烏賊墨黑色素粗提物的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化能力測定

何 健，劉 娥，李小娟，陸澤焱，廖祖華，戴金玉，高益槐

[安發(fā)(福建)生物科技有限公司，福建省天然生物活性物質(zhì)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 寧德 352100]

本文研究對象為頭足類海洋生物(魷魚、烏賊、章魚等)的墨囊中的黑色素，屬于一種典型的以5，6-二羥基吲哚(DHI)和5，6-二羥基吲哚酸(DHICA)為前體的真黑色素[1]。此黑色素來源于頭足類動物的墨汁中，故定名為墨黑色素。中國烏賊種類較多，東海盛產(chǎn)曼氏無針烏賊(Sepiellamaindroni)，分布于浙江南部沿海及福建沿海[2]。烏賊墨囊約占個體質(zhì)量的1.3%，在產(chǎn)品加工過程中其大多被作為廢棄物，這不僅是對資源的浪費(fèi)，而且對環(huán)境水質(zhì)造成破壞。黃偉卿等[3]對曼氏無針烏賊墨的營養(yǎng)成分分析發(fā)現(xiàn)，粗蛋白、粗脂肪和粗多糖分別占11.82%、1.53%和1.56%，還含有氨基酸、無機(jī)鹽等豐富的營養(yǎng)成分。試驗(yàn)研究表明，墨黑色素具有光保護(hù)、清除自由基、抗氧化、抗腫瘤等生物活性[4-8]。

目前黑色素的制備方法主要有酸水解法、堿水解法、水洗法、高速離心法及酶解法，其中酸解、堿解的反應(yīng)劇烈，對墨黑色素的結(jié)構(gòu)和活性破壞大；水洗、高速離心只能去除水溶性組分，墨黑色素純度不高，水溶性差[9]；酶解法由于反應(yīng)條件溫和，對墨黑色素生物活性物質(zhì)破壞較小，能有效分離與墨黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)，同時隨著近年來酶制劑的迅猛發(fā)展，因此其在工業(yè)中得到更廣泛的應(yīng)用[10]。而超聲處理可對黑色素的物理結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，電鏡結(jié)果顯示黑色素微球顆粒在超聲處理后形成了更細(xì)小的碎片和碎末[11]，會更有利于酶解反應(yīng)充分快速進(jìn)行。因此，本試驗(yàn)以烏賊墨粉的水解度為考察指標(biāo)，采用超聲波輔助蛋白酶水解烏賊墨粉，篩選水解效果好的蛋白酶，同時通過單因素和正交試驗(yàn)對水解條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最適反應(yīng)pH、加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、固液比，并對制得的水解后墨黑色素進(jìn)行2，3，5-三羧酸吡咯(Pyrrole-2，3，5-tricarboxylic acid，PTCA)含量測定和總抗氧化能力研究，以對此超聲波輔助蛋白酶水解制備墨黑色素方法進(jìn)行評價。對烏賊墨黑色素的制備工藝進(jìn)行研究，不僅能為海洋生物活性物質(zhì)開發(fā)開拓新來源，更能促進(jìn)我國漁業(yè)水產(chǎn)品加工高值化利用的發(fā)展，具有重大的經(jīng)濟(jì)價值和社會意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

曼氏無針烏賊墨囊，寧德市南海水產(chǎn)有限公司；木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶(食品級)，南寧龐博生物科技有限公司；甲酸、甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

雷磁pHs-3c型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

SCIENTZ-30ND型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；

KQ-700DE型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；

LG-21M冷凍離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；

TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

E3100高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 墨粉的制備

烏賊墨囊室溫解凍后，去除墨囊表皮膜，置于托盤中，逐級真空冷凍干燥72 h，制得干燥墨粉，密封保存?zhèn)溆谩８稍锏哪勰鼙ＷC試驗(yàn)原料的穩(wěn)定性和均一性，有利于后續(xù)試驗(yàn)的開展。

1.3.2 蛋白酶的篩選

分別選用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶在相同蛋白酶量、水解時間1 h以及相應(yīng)合適的pH、溫度下超聲波輔助水解墨粉。水解后加熱至90℃保持5 min，使酶失去活性，8 000 r/min離心10 min，取上清液測定水解度。

