網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病的早期干預(yù)效果分析

孫敏秋

(福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建 福州 350002)

大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病又稱內(nèi)臟結(jié)節(jié)病，是近年來(lái)養(yǎng)殖大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)的主要病害，在各個(gè)大黃魚(yú)養(yǎng)殖地區(qū)均廣泛流行。一旦發(fā)病，累計(jì)死亡率可達(dá)50%以上，嚴(yán)重影響了大黃魚(yú)的養(yǎng)殖產(chǎn)量。近些年，針對(duì)該病的研究主要集中在病原的分離鑒定、組織病理學(xué)及致病機(jī)理[1-2]等方面。已確定大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病的病原為假單胞菌，一些研究認(rèn)為是其中的變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)[3-7]，另一些報(bào)道則認(rèn)為是惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[1,8-9]。研究表明：該病臨床癥狀主要體現(xiàn)在患魚(yú)的肝臟、腎臟、脾臟等內(nèi)臟有大量肉眼可見(jiàn)白色結(jié)節(jié)[10]。該病的發(fā)生與水溫變化密切相關(guān)[11]。許斌福等[12]對(duì)大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在寧德地區(qū)，內(nèi)臟白點(diǎn)病主要在每年10月初至次年5月的低溫期流行，其中，3月初至4月中下旬(水溫14～18℃)為發(fā)病高峰期，主要危害50～150 g的網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚(yú)。以往的研究雖已提出一些防治該病的初步建議[6,13]，但出現(xiàn)結(jié)節(jié)后藥物治療效果不佳。本研究旨在通過(guò)流行病學(xué)觀察，在確定大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病病原和敏感藥物的基礎(chǔ)上，在發(fā)病早期通過(guò)藥物干預(yù)治療，以期達(dá)到提高治愈率的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚(yú)

2018年1月分別在福建省寧德市三都澳的大灣海區(qū)漁排(以下簡(jiǎn)稱漁排1)和官井洋海區(qū)漁排(以下簡(jiǎn)稱漁排2)開(kāi)展早期治療試驗(yàn)。其中，漁排1的試驗(yàn)大黃魚(yú)規(guī)格為75～100 g，共計(jì)45 000尾；漁排2的試驗(yàn)大黃魚(yú)規(guī)格為60～100 g，共計(jì)213 000尾。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)期間，除記錄試驗(yàn)大黃魚(yú)的發(fā)病和死亡情況數(shù)據(jù)外，在2月、4月及5月，分別從2個(gè)漁排的6個(gè)網(wǎng)箱中進(jìn)行隨機(jī)采樣和解剖觀察，每個(gè)樣品采集5～10尾。

1.3 解剖觀察內(nèi)臟白點(diǎn)出現(xiàn)情況

用無(wú)菌手術(shù)剪剖檢樣品魚(yú)體腹部，觀察脾臟、腎臟甚至肝臟有無(wú)大量白點(diǎn)或白色結(jié)節(jié)，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品出現(xiàn)內(nèi)臟白點(diǎn)癥狀的概率：

內(nèi)臟白點(diǎn)出現(xiàn)率/%=患內(nèi)臟白點(diǎn)癥狀的魚(yú)尾數(shù)/每個(gè)樣品采集的魚(yú)尾數(shù)×100%

1.4 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

全程無(wú)菌操作，用接種環(huán)從樣品魚(yú)的肝、腎、脾等部位取樣劃線分離至TSA(1% NaCl)和TCBS平板培養(yǎng)基，于(28±2)℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢(shì)單菌落若干個(gè)進(jìn)行再劃線分離純化培養(yǎng)。

1.5 分離菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)觀察

分離純化后接種于TSA(1% NaCl)和TCBS平板，(28±2)℃恒溫培養(yǎng)24 h，此時(shí)觀察菌落顏色、形態(tài)、透明度等菌落特征。

