黑苦蕎莖葉對(duì)2型糖尿病小鼠的治療作用及其對(duì)其胰腺、脾臟的影響*

項(xiàng)偉玲，金麗琴△，高 峰，肖 敏，陳 燕

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.浙江省人民醫(yī)院針灸推拿科,杭州 310014)

2型糖尿病臨床上常伴有肥胖癥、血脂異常、高血壓等。由于血液中的糖分升高，患者更容易發(fā)生急性嚴(yán)重代謝紊亂、感染性疾病、慢性并發(fā)癥如微血管病變、大血管病變、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、糖尿病足等并發(fā)癥。長期控制血糖水平在正常范圍是阻止和延緩上述并發(fā)癥等重要途徑。胰島素敏感性降低即胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制度重要環(huán)節(jié)。胰島素敏感組織的葡萄糖攝取量減少和胰島β細(xì)胞功能降低是2型糖尿病的特征性病理生理學(xué)改變?，F(xiàn)代藥理研究表明，普通苦蕎麥具有降血糖、降血脂、清除自由基抗氧化等功能[1-2]，對(duì)心腦血管系統(tǒng)疾病具有輔助治療的作用[3]。黑苦蕎莖葉的主要成分是黃酮，有研究表明[4-5]，苦蕎黃酮具有降低血糖、維持血管抵抗力、抗自由基等功能，其降血糖機(jī)制可能與促進(jìn)胰島素的分泌、提高胰島素與其受體親和力等有關(guān)，提高機(jī)體組織對(duì)胰島素的敏感性，近幾年，有相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)年生成熟的黑苦蕎莖葉為材料提取活性物質(zhì)，對(duì)以四氧嘧啶所致的高血糖小鼠進(jìn)行降血糖研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)四氧嘧啶所致的高血糖小鼠具有較好的降血糖功能[6]。目前，國內(nèi)外專家學(xué)者對(duì)黑苦蕎莖葉對(duì)2型糖尿病的治療及其對(duì)胰臟、脾臟的影響的尚未明確。脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，持續(xù)高血糖會(huì)損壞器官組織，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失調(diào)[7]，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，研究當(dāng)年生成熟的黑苦蕎莖葉為材料，對(duì)鏈脲佐菌素所致高血糖小鼠進(jìn)行降血糖功能以及其對(duì)胰臟、脾臟的影響進(jìn)行研究，以其為黑苦蕎莖葉在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57/B16小鼠40只，周齡8～9周，購自上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

WETRUST康麟血糖儀(訊映光電有限公司)，全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)，CT15RE型臺(tái)式微量高速離心機(jī)(日本日立公司)，NanDrop2000核酸蛋白分析儀(Thermo)，S1000TM Thermal Cycler梯度PCR儀(Bio-Rad)，CFX Connect TM熒光定量PCR檢測(cè)儀(Bio-Rad)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

黑苦蕎莖葉(購自西安利時(shí)生物科技有限公司)，鏈脲佐菌素(購自臺(tái)州艾明康生物有限公司)，蛋白裂解液RIPA(碧云天)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾維贊)，Trizol(invitrogen)，SYBR Green(Bio-Rad)，SYBR Premix Ex Taq II(Takara)，Insulin and actin Primers(上海生工設(shè)計(jì))，小鼠IRS-1、INSR、TNF-α的ELISA試劑盒(購自上海源葉生物科技有限公司)PVDF膜(Millipore Corp，USA)，一抗稀釋液(Beyotime，China),ECL-化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL-plus，ThermoScientific)。

1.4 小鼠模型建立及分組

40只SPF級(jí)雄性C57/BL6小鼠，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC)10只和實(shí)驗(yàn)組30只，NC組喂養(yǎng)普通飼料，實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)高糖高脂飼料(常規(guī)飼料66.5%+20%紅糖+10%豬油+2.5%膽固醇+1%膽酸鹽)。喂養(yǎng)35 d后，將小鼠禁食6 h后，使用腹腔注射法注射40 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ,臨用前用 0.1 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液配成 1%、pH 4.2 的溶液)，72 h后禁食6 h，斷尾取血測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)PG)，F(xiàn)BG大于11.6mmol/L)且小鼠出現(xiàn)三多(多飲、多食、多尿)癥狀，則成功構(gòu)建糖尿病小鼠模型。NC組腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。建模成功后將模型小鼠隨機(jī)分為3組：模型對(duì)照(DM)組、低劑量黑苦蕎莖葉治療(DM+L)組、高劑量黑苦蕎莖葉治療(DM+H)組。

