼瘡等自身免疫性疾病.但在使用過程中，所引起的毒性反應事件頻繁報道，成為近半個世紀以來發(fā)生中毒事件最多的中草藥之一［1］，因此，有必要進一步尋找抗炎活性好、毒性小的替代中藥.

及己（Chloranthus serratusRoem.et Schalt）為金粟蘭科金粟蘭屬植物，以根或全草入藥，具有消腫解毒、祛風止痛、舒筋活絡等功效，常用于治療風濕腰腿痛、跌打損傷、毒蛇咬傷、疔瘡腫毒等［2］.前期研究證實及己有確切的抗炎活性［3］，但本品有毒，過量服用后會引起心外膜下出血、肺出血及水腫等.

現(xiàn)有關雷公藤、及己對肺組織損傷的文獻報道較少，大多為臨床報道.關于雷公藤與及己根水提取物對大鼠肺毒性比較及其毒性機制的研究尚未見報道.為此，通過檢測肺組織勻漿中MDA、T-SOD、GSH和CAT水平；HE染色法觀察肺組織病理變化；Western-blot法檢測肺組織中Nrf2、HO-1蛋白表達情況；免疫組化法檢測ICAM-1陽性表達情況來比較雷公藤與及己根水提取物對大鼠肺毒性大小，并初步探明其毒性機制，為民間和臨床用藥提供安全性指導，為法醫(yī)鑒定提供參考，為把及己開發(fā)成較好的抗炎藥打下基礎，現(xiàn)報道如下.

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

清潔級SD雄性大鼠，購自山東省實驗動物中心，批準文號：SCXK（魯）2014-0007，體重200±10g.動物先適應性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度為23±2℃，濕度為50%～60%，飲用水為自來水.

1.2 藥材

雷公藤購自亳州藥材市場，及己采于安徽黃山，經皖南醫(yī)學院朱建華教授鑒定均為真品.

1.3 藥品與試劑

總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、BCA法蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；細胞間黏附分子-1（ICAM-1）兔多抗、Mouse Anti-β-Actin、Goat Anti-Mouse IgG、Rabbit Anti-HO-1、核因子E2相關因子2（Nrf2）一抗、Goat Anti-Rabbit IgG、免疫組化三步法試劑盒、增強型RIPA裂解液、PMSF（博士德生物工程有限公司）；硝酸纖維素（NC）膜（PallCorporation）；彩色預染蛋白marker（Thermo）；BeyoECLplus化學發(fā)光試劑盒等.

1.4 主要儀器

常規(guī)輪轉石蠟切片機（浙江省金華市益迪醫(yī)療設備廠）；EYELAN-1100旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；高速冷凍離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；Thermo Scientific Multiskan FC酶標儀（北京昊諾斯科技有限公司）；YD-AB型生物組織攤烤片機（浙江省金華市益迪醫(yī)療設備廠）；YD-6D智能型生物組織包埋機（浙江省金華市益迪醫(yī)療設備廠）；CKX31OLYMPUS顯微鏡（昆山諾普森實驗室用品科技有限公司）；AmershamImager600自動曝光儀（GE Healthcare Japan Corporation）；Biorad電泳儀（伯樂生命醫(yī)學產品有限公司）等.

2 實驗方法

2.1 雷公藤水提取物與及己根水提取物的的制備

將雷公藤、及己根粉碎成粗粉，分別按以下方法提?。悍Q取500g粗粉，用水回流提取，第1次加12倍量水，浸泡0.5h，提取1.5h，第2次加10倍量水，提取1h，第3次加8倍量水，提取1h，每次用布氏漏斗抽濾，合并濾液，減壓濃縮，放45℃真空干燥箱干燥，粉碎過80目篩，得雷公藤水提取物和及己根水提取物.用水提取物重量/粗粉重量×100%，即得水提取物得率.

2.2 動物的分組與給藥劑量的確定

將SD雄性大鼠24只隨機等分為空白（KB）組、雷公藤水提取物（LS）組和及己根水提取物（GS）組，灌胃給藥.

