急性臭氧暴露對大鼠肺部細胞遺傳毒性的影響*

李 寧，楊 虎，方 振，王萍玉，韓 潔，田 蕾，閆 峻，襲著革△，劉曉華△

(1.濱州醫(yī)學院公共衛(wèi)生與管理學院，山東 煙臺 264000；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院環(huán)境醫(yī)學與作業(yè)醫(yī)學研究所，天津 300050；3.大連大學附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連116001)

臭氧(O3)是氮氧化物和揮發(fā)性有機物的二次污染物。近年來，光化學反應造成的大氣O3污染逐漸變得較為嚴重，其主要來源是光化學煙霧，其次還可來源于消毒過程中紫外燈的使用等。據(jù)調查顯示，O3已逐步取代PM2.5成為某些城市夏季空氣中的主要污染物[1]。O3是一種具有高度反應性的氧化性氣體，不易溶于水，能夠通過呼吸道進入肺部，造成生物大分子如DNA的損傷[2]。已有研究表明，臭氧對植物、體外培養(yǎng)的微生物和細胞具有遺傳毒性，關于體外培養(yǎng)細胞的研究多集中于對淋巴細胞、A549細胞系、骨髓細胞等[3,4]，對體內肺部細胞的遺傳毒性研究相對較少，且僅局限于某一個水平探討引起的遺傳毒性。因此，本文將在建立不同濃度臭氧急性暴露模型基礎上，從DNA水平及染色體水平探究臭氧急性暴露對大鼠肺部細胞的遺傳毒性。從多個水平探究遺傳毒性隨著臭氧濃度增加致肺部細胞遺傳毒性的影響，為人類暴露于臭氧條件下致機體肺部細胞損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

臭氧發(fā)生器(型號FW-120，Vonti，China)；臭氧濃度檢測儀(型號1003 AH，CA，Glendale)；全波長酶標儀(型號SpectraMax M5e,美國MD)；電泳儀(型號DYY-6C，北京六一儀器長)；熒光倒置顯微鏡(型號Axio Observer D1，蔡司)；8-OHdG檢測酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(博奧拓達公司)，彗星實驗試劑盒(美國Trevigen公司)、PI(Solarbio公司)、Giemsa染液(Solarbio公司)及其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗動物分組及處理

Wistar雄性大鼠，體重175～205 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學研究院環(huán)境醫(yī)學與作業(yè)醫(yī)學研究所動物房。將72只Wistar雄性大鼠隨機分為對照組(control,n=6)、暴露組(ppm，0.12,0.5,1.0,2.0,4.0)，每組n=6。大鼠置于密閉箱中，對照組接受空氣暴露、暴露組接受臭氧制造儀生產的臭氧暴露，持續(xù)4 h。暴露結束24 h后，大鼠腹腔注射4%水合氯醛進行麻醉，取肺組織進行各項指標的測定。

1.3 肺組織單細胞懸液制備

取右肺尖，用冰預冷的PBS清洗3次，眼科剪剪碎，組織勻漿后，加入2 ml冰預冷的PBS，200目不銹鋼網篩過濾，收集濾液，3 000 r/min 4℃離心5 min，棄去上清，用冰預冷的PBS洗滌3次，制成單細胞懸液。PBS調節(jié)細胞濃度至105cells/ml。臺盼藍染色計數(shù)細胞的存活率(>90%)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法，按照試劑盒說明書對肺組織中8-OHdG進行定量檢測。

1.5 彗星實驗

制備1%正常融點瓊脂糖預處理的磨砂玻片，將20 μl肺組織單細胞懸液與200 μl 1.5%低熔點瓊脂糖混合后鋪在預處理的磨砂玻片上，固化條件為4℃，10 min。將制好的玻片浸入冰預冷的堿性裂解緩沖液(2.5% SDS和25 mM EDTA，pH=13)中20 min，用PBS洗滌3次。將其置于電泳緩沖液(30 mmol/L NaOH和1 mmol/L EDTA)中，21V、250 mA下電泳20 min。電泳結束后，將載玻片置于中和緩沖液中漂洗20 min，避光條件下進行碘化丙啶染色。24 h內在熒光顯微鏡下進行觀察并拍照記錄。每張載玻片上隨機計數(shù)100個細胞，放大倍數(shù)為200，用CASP軟件進行分析。

