miRNAs用于惡性胸腔積液鑒別診斷的研究進展

朱苗駿 張美玲 張新 譚若穎

摘 要 胸腔積液是指胸膜腔內(nèi)液體過量積聚，臨床上可分為漏出液和滲出液兩類，其中漏出液的病因主要為心力衰竭和肝硬化等，滲出液的病因則復(fù)雜多樣，治療方法也各異。惡性胸腔積液屬滲出液，對其的鑒別診斷在臨床上十分重要。近年來，隨著分子生物學(xué)及其相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，各種生物標志物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并被用于各種疾病的臨床診斷。本文概要介紹miRNAs用于惡性胸腔積液鑒別診斷的研究進展。

關(guān)鍵詞 惡性胸腔積液 miRNAs 肺癌 診斷

中圖分類號：R730.43； R561.3 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）11-0050-04

Research progress in the differential diagnosis of miRNAs for malignant pleural effusion

ZHU Miaojun1*， ZHANG Meiling2， ZHANG Xin2， TAN Ruoying1**[1. Shanghai Biovue Technology （China） Co.， Ltd.， Shanghai 200031， China； 2. Department of Respiration， Zhongshan Hospital， Fudan University， Shanghai 200032， China]

ABSTRACT Pleural effusion occurs when fluid accumulates in the pleural space and can be clinically divided into a transudate or an exudate， in which the causes of transudate are mainly ascribed to heart failure and cirrhosis and so on， while the cause of exudate is complex and diverse and the methods for its treatment vary. Malignant pleural effusion is an exudate and its differential diagnosis is very important in clinic. In recent years， various biomarkers have been found and applied in clinical diagnosis with the development of molecular biology. In this review， we focused mainly on the progress of miRNAs for the differential diagnosis of malignant pleural effusion.

KEY WORDS malignant pleural effusion； miRNAs； lung cancer； diagnosis

胸腔積液又稱胸水，是臨床上常見的內(nèi)科疾病癥狀之一，肺、胸膜和肺外疾病均可引起[1-2]。對胸腔積液患者，判別胸腔積液的性質(zhì)和明確病因非常重要，能否及早、正確地明確病因?qū)⒅苯佑绊懙街委煼桨傅臄M定、治療效果和患者預(yù)后。

1 胸腔積液的分類和鑒別診斷

胸腔積液常作為一種并發(fā)癥出現(xiàn)，可繼發(fā)于各種良、惡性疾病。臨床上將胸腔積液分為漏出液和滲出液兩類，兩者可通過傳統(tǒng)的胸腔積液檢查方法如Light標準、血清-胸腔積液白蛋白梯度、膽固醇濃度、血清氨基末端腦鈉尿肽前體水平等方法予以區(qū)分。

胸腔積液還可按其性質(zhì)不同分為良性胸腔積液（benign pleural effusion， BPE）和惡性胸腔積液（malignant pleural effusion， MPE）兩類[1]。BPE的病因主要包括充血性心力衰竭、心包疾病、肝硬化失代償期、腎病綜合征、結(jié)核性胸膜炎、類肺炎性胸腔積液和肺栓塞等。MPE多由原發(fā)于胸膜的腫瘤或其他惡性腫瘤引起，約占所有胸腔積液的50%[3]。幾乎所有的惡性腫瘤都有累及胸膜的可能，但MPE的最常見病因是肺癌，約占所有MPE病因的1/3。約有15%的肺癌患者在確診時即合并有MPE，約有50%的肺癌患者會在終末期出現(xiàn)MPE[4]。肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤類型，其中非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer， NSCLC）約占所有肺癌的90%以上。大多數(shù)NSCLC患者在被診出時疾病已至晚期，而MPE是晚期NSCLC的并發(fā)癥之一。MPE在肺腺癌患者中尤為常見，約40%的肺腺癌患者合并有MPE。這是因為肺腺癌多為周圍性肺癌，后者易累及胸膜，進而產(chǎn)生MPE[1]。乳腺癌的發(fā)病率很高。MPE的第二常見病因就是乳腺癌，約占MPE病因的1/5。淋巴瘤、卵巢癌和胃癌也是MPE的主要病因。此外，還有5% ～ 10%的MPE的病因不明[1]。

