福建與山東、遼寧養(yǎng)殖仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異分析

陸 振

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

仿刺參為北方自然分布種，隨著“北參南養(yǎng)”的規(guī)模不斷擴(kuò)大，福建省仿刺參養(yǎng)殖規(guī)模躍居全國第三，2017年福建省仿刺參養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到27 935 t，全國總產(chǎn)量為219 907 t[1-2]。我國國土幅員遼闊，以秦嶺-淮河為界劃分為南、北方，南、北方在氣候、水文、習(xí)俗等諸多方面都存在較大的差異。腸道菌群是腸道的重要組成部分，受自然環(huán)境差異、養(yǎng)殖模式差異、餌料差異等因素的影響，南移后的仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)是否還保持與北方養(yǎng)殖品種一致，亦或者有自己獨特的菌群結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步研究[3-8]。

為確定南移仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的特異性，文章對我國主要仿刺參養(yǎng)殖產(chǎn)區(qū)(福建、山東、遼寧)所養(yǎng)殖的仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比分析。從山東煙臺、遼寧大連等地購進(jìn)與本地(莆田、霞浦)同等規(guī)格的仿刺參，采用Miseq高通量測序技術(shù)對幾個產(chǎn)區(qū)的仿刺參樣本的腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，旨在為今后進(jìn)一步研究仿刺參腸道菌群與其攝食、消化、免疫等之間的關(guān)系提供了新的資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用仿刺參取自大連池塘養(yǎng)殖場、煙臺池塘養(yǎng)殖場、福建霞浦海上吊籠養(yǎng)殖漁排、福建莆田池塘養(yǎng)殖場，選擇體色正常、體質(zhì)健壯、體表無損傷，個頭大小均勻，養(yǎng)殖周期相同的個體用于實驗研究。

1.2 試劑、材料和儀器

細(xì)菌DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)，超微量分光光度計(Nano drop 2000，美國Thermo Scientific公司)，Miseq高通量測序和生物信息學(xué)分析(委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成)。

1.3 樣品采集方法

在無菌環(huán)境下，實驗用仿刺參體表用75%酒精沖洗2～3遍，用滅過菌的剪刀剪開仿刺參體腔，取出腸道，用0.9%的無菌生理鹽水沖洗腸道外壁，測量腸道的長度。將采集的仿刺參的腸道分別置于無菌試管(去皮)中稱質(zhì)量，分別編號為大連池塘養(yǎng)殖仿刺參(DL)、煙臺池塘養(yǎng)殖仿刺參(YT)、霞浦海上吊籠養(yǎng)殖仿刺參(XP)、莆田池塘養(yǎng)殖仿刺參(PT)。隨后分別置于無菌的研缽內(nèi)充分研磨，加入5 mL無菌生理鹽水沖洗研缽，得到仿刺參腸道勻漿[9]。用細(xì)菌DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司出品)完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。將DNA保存在-80℃。

1.4 Miseq高通量測序流程

正向引物338F 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’；

反向引物806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

先PCR擴(kuò)增，檢測方法采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行，切膠回收產(chǎn)物按照Illumina公司標(biāo)準(zhǔn)流程測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

舍棄低質(zhì)量序列，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，得到的序列用于最終分析。將相似度大于0.97的測序序列歸為1個操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)，分析記錄各個樣品所含OTU的數(shù)量，繪制稀疏曲線[10]。物種豐度的分析包括覆蓋率(Coverage)、豐富度(Chao/Ace)以及多樣性(Simpson/Shannon)[11-12]。同時在門和屬兩個分類水平上統(tǒng)計每個樣品的物種豐度和物種分布，并做群落結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果

2.1 仿刺參腸道細(xì)菌群落多樣性指數(shù)分析

在豐富度(Chao/Ace)和多樣性(Simpson/Shannon)上池塘養(yǎng)殖的仿刺參的腸道菌群比海上吊籠養(yǎng)殖高2倍多(表1)。其中煙臺的仿刺參的豐富度最高，Simpson/Shannon指數(shù)達(dá)到4.78。豐富度指數(shù)Chao/Ace比測得的分類操作單元OTU高，說明腸道內(nèi)還有部分細(xì)菌沒有檢測到。

2.2 仿刺參腸道群落結(jié)構(gòu)分析

在門的水平上(圖1)，仿刺參的腸道菌群發(fā)現(xiàn)20個細(xì)菌門，群落結(jié)構(gòu)主要由7個細(xì)菌門組成，分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidete)、藍(lán)藻門(Cyanobacteri)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)等，其中大連、煙臺的仿刺參腸道菌群以變形菌門、擬桿菌門為主(>85%)。莆田池塘養(yǎng)殖仿刺參和霞浦仿刺參腸道菌群以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為主(>85%)。大連、煙臺、莆田、霞浦的仿刺參腸道的主要優(yōu)勢菌群分別為變形菌門(60.9%)、變形菌門(87.48%)、厚壁菌門(40.98%)、厚壁菌門(63.01%)(表1)。

表1 不同地區(qū)仿刺參腸道樣品多樣性指數(shù)

注：DL—大連池塘養(yǎng)殖仿刺參；YT—煙臺池塘養(yǎng)殖仿刺參；XP—霞浦海上吊籠養(yǎng)殖仿刺參；PT—莆田池塘養(yǎng)殖仿刺參。下同。

Notes：DL—sea cucumber cultured in Dalian ；YT—sea cucumber cultured in Yantai ；XP—sea cucumber cultured in Xiapu；PT—sea cucumber cultured in Putian.The same as below.