1.6 微核實驗

將肺組織單細胞懸液涂于干凈的載玻片上，自然晾干后，插入含甲醇固定液的槽中固定10 min，取出后放入Giemsa染色液中染色15 min，超純水沖洗，晾干，油鏡下觀察計數(shù)。遵循最常用的方法，即Z字形方法來篩選載玻片。在每張載玻片上計數(shù) 1 000個具有完整細胞核和細胞邊界的細胞。從 1 000個完整的細胞中計數(shù)MN的數(shù)量。

1.7 DNA-蛋白質交聯(lián)實驗

取0.5 ml肺組織制備好的單細胞懸液，加入 0.5 ml SDS溶液，輕輕搖勻，65℃水浴加熱10 min。將100 μl Tris-HCl-KCl溶液加入到上述溶液中。充分混合后，將液體倒入1 ml聚丙烯移液器吸頭中，重復上述步驟7次，使DNA長度一致。冰上預冷5 min，4℃ 10 000 r/min離心5 min，將上清液轉移到另一個離心管中保存。向沉淀中加入1 ml洗滌緩沖液,65℃水浴加熱10 min。冰上預冷5 min。4℃，10 000 r/min離心5 min，收集上清到另一離心管中。向上述沉淀中加入0.5 ml洗滌緩沖液和0.5 ml蛋白酶K溶液，充分混勻。60℃水浴中加熱3 h，冰上驟冷5 min。4℃，12 000 r/min離心10 min,收集上清。用洗滌緩沖液制備各濃度的小牛胸腺DNA溶液1 ml，使其終濃度為0、50、150、250、375、500、750、1000、1500、2500 ng/ml，分別加入1 ml新鮮制備的Hoechst33258溶液(400 ng/ml)，混合均勻后，測量各組溶液的熒光強度，繪制DNA濃度標準曲線。取上述第三、四步驟中離心管的上清液并加入1 ml新鮮制備的Hoechst 33258溶液?；旌暇鶆蚝螅谙嗤瑮l件下測量熒光值。DNA和蛋白質交聯(lián)率計算公式：DNA-蛋白質交聯(lián)率=交聯(lián)DNA含量/(交聯(lián)DNA含量+游離DNA含量)。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 急性臭氧暴露對大鼠肺組織內8-OHdG含量的影響

由于臭氧具有強氧化性，8-OHdG是DNA氧化損傷的產物，通常檢測8-OHdG的含量可以反映出DNA氧化損傷程度。隨著臭氧濃度的升高，肺組織內8-OHdG的含量逐漸升高，0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm及4.0 ppm臭氧暴露組與對照組相比均有顯著性差異，且在臭氧濃度為4.0 ppm時達到最大值(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Changes in 8-OHdG content in lung tissues of rats exposed to different concentrations of ozone n=6)

*P<0.05vscontrol group

2.2 臭氧急性暴露對大鼠肺部細胞DNA斷裂的影響

熒光顯微鏡下觀察，對照組未見拖尾的細胞，只有完整的頭部，表明細胞未發(fā)生DNA斷裂；臭氧暴露組均可觀察到拖尾的細胞，斷裂的DNA游動移出細胞核外，形成尾部，形似彗星(圖1)。采用軟件分析圖片顯示，隨著臭氧濃度的增大，0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm及4.0 ppm暴露組的拖尾數(shù)量及拖尾長度均顯著升高(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of tail length and tailing rate of lung cells in rats exposed to different concentrations of ozone n=6)