根據預實驗結果設置100倍劑量毒性試驗組.根據種屬間等效劑量折算表［4］確定大鼠日給藥量（水提取物質量，g/kg）為成人的臨床用藥劑量（3g）×0.018×100×藥材提取率（LS提取率為13.8%，GS提取率為14.2%）×5，即LS 3.73g/kg/天，GS 3.83g/kg/天.水提取物用蒸餾水配成溶液，每日灌胃給藥1次，連續(xù)14天，第15天處死.KB組給予相同量蒸餾水，給藥體積為2mL/200g體重/天.給藥期間每日觀察并記錄大鼠活動、精神狀態(tài)、進食飲水、大小便等一般情況及出現(xiàn)的毒性癥狀和體征等.大鼠于給藥第1、3、5、7、9、11、13、15天分別稱體重，并計算體重變化率.體重變化率（%）=（后面天數(shù)的體重-第1天體重）/第1天體重×100%.以縱坐標為體重變化百分率，橫坐標為天數(shù)作圖，可得體重變化率曲線圖.

2.3 取材

麻醉大鼠，摘除眼球取血，斷頭處死，進行大體解剖，摘取兩肺.用生理鹽水洗凈表面血液后，用濾紙吸干，稱重并計算臟器系數(shù).臟器系數(shù)=臟器濕重（g）/動物體重（g）×100%.

2.4 肺組織中氧化指標MDA、T-SOD、GSH和CAT含量的測定

肺組織在低溫條件下，按肺質量（g）：生理鹽水（mL）=1∶9，常規(guī)方法制作肺組織勻漿，4℃條件下，以2500r/min離心20min，取上清液，嚴格按照試劑盒說明書要求測MDA、T-SOD、GSH和CAT含量.

2.5 HE染色的肺組織病理學檢查

大鼠肺組織經10%甲醛固定，乙醇逐級脫水，石蠟包埋，按3μm厚度切片，撈片，烤片，脫蠟，復水，蘇木精-伊紅（HE）染色，脫水，透明，封片，進行光鏡觀察每張切片.

2.6 免疫組化法檢測ICAM-1陽性表達情況

對2.5項制備的蠟塊進行常規(guī)石蠟切片，撈片，烤片，脫蠟復水，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，滅活內源性過氧化物酶，抗原熱修復，正常羊血清封閉，在切片上滴加ICAM-1一抗，4℃孵育過夜，PBS漂洗后滴加二抗（1∶200），37℃孵育1h.PBS漂洗后，滴加SABC試劑，37℃恒溫孵育1h，PBS漂洗后，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，氨水返藍，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察、拍照.用ImageJ軟件統(tǒng)計陽性表達百分率，多次統(tǒng)計取平均值.

2.7 Western-blot法檢測Nrf2/HO-1的蛋白水平

肺組織適量，置于1.5mL離心管中，加入10倍體積的裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）于冰上勻漿30min.然后在4℃、12000rpm的條件下，離心20min.取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液，煮沸變性10min.用SDS-聚丙烯酰胺凝膠（12%分離膠和5%濃縮膠）進行分離，使用NC膜，110V轉膜70min，牛奶封閉2h，洗凈，4℃一抗 Nrf2（1∶1000）/HO-1（1∶400）/β-actin（1∶400）孵育過夜，用TBST清洗，孵育二抗抗兔（1∶6000）/二抗抗鼠（1∶8000）1.5h，洗膜后滴加現(xiàn)配的ECL顯影液曝光顯影.用ImageJ軟件計算灰度值并定量分析.

2.8 統(tǒng)計學分析

利用統(tǒng)計軟件SPSS19.0處理系統(tǒng)進行配對t檢驗，文中數(shù)據采用均數(shù)±標準差表示（±s），以p＞0.05為無統(tǒng)計學差異，p＜0.05為顯著性差異，p＜0.01為極顯著性差異，多組間比較用方差分析.

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況比較

KB組大鼠食欲、活動均正常，皮毛有光澤.LS組皮毛明顯黯淡無光，活動減少，食欲下降，精神萎靡，有掉毛現(xiàn)象，在飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)中毒死亡現(xiàn)象，可見角弓反張、嘴角出血和四肢抽搐等現(xiàn)象.GS組大鼠和KB組相比差異較小.初步說明LS組毒性大于GS組.