1.3.3 水解度測定

采用甲醛電位滴定法測定水解后游離氨基酸總氮量，采用自動凱氏定氮法測定墨粉中總氮量，計算蛋白酶對烏賊墨粉的水解度。

水解度/%=水解后游離氨基酸總氮量/原料總氮量×100%

水解度越大，表示蛋白酶對墨粉中蛋白質(zhì)水解程度越高，即更有利于墨黑色素的純化制備。

1.3.4 酶解條件單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

選擇最適的蛋白酶，以水解度為考察指標(biāo)，進(jìn)行酶解反應(yīng)pH值、溫度、時間、加酶量、固液比的單因素試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行五因素四水平L16正交試驗(yàn)，確定墨粉水解的最佳酶解條件。正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 水解后墨黑色素氧化產(chǎn)物PTCA含量測定

在堿性過氧化氫條件下，墨黑色素中的DHICA被氧化為PTCA，通過HPLC法測定處理后墨黑色素中氧化產(chǎn)物PTCA含量。

標(biāo)準(zhǔn)品為Toronto Research Chemicals公司生產(chǎn)的PTCA。精密稱取PTCA標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1%甲酸配制母液，并稀釋為梯度濃度溶液，以分析物峰面積(A)對分析物濃度(C)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A=168.38C-78.96，R2=0.999 9。

供試樣品的氧化處理：稱取墨黑色素樣品10 mg，添加950 μL 1 mol/L K2CO3和50 μL 30%H2O2，加熱到90℃ 90 min，流水冷卻后，加入100 μL 10%Na2SO3終止反應(yīng)，加入6 mol/L HCl調(diào)pH值至2.6左右。在12 000 r/min離心10 min，過0.45 μm濾膜，注入HPLC分析測定。

色譜條件為色譜柱：E2720002(250 nm×4.6 nm，5 μm)；流動相：1%甲酸(A)-甲醇(B)；檢測波長：270 nm，進(jìn)樣量：20 μL，流速：0.5 mL/min[12]。

1.3.6 水解后墨黑色素總抗氧化能力測定

總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒用于測定對象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平。作用原理：在酸性環(huán)境下，物質(zhì)還原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ的能力反映了其總抗氧化能力。

總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，具體試驗(yàn)方法依照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

在相同蛋白酶量、水解時間及相應(yīng)合適的pH、溫度下水解墨粉，比較不同蛋白酶對墨黑色素水解度大小，結(jié)果見表2。

表2 不同蛋白酶水解墨粉水解度的比較

通過蛋白酶的水解作用，將墨粉中與墨黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)水解為可溶解的游離氨基酸，可獲得更高純度的墨黑色素。試驗(yàn)結(jié)果表明，在pH 3.0、溫度45℃條件下超聲波輔助酸性蛋白酶水解墨粉的水解度最高(6.44%)。與其他蛋白酶比較，在相同的酶解反應(yīng)時間下，酸性蛋白酶水解墨粉的水解度最高，故選用酸性蛋白酶進(jìn)行水解條件優(yōu)化。

2.2 酶解條件單因素試驗(yàn)

依據(jù)酸性蛋白酶的特性和工藝條件，設(shè)計單因素試驗(yàn)，分別考察酶解反應(yīng)pH值、溫度、時間、加酶量、固液比對蛋白酶水解墨粉的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖1。