*P<0.05vscontrol group

2.3 急性臭氧暴露對大鼠肺部細胞內DNA-蛋白質交聯(lián)率的變化

DNA-蛋白質交聯(lián)(DNA-protein crosslink,DPC)是指DNA鏈通過共價鍵的作用與蛋白質穩(wěn)定的結合在一起，是一種較為嚴重的DNA損傷形式。與對照組相比，0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm及4.0 ppm臭氧暴露組大鼠肺部細胞內DNA-蛋白質交聯(lián)率均顯著性增加(P<0.05)，且在2.0 ppm時達到最大值(圖2)。

Fig.2DNA-protein cross-linking rate in rats exposed to different concentrations of ozone
*P<0.05vscontrol group

2.4 急性臭氧暴露對肺部細胞染色體水平的影響

0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm及4.0 ppm臭氧暴露組大鼠肺部細胞微核率分別為 1.4‰，1.6‰，2.0‰，2.4‰，3.0‰和3.2‰，微核率的發(fā)生與對照組相比均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但均隨著臭氧濃度的升高，微核的發(fā)生率增加。

3 討論

本實驗旨在探究急性臭氧暴露對肺部細胞的遺傳毒性。我們選用6個濃度進行探究，具體計算方法參照GBz/T240“化學毒理學評價程序標準和測試方法”。最大劑量為4.0 ppm，組間關系一般為2倍，選擇4～5組。平均1.0 ppm/8 h是我國環(huán)境空氣質量標準，平均0.12 ppm/1 h是美國EPA的法定標準。研究表明，極低水平的O3暴露(0.1 ppm)即可誘導體外細胞DNA單鏈斷裂。所以我們選用的臭氧濃度為0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm和4.0 ppm。臭氧是一種常見的城市空氣污染物，是一種高活性氧化劑。臭氧的毒理作用歸因于它能夠通過直接或間接引起膜脂和蛋白質氧化和過氧化的能力[5]，不易溶于水，能夠通過呼吸道進入肺部，引起生物大分子如DNA的損傷[2]，為此，我們將肺部細胞作為研究對象進行探究。

本文采用ELISA法檢測DNA氧化損傷的產物8-OHdG，采用彗星實驗檢測DNA斷裂損傷，應用KC1-SDS沉淀法對DNA-蛋白質的交聯(lián)情況進行測定；采用微核試驗檢測染色體損傷情況。在DNA氧化損傷方面，臭氧具有強氧化性，8-OHdG是主要的DNA氧化產物。已經在臭氧污染城市的人們的呼吸道上皮細胞和尿液中以及暴露于吸入臭氧的小鼠的尿液中被鑒定，并且已經被提出可作為由環(huán)境空氣誘導的氧化性DNA損傷的生物標志物污染[6]。將Wistar大鼠暴露于2 ppm O3數(shù)小時后，結果發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細胞中8-OHdG的表達增多，表明支氣管上皮細胞是氧化性DNA損傷的靶細胞[7]。同樣的，在我們的研究中肺組織細胞內的8-OHdG水平隨著臭氧濃度的升高也有顯著性升高。在DNA斷裂損傷方面，彗星實驗也稱為單細胞凝膠電泳實驗，彗星試驗首先由Ostling和Johanson提出，用于直接觀察單個細胞中的DNA損傷。彗星尾巴是由破碎的帶負電的DNA分子從彗星頭(核心)中被拉出，并向陽極遷移形成的。尾巴的長度與DNA鏈斷裂的數(shù)目有關。是一種在單細胞水平上檢測并定量分析DNA單/雙鏈斷裂情況的較為靈敏的方法，且對檢測的細胞需求量較小、也不需細胞處于特定的時期，因此已經被廣泛用于遺傳毒性相關的檢測[8]。有大量的實驗已經證明O3在L929成纖維細胞，肺泡巨噬細胞以及豚鼠和人的氣管上皮細胞中引起DNA單鏈斷裂(SSB)和/或雙鏈斷裂(DSB)，其中O3濃度范圍為 0.3至5.0 ppm。段麗菊等[2]用1 ppm的O3暴露雄性BALB/c小鼠，染毒3 h和24 h后，暴露組肺細胞DNA斷裂損傷顯著高于對照組。在我們的實驗中也有同樣的發(fā)現(xiàn)。DNA-蛋白質交聯(lián)(DPC)是指DNA鏈通過共價鍵的作用與蛋白質穩(wěn)定的結合在一起，是一種較為嚴重的DNA損傷形式。正常生理狀態(tài)下，各細胞為維持其生命活動DNA與蛋白質存在一定的聯(lián)系，即存在一定的DPC本底值，當外源性因素對機體造成影響時，體內的DPC升高，導致DNA的生理功能受到抑制或改變，從而產生遺傳性損傷。通常情況下DPC發(fā)生在DNA單鏈上，因此當DPC形成并升高后，DNA正常的復制和轉錄就會受到其阻礙，對DNA的構象和功能也會發(fā)生一定程度的影響，并且引起染色體異常、基因突變或重于基因的丟失等，最終導致細胞死亡和疾病的發(fā)生。DPC作為一種嚴重的遺傳性損傷，由于其較難修復或修復錯誤，且在細胞周期中存在時間長便于檢測，已被作為一種典型的生物標志物廣泛用于評價受試物的分子遺傳毒性[9]。