1.5.2 分離菌株的16S rRNA基因序列分析

采用16S rRNA特異性通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(目標(biāo)片段約1 500 bp)，上游引物P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物P2：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′(上海生工生物工程公司合成)。提純分離菌基因組DNA作為PCR模板，PCR反應(yīng)體系為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min ，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)后各取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。陽(yáng)性克隆菌液送去測(cè)序(上海尚亞生物技術(shù)有限公司)，所得序列通過(guò)軟件NCBI BLAST進(jìn)行比對(duì)分析。

1.6 藥物敏感試驗(yàn)

1.6.1 供試藥物

選擇的供試藥物均為目前我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部以及國(guó)外允許使用的水產(chǎn)用抗菌藥物。所有實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用的藥物均由全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站提供。

1.6.2 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

參照《水生動(dòng)物致病菌藥敏試驗(yàn)操作規(guī)程》，采用液體培養(yǎng)基稀釋法，全程無(wú)菌條件下，將供試藥物濃度配制成200 μg/mL的最高測(cè)定濃度(前期工作中的病原菌耐藥性普查試驗(yàn)的最高測(cè)定濃度為1 024 μg/mL)，再用TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)培養(yǎng)基按2n倍比依次稀釋成11個(gè)濃度梯度，另設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組，后依次接入1∶1體積的濃度為106cfu/mL的待測(cè)菌懸液，于(28±2)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每種供試藥物做2個(gè)平行，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.7 治療

在2— 4月的3個(gè)月間檢出致病菌后，根據(jù)細(xì)菌分離和藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇鹽酸恩諾沙星、鹽酸土霉素口服開(kāi)展治療試驗(yàn)。2個(gè)海區(qū)的漁排各設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)網(wǎng)箱，依次為鹽酸恩諾沙星藥物試驗(yàn)組、鹽酸土霉素藥物試驗(yàn)組和空白對(duì)照組。

按飼料量0.3%將藥物溶解于水，均勻潑灑至顆粒餌料表面，靜置吸收后投喂。連續(xù)給藥5 d，試驗(yàn)組其余時(shí)間及空白對(duì)照組全程投喂未拌藥物的相同餌料。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌耐藥性普查

在2016年的低溫期間，分別在寧德蕉城、福安、福鼎、霞浦等地采集患內(nèi)臟白點(diǎn)病的大黃魚(yú)，從其肝、腎、脾等器官共分離獲得大黃魚(yú)源假單胞菌21株。通過(guò)開(kāi)展13種抗菌藥物敏感試驗(yàn)，測(cè)得21株大黃魚(yú)源假單胞菌的MIC值(表1)，根據(jù)國(guó)家獸藥標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而篩選獲得大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)鹽酸多西環(huán)素、鹽酸土霉素和鹽酸恩諾沙星的敏感性均較高。

表1 21株大黃魚(yú)源假單胞菌對(duì)13種抗菌藥物的敏感性

注：“﹡”為部分?jǐn)?shù)據(jù)省略。

Note：﹡indicated partial data omitted.

2.2 病原菌的分離鑒定

2月采集的大黃魚(yú)樣品經(jīng)菌株分離和病原菌鑒定分析，獲得6株大黃魚(yú)源假單胞菌(Pseudomonasspp.)(表2)。

①注意卡管。在鉆孔回?cái)U(kuò)完成后，如孔內(nèi)石碴未清理干凈，易在鋪管過(guò)程中發(fā)生卡管情況，影響施工進(jìn)度。因此對(duì)有斷層或破碎帶的鉆孔必須認(rèn)真細(xì)致沖洗，且沖洗完成后即組織鋪管施工，不得停頓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，避免卡管。

表2 分離菌株信息表

2.3 藥物敏感試驗(yàn)

通過(guò)測(cè)定該6株假單胞菌對(duì)13種抗菌藥物的敏感性，測(cè)得藥敏結(jié)果(表3)與前期大黃魚(yú)源假單胞菌耐藥性普查結(jié)果基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證這6株菌為大黃魚(yú)源假單胞菌。