3.2 雷公藤與及己根水提取物對各組大鼠體重變化的影響

與KB組相比，LS組、GS組的大鼠體重變化率均較低，且LS組大鼠體重下降趨勢更明顯，說明LS組毒性顯著.且在第13天時，與KB組相比，LS組體重變化率有顯著性差異（p＜0.05），經分析可得，LS組毒性大于GS組，見圖1.

圖1 各組大鼠體重變化率曲線

3.3 雷公藤與及己根水提取物對大鼠肺系數(shù)的影響

與KB組相比，LS組肺系數(shù)顯著增大（p＜0.05），GS組肺系數(shù)略微升高（p＞0.05），說明LS組、GS組均有肺毒性，且LS組毒性大于GS組，見圖2.

圖2 大鼠給藥后肺系數(shù)

3.4 雷公藤與及己根水提取物對大鼠肺組織中MDA、CAT、T-SOD、GSH含量的影響

與KB組相比，LS組MDA含量極顯著性增高（p＜0.01），CAT、T-SOD、GSH水平均顯著性降低（p＜0.01或p＜0.05），GS組MDA、CAT、T-SOD和GSH含量均無顯著性差異（p＞0.05），由此可見，LS組肺毒性大于GS組，見表1.

3.5 雷公藤與及己根水提取物對大鼠組織形態(tài)的影響

（1）各組大鼠肺組織肉眼觀察.KB組大鼠肺表面光滑，無出血現(xiàn)象.而LS組、GS組都有一定程度的出血情況.LS組有深色片狀淤血.初步觀察可知，毒性大小為LS組大于GS組，見圖3.

圖3 各組大鼠肺大體形態(tài)

（2）各組大鼠肺組織切片鏡下觀察.鏡下見KB組局部肺泡間隔輕微增厚，有少量炎癥細胞浸潤，肺泡腔內未見滲出物，肺泡腔無病理性擴大，肺泡間質血管未見明顯充血現(xiàn)象.LS組可見支氣管呈鋸齒狀增生，支氣管周圍有大量以淋巴細胞為主的炎性浸潤，肺泡間質內大量充血且肺泡間隔有不同程度增生，部分支氣管腔內有大量紅細胞，有的視野中肺組織實質化，可見大量炎癥細胞、充血和淀粉樣變性.GS組可見支氣管周圍有炎性細胞浸潤，主要以淋巴細胞和中性粒細胞為主，肺泡間質內有少量充血并伴有肺泡間隔輕微增寬.由此可以得出，LS組、GS組均有肺毒性，且LS組大于GS組，見圖4.

圖4 給藥后大鼠肺組織切片

3.6 雷公藤與及己根水提取物對各組大鼠肺組織中黏附因子ICAM-1陽性表達率的影響

ICAM-1主要在細胞膜及細胞漿表達，呈棕黃色顆粒.與KB組相比，LS組、GS組陽性表達率均升高，且LS組有顯著陽性表達（p＜0.05），而GS組無明顯差異（p＞0.05），見圖5.故肺毒性大小為LS組大于GS組.

3.7 雷公藤與及己根水提取物對肺組織中Nrf2/HO-1蛋白表達的影響

與KB組相比，LS組、GS組肺組織中Nrf2、HO-1蛋白含量均降低，故LS組、GS組皆有肺毒性；且LS組極顯著性降低（p＜0.01），GS組無明顯差異（p＞0.05），故肺毒性大小為LS組大于GS組，如圖6所示.

表1 各組SD大鼠肺勻漿指標的變化（±s，n=8）

表1 各組SD大鼠肺勻漿指標的變化（±s，n=8）

注：與KB組相比，**p＜0.01，*p＜0.05.