1.5 干預(yù)及標(biāo)本采集

使用生理鹽水溶解黑苦蕎莖葉(濃度為 0.04 g/ml)，DM+L組小鼠灌胃0.21g/kg·d-1黑苦蕎莖葉，DM+H組小鼠灌胃0.42g/kg·d-1黑苦蕎莖葉[6]，NC、DM組則灌胃等量生理鹽水。14 d后，將小鼠禁食6 h，稱量小鼠體重，斷尾取血測(cè)量空腹血糖(FBG)，摘眼球取血0.6 ml血樣，離心后取上清于干凈的離心管中，分別檢測(cè)空腹血清葡萄糖(FBG)、TG、TCH。取各組胰臟、脾臟標(biāo)本并編號(hào)。用電子天平稱量小鼠脾臟質(zhì)量，計(jì)算脾臟系數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體重(g)。部分胰腺組織組織使用4%多聚甲醛固定用于組織包埋，部分組織液氮速凍后保存于-80℃冰箱冷凍保存。

1.6 各組小鼠血清中INS和脾臟組織TNF-α蛋白含量的測(cè)定

使用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血胰島素含量(insulin,INS)和脾臟組織TNF-α蛋白含量。

1.7 胰臟組織的病理學(xué)觀察

取各組胰腺標(biāo)本放入對(duì)應(yīng)編號(hào)的包埋盒并編號(hào)，部分組織使用4%多聚甲醛固定的胰腺標(biāo)本24～48 h，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，切成4 μm切片，將切片后的胰臟組織進(jìn)行HE染色，鏡下觀察并拍照各組胰臟組織形態(tài)變化。

1.8 胰島素受體底物IRS-1蛋白的表達(dá)

通過含有苯甲基磺酰氟的RIPA裂解緩沖液裂解小鼠胰腺組織，使用增強(qiáng)的BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。分離等量的蛋白質(zhì)并通過SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5% BSA封閉,一抗(1∶1 000 稀釋)4℃ 過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000 稀釋)室溫孵育2 h，用ECL-化學(xué)發(fā)光試劑盒使蛋白質(zhì)條帶顯影。

1.9 胰腺組織IRS-1 mRNA表達(dá)量測(cè)定

采用Trizol一步法提取小鼠胰腺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作嚴(yán)格遵照試劑盒說明書，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定IRS-1 mRNA表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參。IRS-1 mRNA 上游引物序列 5’- CGATGGCTTCTCAGACGTG-3’；IRS-1 mRNA 下游引物序列 5’- CAGCCCGCTTGTTGATGTTG-3’。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠生化指標(biāo)比較

與NC組比較，DM組空腹血清FBG、TG、TCH含量均升高,胰島素均降低(P<0.05，表1)；與DM組比較，DM+L組、DM+H組FBG、TG、TCH均下降，胰島素含量均升高(P<0.05)，與DM + L 組相比，DM + H 組小鼠FBG、TG、TCH下降無顯著差異(P>0.05,表1)。

Tab. 1 Comparison of biochemical indicators among the four groups n=10)

NC:Normal control;DM:Diabetes model control;DM+H:Diabetes model control with high black tartary buckwheat;DM+L:Diabetes model control with low black tartary buckwheat;FBG:Fasting blood glucose;TG:Triglycerides;TC:Total cholesterol
*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group