微核(micronucleus,MN)起源于染色體片段或整個染色體，它們在核分裂期間不包含在主核中。MN在分裂細胞中的形成是由于未修復或錯配的DNA損傷導致的染色體斷裂或由于有絲分裂故障引起的染色體異常分離造成的。它是染色體畸變在間期細胞中的一種表現(xiàn)形式。因此，微核率的高低間接體現(xiàn)了染色體畸變發(fā)生率的大小，從而對染色體的受損傷情況進行判斷。微核試驗是評價受試物遺傳毒性的一個重要指標，現(xiàn)已被廣泛用于評價輻射損傷、化學誘變劑及癌癥前期診斷等各個方面。在染色體損傷水平，大多數(shù)實驗研究對象均是淋巴細胞，Zelac R E等[10]在動物的外周淋巴細胞中觀察到染色體畸變和/或姐妹染色單體交換。但是，在我們的實驗中，隨著臭氧濃度的升高，染色體損傷的程度有升高的趨勢，但較對照組相比均無統(tǒng)計學差異。

在我們選取的臭氧范圍內，較低濃度下即可引起DNA斷裂及DNA-蛋白質交聯(lián)。在臭氧濃度為0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm及4.0 ppm均可引起DNA斷裂損傷，而DNA-蛋白質交聯(lián)率隨著濃度的增加出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，說明當染毒劑量超過一定限制時，由其所引起的DNA-蛋白質交聯(lián)率增高的效應有所下降，原因可能是臭氧通過多種效應作用于DNA如 DNA斷裂,DNA 堿基突變,DNA-DNA 交聯(lián),DNA-蛋白質交聯(lián)等,在不同的染毒劑量下,各種機制作用所占的比重存在有差異,從而表現(xiàn)出不同的主要效應?？傊?，本研究利用不同的方法分別從DNA水平和染色體水平探討了急性臭氧暴露對大鼠肺部細胞的遺傳毒性。結果顯示：較低的臭氧濃度即可引起肺部細胞的DNA損傷，而較高的臭氧濃度仍未見引起染色體水平的損傷，因此，對于臭氧急性暴露的肺部遺傳毒性應重點關注其對細胞DNA的損傷及可能的機制。

綜上所述，急性臭氧暴露對大鼠遺傳毒性的影響，在DNA斷裂方面，臭氧濃度越大，斷裂損傷越大，而DNA-蛋白質交聯(lián)方面，隨著臭氧濃度的變化，出現(xiàn)先升高后下降的趨勢。所以，臭氧致肺細胞遺傳毒性方面，不同的水平進行分開檢測與描述。