2.4 早期治療效果

2.4.1 發(fā)病情況和死亡率

至6月30日止，漁排1的鹽酸恩諾沙星組、鹽酸土霉素組的大黃魚(yú)基本未發(fā)生內(nèi)臟白點(diǎn)病，各組死亡率也僅是正常損耗率，而空白對(duì)照組大黃魚(yú)因該病的死亡率達(dá)6.00%；漁排2的鹽酸恩諾沙星組也未有內(nèi)臟白點(diǎn)現(xiàn)象，鹽酸土霉素組則偶爾有零星內(nèi)臟小白點(diǎn)發(fā)生，但基本無(wú)該病造成的死亡，而空白對(duì)照組因該病的死亡率達(dá)到7.00%(表4)。

表4 各試驗(yàn)組大黃魚(yú)因內(nèi)臟白點(diǎn)病導(dǎo)致的死亡率

2.4.2 解剖癥狀觀察

解剖觀察2月(用藥前)、4月(用藥期間)和5月(停藥后)分別從漁排6個(gè)網(wǎng)箱采集的大黃魚(yú)，解剖結(jié)果如表5所示，用藥后，2個(gè)漁排的鹽酸恩諾沙星組和鹽酸土霉素組的大黃魚(yú)均未見(jiàn)到內(nèi)臟白點(diǎn)現(xiàn)象，但在4月漁排2和5月2個(gè)漁排的空白對(duì)照組的大黃魚(yú)中均觀察到不同程度的內(nèi)臟白點(diǎn)現(xiàn)象，計(jì)算其內(nèi)臟白點(diǎn)出現(xiàn)率分別為66.7%、25.0%和50.0%。

表5 解剖觀察結(jié)果

注：“—”表示解剖未觀察到內(nèi)臟白點(diǎn)現(xiàn)象(內(nèi)臟白點(diǎn)出現(xiàn)率為0%)。

Note：—indicated no visceral white spots(occurrence rate of visceral white spots was 0%).

3 結(jié)論與討論

目前，大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病的治療普遍存在滯后性，即魚(yú)體出現(xiàn)白點(diǎn)或結(jié)節(jié)癥狀后才開(kāi)始用藥，導(dǎo)致治療效果不甚理想。本研究根據(jù)前期大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病流行病學(xué)調(diào)查和病原菌耐藥性普查結(jié)果，確定鹽酸土霉素和鹽酸恩諾沙星兩種針對(duì)大黃魚(yú)源假單胞菌的敏感性藥物(由于鹽酸多西環(huán)素與鹽酸土霉素均屬四環(huán)素類藥物，兩者具有相似的抗菌譜，綜合考慮選擇了鹽酸土霉素)，預(yù)計(jì)一旦發(fā)現(xiàn)魚(yú)體感染了假單胞菌，就立刻開(kāi)展藥物干預(yù)治療試驗(yàn)，并跟蹤分析治療效果。試驗(yàn)證明，在魚(yú)體感染了致病的假單胞菌，但還未形成內(nèi)臟結(jié)節(jié)時(shí)，即刻開(kāi)展口服鹽酸恩諾沙星和鹽酸土霉素的治療，會(huì)顯著降低大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病的發(fā)病率及因該病導(dǎo)致的死亡率，達(dá)到了提高治愈率的目的。且從總體試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，鹽酸恩諾沙星對(duì)大黃魚(yú)源假單胞菌的抑制作用較鹽酸土霉素會(huì)更明顯。綜上所述，治療時(shí)間應(yīng)是提高大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病治愈率的關(guān)鍵因素，即把握藥物治療時(shí)間，開(kāi)展早期干預(yù)對(duì)有效控制該病的病情具有重要意義。但在此需要注意的是，在使用抗菌藥物治療控制大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病的同時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵循休藥期規(guī)定，例如鹽酸恩諾沙星的休藥期一般為500度日，以確保水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。