2.2 四組小鼠胰腺組織病理學(xué)檢查

胰腺組織切片鏡下觀察：正常對(duì)照組胰島為圓形、橢圓形細(xì)胞團(tuán)，邊界清除，胰島數(shù)及胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)較多，胰島內(nèi)分泌細(xì)胞大小一致，胞質(zhì)豐富，核染色質(zhì)清晰；模型對(duì)照組胰島內(nèi)分泌細(xì)胞排列稀疏不均，大部分細(xì)胞核淡染，少數(shù)細(xì)胞呈空泡狀；高劑量組胰島數(shù)及胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯增多，細(xì)胞分布不均勻，核大小基本相等，無核固縮；低劑量組胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)增多形態(tài)較為規(guī)則，結(jié)構(gòu)基本正常，胞漿均勻無空泡，核仁較清晰，細(xì)胞排列較均勻，少部分核固縮(圖1)。

Fig.1Comparisons of hematoxylin-eosin(HE)staining on pancreas tissues in four groups(×200)

2.3 四組胰腺組織IRS-1 mRNA表達(dá)比較

與NC組比較，DM組、DM+H組、DM+L組小鼠胰腺IRS-1 mRNA 表達(dá)均降低(P<0.05)；與DM組比較，DM+L組、DM+H組小鼠胰腺IRS-1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，與DM+L組相比，、DM+H組IRS-1 mRNA表達(dá)無顯著性差異(P>0.05,圖2)。

Fig.2Comparison of IRS-1 mRNA expression in the tissues among four groups
NC:Normal control;DM:Diabetes model control;DM+H:Diabetes model control with high black tartary buckwheat;DM+L:Diabetes model control with low black tartary buckwheat;IRS-1:Insulin receptor substrate-1
*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group

2.4 四組小鼠胰腺組織中胰島素受體底物IRS-1蛋白表達(dá)的檢測(cè)

與NC組比較，DM組小鼠胰腺組織中IRS-1的蛋白水平均降低(P<0.05);與DM組比較，DM+H組、DM+L組小鼠胰腺組織中的IRS-1的蛋白表達(dá)水平升高，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與DM+L組相比，DM+H組IRS-1蛋白表達(dá)無顯著性差異(P>0.05，圖3)。

Fig.3The comparison of IRS-1 expression in the pancreas tissues among four groups
NC:Normal control;DM:Diabetes model control;DM+H:Diabetes model control with high black tartary buckwheat;DM+L:Diabetes model control with low black tartary buckwheat;IRS-1:Insulin receptor substrate-1
*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group

2.5 四組小鼠脾臟TNF-α和脾臟系數(shù)的檢測(cè)

與NC相比，DM組、DM+H組、DM+L組小鼠TNF-α升高、脾臟系數(shù)明顯降低(P<0.05，表2)；與DM組相比，DM+H組、DM+L組小鼠的TNF-α平均值明顯降低，脾臟系數(shù)明顯升高，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與DM+L組相比，、DM+H組脾臟TNF-α和脾臟系數(shù)無顯著性差異(P>0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of TNF-α level in spleen tissue and spleen coefficient among the four groups n=10)

NC:Normal control;DM:Diabetes model control;DM+H:Diabetes model control with high black tartary buckwheat;DM+L:Diabetes model control with low black tartary buckwheat;TNF-α:Tumor necrosis factor α
*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group

3 討論

2型糖尿病是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是世界的常見病、多發(fā)病，是嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。有研究發(fā)現(xiàn)，黑苦蕎莖葉中含有豐富的亞油酸、蘆丁、槲皮素、微量元素、維生素、植物固醇等[8]。氧化應(yīng)激在糖尿病的慢性復(fù)雜病變中扮演著重要角色，隨著研究進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激水平的升高與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)[9,10]。大量的證據(jù)以及顯示具有強(qiáng)抗氧化性質(zhì)的混合物發(fā)揮有益的作用來對(duì)抗高糖、胰島素抵抗和氧化應(yīng)激[11-12]，這被認(rèn)為是一個(gè)可以阻止糖尿病發(fā)生和/或者治療糖尿病的有效途徑[13-14]。黑苦蕎莖葉的主要成分是黃酮類物質(zhì)，主要是蘆丁和槲皮素類[8]，已被證實(shí)可以通過保護(hù)胰腺β細(xì)胞的完整性，重建肝臟的抗氧化狀態(tài)，增加葡萄糖轉(zhuǎn)移酶4轉(zhuǎn)移[15-17]，從而降低血清血糖。槲皮素，也已經(jīng)被證實(shí)可以在糖尿病機(jī)體中通過抑制肝臟血糖產(chǎn)生，增加葡萄糖吸收，加強(qiáng)胰島素分泌，通過ERK1/2路徑保護(hù)胰腺β細(xì)胞INS-1對(duì)抗氧化應(yīng)激而發(fā)揮降糖的作用[18]。