表2 不同地區(qū)仿刺參腸道樣品在門水平上的豐度

Taxonomy/% AbundanceDLYTPTXP Proteobacteria 60.9087.4831.819.05 Firmicutes 1.680.6740.9863.01 Bacteroidetes 25.246.9210.4224.45 Actinobacteria 1.271.737.292.04 Verrucomicrobia 6.080.330.680.11 Cyanobacteria 2.810.093.370.48 Chloroflexi 0.340.563.360.63 Others2.442.333.670.08

在屬的水平上(圖2)，四個產(chǎn)地仿刺參腸道中共檢測到317個細(xì)菌種屬。大連養(yǎng)殖仿刺參腸道的主要優(yōu)勢菌群為Lutibacter(10.13%)，屬擬桿菌門的黃桿菌科，是一種兼性厭氧菌。煙臺養(yǎng)殖仿刺參腸道的主要優(yōu)勢菌群為Haliea(21.34%)和Halioglobus(12.58%)。福建兩種養(yǎng)殖仿刺參腸道群落結(jié)構(gòu)主要由乳球菌屬(Lactococcus)、Formosa、芽孢桿菌屬(Bacillus)、Solibacillus、假單胞菌屬(Pseudomonas)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、鏈球菌屬(Streptococcus)、紅桿菌科(Rhodobacteraceae)、桿菌屬 (Lysinibacillus)、Marinosulfonomonas、Pseudoruegeria等幾十個屬組成。其中乳球菌屬、芽孢桿菌屬所占比例較高。在霞浦養(yǎng)殖仿刺參腸道中Formosa含量最高，占細(xì)菌總數(shù)的比例為87.06%，其次為乳球菌屬(Lactococcus)，占細(xì)菌總數(shù)比例為7.71%(表3)。

表3 不同地區(qū)仿刺參腸道樣品在屬水平上的豐度

Taxonmy/% AbundanceDLYTPTXP Lactococcus0.310.1324.5047.70Lutibacter10.131.140.900.11Tateyamaria6.920.850.000.00Formosa0.000.000.0025.09Lutimonas6.592.950.000.00Rhodobacteraceae6.511.622.751.20Haliea6.4821.343.740.01Halieaceae5.082.560.000.00Halioglobus3.9312.580.280.00 Psychromonas3.000.451.273.08Shewanella2.690.240.000.00 Cyanobacteria1.950.062.610.48Lentimonas1.950.020.000.00Roseobacter1.840.682.260.04Desulfobulbaceae1.593.800.050.00 Vibrio1.490.080.000.12Flavobacteriaceae1.420.802.740.02Winogradskyella0.410.041.380.00Prevotella0.240.001.560.00Caldilineaceae0.220.212.200.24 Streptococcus0.070.061.991.47 Bacillus0.030.025.559.36 Arthrobacter0.020.021.841.98 Ruegeria0.000.001.560.12Solibacillus0.000.001.623.22 Others37.0150.3241.235.71

3 結(jié)論

通過高通量16S rRNA序列分析發(fā)現(xiàn)，大連池塘養(yǎng)殖仿刺參的腸道菌群以變形菌門為主，在整個仿刺參腸道中占60.90%，其次為擬桿菌門，占比為25.24%。煙臺池塘養(yǎng)殖仿刺參的腸道菌群以變形菌門為主要優(yōu)勢菌群，在整個仿刺參腸道中占87.48%。福建吊籠養(yǎng)殖仿刺參的腸道菌群以厚壁菌門為主，在整個仿刺參腸道中占59.04%，主要為乳球菌屬和芽孢桿菌屬，其次分別為擬桿菌門和變形菌門，分別占29.86%和8.14%。福建池塘養(yǎng)殖仿刺參的腸道菌群總體以厚壁菌門為主(主要為芽孢桿菌屬和乳球菌屬)，其次為擬桿菌門和變形菌門，其中乳球菌屬、芽孢桿菌屬和鏈球菌屬等厚壁菌門菌株，擬桿菌門中的黃桿菌屬和Winogradskyella屬占比較高。兩種養(yǎng)殖模式仿刺參的腸道菌群都以厚壁菌門為主，主要為乳球菌屬和芽孢桿菌屬，其次為變形菌門。