圖1a表明，反應(yīng)pH在2.0～3.5時墨粉水解度較高；反應(yīng)pH大于3.5時，墨粉水解度顯著下降，這與酸性蛋白酶活性下降有關(guān)。圖1b結(jié)果顯示，溫度過高或過低均不利于墨粉水解，在45℃時測得墨粉水解度最高。由圖1c可知，在反應(yīng)進(jìn)行0～2 h內(nèi)，水解度隨反應(yīng)時間延長而增大，而在2 h后水解度隨反應(yīng)時間延長而降低，這是因?yàn)槊复俜磻?yīng)需要足夠的反應(yīng)時間，而當(dāng)達(dá)到足夠的酶解反應(yīng)時間后，溶液達(dá)到飽和，所以水解度不再增加。圖1d結(jié)果顯示，當(dāng)酸性蛋白酶添加量低于2%時，墨粉水解度隨加酶量的增加快速增大，當(dāng)加酶量大于2%時，水解度出現(xiàn)少量下降，這是因?yàn)榉磻?yīng)pH值、溫度、時間、固液比均固定時，加大酶量即增加蛋白質(zhì)被酶切的概率，但當(dāng)加酶量達(dá)到一定量后，而反應(yīng)底物并未增加，所以水解度不會再因增加蛋白酶的量而繼續(xù)增大。圖1e表明，固液比過高或過低均不利于墨粉水解，當(dāng)固液比為1∶15時測得水解度最高，這是由于墨粉比例過大，使得墨粉分布不均勻，降低酶解效率，而溶液比例過大，會影響超聲波效率，使得水解度降低。單因素試驗(yàn)結(jié)果分析表明酸性蛋白酶水解墨粉最適反應(yīng)pH為3.0，最適反應(yīng)溫度為45℃，最佳反應(yīng)時間為2 h，最佳加酶量2%，最佳固液比1∶15。

2.3 酶解條件正交試驗(yàn)

在酸性蛋白酶水解墨粉的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行五因素四水平L16(45)正交試驗(yàn)，優(yōu)化墨粉水解的酶解條件，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 酸性蛋白酶水解墨粉L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表3極差R值反映出對墨粉水解度影響最大的條件是反應(yīng)pH，水解最佳條件為A4B3C3D4E2，即酶解溫度50℃、水解時間2 h、加酶量3.0%，反應(yīng)pH 3.5，料液比1∶15。在此最優(yōu)條件下對墨粉進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證水解試驗(yàn)，測得水解度為11.45%，高于正交試驗(yàn)結(jié)果的最高值9.77%，說明經(jīng)過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的水解條件是合理的。并以此最佳酶解條件對墨粉進(jìn)行水解，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，進(jìn)行冷凍干燥，制得水解后墨黑色素。

2.4 水解后墨黑色素氧化產(chǎn)物PTCA含量測定

按照1.3.4中色譜條件測定供試品溶液和PTCA對照品溶液，分離情況如圖2和圖3所示。分析計算其峰面積，換算PTCA含量為17.621 μg/mg。高翔等[13]通過高速離心法制備得到魷魚墨黑色素，測定其墨黑色素氧化產(chǎn)物PTCA含量為9.479 μg/mg。雖然本文采用超聲波輔助酶解法有效水解了墨黑色素蛋白質(zhì)，使墨黑色素氧化產(chǎn)物PTCA含量得到提高，但不同頭足類動物墨汁中墨黑色素含量的比較還未有文獻(xiàn)資料報道，不能確定不同原料對PTCA含量的影響，還需進(jìn)一步試驗(yàn)分析。

2.5 水解前后墨黑色素總抗氧化能力的測定

以Fe2+終濃度A吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=16.633x-0.001 7(R2=0.999 7)。通過將樣品測定吸光值帶入方程求得x(μmol/mL)。

活力單位定義：樣品的抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度變化值所需的標(biāo)準(zhǔn)液離子Fe2+濃度表示。

水解前后總抗氧化能力測定見表4，烏賊墨粉經(jīng)過超聲波輔助蛋白酶水解，冷凍干燥制得水解后墨黑色素的抗氧化能力為18.9 U/g，此方法保持了樣品99%的抗氧化能力。故超聲波輔助蛋白酶可有效水解墨粉，同時能保留其抗氧化能力。

3 結(jié)論

在超聲波輔助酶水解烏賊墨粉的試驗(yàn)中，酸性蛋白酶具有強(qiáng)于木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的水解能力。通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化得到酸性蛋白酶酶解烏賊墨粉的最佳條件為水解溫度50℃、時間2 h、加酶量3.0%，反應(yīng)pH 3.5，料液比1∶15，在此最優(yōu)條件下對墨粉進(jìn)行水解試驗(yàn)，測得水解度為11.45%。HPLC測定水解后墨黑色素氧化產(chǎn)物PTCA含量為17.621 μg/mg，水解后墨黑色素總抗氧化能力(T-AOC)為18.9 U/g，總抗氧化能力保持率為99%。