本實(shí)驗(yàn)選取用高糖高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)并注射鏈脲佐菌素(STZ)所構(gòu)造的2型糖尿病小鼠模型作為研究對(duì)象，給予黑苦蕎莖葉灌胃治療，通過觀察2型糖尿病小鼠血清生化指標(biāo)、胰腺病理形態(tài)改變、脾臟系數(shù)計(jì)算、TNF-α蛋白表達(dá)、胰島素受體底物IRS-1蛋白表達(dá)以及胰腺IRS-1 mRNA表達(dá)情況探討黑苦蕎莖葉對(duì)2型糖尿病小鼠胰腺機(jī)理的治療作用。用藥干預(yù)后，鏡下觀察胰腺組織病理學(xué)切片，可見BBL治療組小鼠組織基本緊密、飽滿，胰島體積略小，與DM組相比胰腺組織明顯恢復(fù)，更接近正常胰島細(xì)胞。血清生化指標(biāo)及ELISA結(jié)果提示，與DM組相比，BBL治療組的血糖、血脂明顯降低，胰島素水平明顯升高。與DM小鼠比較，BBL治療組小鼠IRS-1 mRNA的表達(dá)量明顯上升，IRS-1蛋白表達(dá)水平明顯升高。上述結(jié)果提示口服黑苦蕎莖葉可通過上調(diào)IRS-1 mRNA和IRS-1蛋白表達(dá)水平來增強(qiáng)胰島素作用，對(duì)修復(fù)和維持糖尿病小鼠胰腺β細(xì)胞正常功能有一定作用，黑苦蕎莖葉可以一定程度上修復(fù)部分胰島功能，提高血清胰島素濃度，來降低血糖，改善血脂質(zhì)譜。脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，持續(xù)高血糖會(huì)損壞器官組織，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失調(diào)[7]。由表2數(shù)據(jù)可知，DM組的脾臟系數(shù)明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)，可見脾臟系統(tǒng)明顯萎縮，免疫功能可能已受到影響。DM+H組和DM+L組的脾臟系數(shù)均高于糖尿病組(P>0.05),說明BBL對(duì)脾臟具有保護(hù)作用，并且通過保護(hù)脾臟來調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫功能，進(jìn)而抵御氧化應(yīng)激對(duì)胰島β 細(xì)胞的損傷。研究表明，長期吃高脂肪食物會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，尤其是腸道中革蘭陰性菌增加，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)釋放，產(chǎn)生大量內(nèi)毒素，破壞腸道黏膜，造成腸壁滲漏，并可吸收入血，進(jìn)一步刺激免疫細(xì)胞分泌炎癥因子如TNF-α,以炎癥因子升高為特征的慢性低度炎癥與代謝異常密切相關(guān)，最終可引起2型糖尿病胰島素抵抗[19，20]。在本研究中，DM組的TNF-α明顯高于CN組(P<0.05),可見模型組小鼠機(jī)體內(nèi)的慢性炎癥更加嚴(yán)重，而經(jīng)過BBL治療的DM+H組和DM+L組的TNF-α明顯降低，說明BBL具有降低炎癥，改善代謝異常的作用。

綜上所述，本研究觀察了黑苦蕎莖葉對(duì)2型糖尿病模型小鼠的治療作用，通過病理學(xué)觀察、血生化指標(biāo)觀察和胰腺相關(guān)指標(biāo)的觀察，證明黑苦蕎莖葉可以降低血糖、改善脂質(zhì)、促進(jìn)胰島素分泌、提高胰島素敏感性、增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，對(duì)糖尿病小鼠的胰腺、脾臟有一定的保護(hù)作用，對(duì)于未來糖尿病的預(yù)防和治療，將會(huì)有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。