池塘養(yǎng)殖的仿刺參的腸道菌群的豐富度指數(shù)以及多樣性指數(shù)高于海上吊籠養(yǎng)殖，但在相似性上差異性較大。有研究表明厚壁菌門至少含有44 種與抗性淀粉降解酶有關(guān)的基因[13]，所以厚壁菌門可以降解宿主所不能降解的多糖，為宿主提供能量，而擬桿菌門也能降解一大類不能被消化的植物多糖。乳球菌屬和芽孢桿菌屬均為厚壁菌門的細(xì)菌，為革蘭氏陽性菌，在維持動物腸道健康中起重要作用。Formosa屬于擬桿菌門，是Ivanova等[14-16]在2004年提出的為革蘭氏陰性菌、異養(yǎng)型，其耐鹽，能夠分解糖。因此，4個實驗組的菌群結(jié)構(gòu)和所占比例存在較大的差異，這種差異與仿刺參的生產(chǎn)地、食物來源不同有關(guān)。

造成南北方養(yǎng)殖仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)有這么大的不同的原因，可能是地理位置和養(yǎng)殖方式的不同。地理位置不同導(dǎo)致仿刺參生長的海區(qū)環(huán)境不一樣，這是導(dǎo)致南北方仿刺參腸道菌群差異最重要的原因。大連、煙臺和莆田的仿刺參都是池塘養(yǎng)殖，但是它們的養(yǎng)殖方式不同。大連養(yǎng)殖的密度為40 kg/667 m2，換水量較??；煙臺的養(yǎng)殖密度為100 kg/667 m2，密度高換水量大，投藥量大；雖然莆田和霞浦養(yǎng)殖的仿刺參都在福建的海區(qū)養(yǎng)殖，但是菌群結(jié)構(gòu)依然有較大的差別。霞浦的養(yǎng)殖方式為海上筏式吊籠養(yǎng)殖，需要每天喂養(yǎng)，而仿刺參食物來源單一，從而導(dǎo)致仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)豐富度不高。池塘養(yǎng)殖仿刺參的腸道菌群的豐富度較高，可以較好地抵抗來自病原菌的侵害。

在海洋環(huán)境和生物體內(nèi)，弧菌是最常見的一類條件致病菌，宿主的生理狀態(tài)和水質(zhì)環(huán)境等因素對其致病性的影響較大。近年來有關(guān)弧菌的研究，是海水養(yǎng)殖動物病害的主要研究熱點[17]。在用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法對海洋菌分離鑒定時，弧菌占有一定的比例[18]。但在本研究中弧菌屬在仿刺參的腸道內(nèi)所占比例較小，為0.2%。從而可知弧菌屬在健康仿刺參的腸道中的量是很少的。高菲等[19]利用PCR變性梯度凝膠技術(shù)(PCR-DGGE)研究了仿刺參不同部位腸道內(nèi)含物的細(xì)菌群落組成，發(fā)現(xiàn)仿刺參不同部位腸道的內(nèi)含物的優(yōu)勢菌群相同，均為γ-變形菌綱；發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)細(xì)菌的16S rDNA序列與目前不能培養(yǎng)的海洋沉積物環(huán)境中獲得的細(xì)菌序列相似，表明仿刺參腸道的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受棲息地環(huán)境影響較大。有資料指出，仿刺參的腸道主要是吸收和代謝營養(yǎng)物質(zhì)的場所[20-21]，因此，腸道中的細(xì)菌群落可能在仿刺參的消化分解過程中起作用，其具體的功能仍需要進(jìn)一步的研究。另外，研究手段和地域環(huán)境不同也可能是造成仿刺參腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同的重要原因。

細(xì)菌的16S rDNA常被用于傳統(tǒng)方法難以培養(yǎng)的細(xì)菌鑒定分析。本研究用細(xì)菌16S rDNA V3-V4 可變區(qū)序列分析技術(shù)與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，分析福建(莆田和霞浦)、大連和煙臺地區(qū)養(yǎng)殖的仿刺參腸道微生物的細(xì)菌群落組成。研究結(jié)果表明，Miseq高通量測序技術(shù)克服了細(xì)菌常規(guī)分離培養(yǎng)的限制，能快速、準(zhǔn)確地分析腸道中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。腸道正常菌群是腸道的組成部分，腸道菌群的不同體現(xiàn)了腸道功能的差異性。外部環(huán)境會影響仿刺參的腸道菌群組成，從而影響腸道的吸收、消化等功能。本研究首次利用高通量測序技術(shù)對養(yǎng)殖仿刺參腸道中的菌群進(jìn)行測序分析，且研究中檢測到的細(xì)菌多數(shù)是傳統(tǒng)方法未檢測到的，這些細(xì)菌可能在仿刺參養(yǎng)殖和疾病防控方面具有重要應(yīng)用價值。這為今后進(jìn)一步研究仿刺參腸道菌群與其攝食、消化、免疫等之間的關(guān)系提供了新的資料。研究中發(fā)現(xiàn)4個地方仿刺參腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)都有一定的差異，所以現(xiàn)在市場上的適用于大連、山東的益生菌制劑并不一定適用于福建地區(qū)養(yǎng)殖的仿刺參，為了進(jìn)一步研究益生菌的效用，建議從南方養(yǎng)殖仿刺參的腸道內(nèi)選取原籍益生菌，這樣對福建養(yǎng)殖仿刺參會更有針對性。