GSH（μmol/gprot）4.15±1.047 3.11±0.241*4.32±0.265組別KB LS GS MDA（nmol/mgprot）1.05±0.062 1.61±0.130**1.09±0.090 T-SOD（U/mgprot）98.31±2.967 84.19±4.572**95.52±3.730 CAT（U/mgprot）4.28±0.317 3.64±0.320**4.12±0.187

圖5 各組大鼠肺組織中黏附因子ICAM-1的表達（×200倍）

圖6 各組大鼠肺組織中Nrf2/HO-1的表達

4 討論

雷公藤、及己根中毒后可引起多種臟器損傷，有研究表明其主要是通過產生的自由基參與氧化應激反應對機體發(fā)揮作用［5］.氧化應激被認為是雷公藤、及己根在體內發(fā)揮毒性作用的重要機制.

CAT、SOD、GSH和MDA反映機體的氧化狀態(tài)和抗氧化能力，四者均可以反映體內氧化應激水平［6］.當體內抗氧化防御能力（CAT、SOD、GSH水平）不足以清除過量氧自由基時，機體處于氧化應激狀態(tài)，從而導致組織和細胞產生一系列損傷［7］.CAT、SOD、GSH是機體和細胞內抗氧化防御體系中重要的抗氧化酶，起到抗毒抗氧化的作用［8］.MDA是脂質過氧化的重要產物之一，測定MDA含量?？煞从硻C體內脂質過氧化的程度，也是反映組織細胞受自由基攻擊受損嚴重程度的重要指標［5］.因此，檢測此四個指標的含量可以有效反映機體受損傷程度.本研究表明，LS組、GS組CAT、T-SOD、GSH含量均下降且LS組下降幅度大于GS組；LS組、GS組MDA含量均上升且LS組上升幅度大于GS組，說明LS組肺毒性較大，提示氧化-抗氧化失衡，可能受到氧自由基的攻擊，使肺清除氧自由基的能力減弱，并可能引起肺組織損傷.

肉眼觀察肺組織病理學形態(tài)的改變與HE染色結果一致.LS組支氣管周圍有大量以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，肺泡間質內大量充血，部分支氣管腔內有大量紅細胞，有的視野肺組織實質化；GS組支氣管周圍有炎性細胞浸潤，肺泡間質間偶見充血和增生等現(xiàn)象.可見LS組、GS組對大鼠肺均有毒性，且LS組造成的肺組織損傷大于GS組.

ICAM-1在促進炎癥部位的黏連性方面起到重要作用.在受到炎癥因子刺激后，炎癥細胞與內皮細胞間的黏附作用增強，陽性表達增強［9］.本實驗結果顯示，與KB組相比，LS組、GS組肺組織ICAM-1陽性表達均增強，且LS組陽性表達增強更顯著.

在ROS刺激下機體還能通過激活一些特異性的轉錄因子對細胞進行保護，如Nrf2.Nrf2/HO-1途徑是調節(jié)機體抗氧化應激反應的重要信號通路［10］.生理條件下，細胞中Nrf2與Keap1結合在一起，從而阻滯了Nrf2的活性；而在氧化應激條件下，Nrf2與Keap1復合物解體，Nrf2由細胞質進入細胞核，從而啟動ARE調控第II相酶及抗氧化酶的基因進行表達，增強細胞對氧化應激反應的抗性.而ARE調控的抗氧化蛋白包括HO-1等，可進一步被激活，從而促使失衡的氧化還原反應恢復到平衡狀態(tài)，減輕自由基對臟器的損傷.同時，HO-1是一種保護蛋白，有很強的自由基清除能力，其活性直接影響到抗氧化損傷能力的變化［11］.HO-1及其酶解產物膽紅素、CO共同發(fā)揮著抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡等作用.因此，Nrf2、HO-1蛋白表達可以反應機體受損傷程度.實驗結果顯示，與KB組相比，LS組、GS組肺組織中Nrf2、HO-1蛋白表達均降低，LS組Nrf2、HO-1蛋白表達極顯著性降低，GS組蛋白表達無顯著性差異.故可以看出，LS組肺毒性大于GS組.

綜上所述，多項指標均能得出LS組、GS組均具有肺毒性，且LS組肺毒性大于GS組，其毒性機制可能與氧化應激及Nrf2/HO-1通路有關.因此，本實驗可為今后科研人員研究雷公藤和及己根對肺組織毒性提供理論依據，對臨床安全合理用藥有一定的指導作用，為把及己根開發(fā)成較好的抗炎藥打下基礎.