胸腔積液的性質(zhì)不同，治療方案和患者預(yù)后也不同，所以胸腔積液的良、惡性鑒別診斷至關(guān)重要。目前，MPE診斷主要依賴于對胸腔穿刺獲取的胸腔積液的細胞學(xué)分析。然而，即使是有經(jīng)驗的病理學(xué)醫(yī)師和進行多次穿刺檢查，胸腔積液細胞學(xué)分析對MPE診斷的靈敏度也只有50% ～ 70%[5]。雖然進行胸腔鏡胸膜活檢的MPE診斷靈敏度可達90%以上[6]，但該方法屬侵襲性操作，且存在感染、出血和慢性疼痛等并發(fā)癥風險，不適用于身體狀況差且伴有其他合并癥的患者。因此，2010年更新的英國胸科學(xué)會胸腔積液診治指南[2]仍十分強調(diào)胸腔積液檢查在MPE診斷中的作用。對晚期NSCLC合并胸腔積液患者，由于患者已無法接受手術(shù)治療，加之胸腔積液樣本較活組織樣本更易獲得，胸腔積液檢查的地位更加重要。

隨著分子生物學(xué)及生物技術(shù)的發(fā)展，人們已發(fā)現(xiàn)許多具有診斷價值的生物標志物，包括腫瘤標志物如癌胚抗原，癌抗原CA153、CA199、CA125，以及細胞角蛋白片段CYFRA 21-1等，但它們用于MPE診斷的靈敏度均不高[7-9]。

胸腔積液的良、惡性鑒別診斷現(xiàn)依然是臨床上的一大難題，尤其是對那些腫瘤合并心力衰竭、腫瘤繼發(fā)的阻塞性肺炎或肺不張、腫瘤侵犯淋巴管或縱隔淋巴結(jié)所致淋巴回流障礙等引起的胸腔積液更難區(qū)分其良、惡性質(zhì)。另外，胸腔積液的細胞成分相對比較復(fù)雜，其中混雜有間皮細胞、巨核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和惡性腫瘤細胞等。創(chuàng)傷、炎癥和腫瘤等都能導(dǎo)致間皮細胞的過度增殖，且有時細胞過度增殖的程度介于良、惡性之間，細胞學(xué)檢查很難區(qū)分胸腔積液的性質(zhì)。臨床上對新的準確、有效和無創(chuàng)的良、惡性胸腔積液鑒別診斷方法的需求十分迫切。

2 miRNAs用于胸腔積液鑒別診斷的研究進展

已知非編碼RNAs通過多種調(diào)控方式參與著眾多生物學(xué)過程，其中以對miRNAs與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究最多。miRNAs是一類長度為19 ～ 24個核苷酸的內(nèi)源性、高度保守的單鏈非編碼RNAs分子，能夠通過mRNA剪切和翻譯抑制等方式調(diào)控靶基因的表達[10]。miRNAs不僅可在組織中穩(wěn)定表達并發(fā)揮作用，且也可在外周循環(huán)血及其他體液中穩(wěn)定存在，并已作為特異性標志物用于多種惡性腫瘤的診斷和分型[11-12]。有關(guān)miRNAs能在體液中穩(wěn)定存在的機制目前主要有兩種觀點：一種觀點認為，分泌到胞外的miRNAs是存在于微囊泡（exosomes）中的，由于有微囊泡的保護，得以避免被酶降解[13]；另一種觀點認為，游離miRNAs在體液中以蛋白復(fù)合體的形態(tài)存在，只有經(jīng)蛋白酶作用后才會被核酸酶降解[14]。鑒于循環(huán)miRNAs可在外周體液中穩(wěn)定存在，故通過檢測外周體液中miRNAs的水平變化，便能用于一些疾病的鑒別、診斷和分型。作為一種新型微創(chuàng)體液檢查方式，miRNAs水平檢測具有簡便、迅捷等特點，還可用于實時監(jiān)測疾病進展和治療效果。

2.1 胞外游離miRNAs用于胸腔積液鑒別診斷的研究進展

近十年來，有關(guān)胞外游離miRNAs水平檢測用于良、惡性胸腔積液診斷的研究很多。Xie等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，與BPE相比，MPE中miR-30d、miR-24和miR-26a的表達水平更高；而在MPE中，與腫瘤對化療敏感相比，腫瘤對紫杉醇耐藥時的miR-152水平較低，提示miR-152水平具有用作腫瘤藥敏性標志物的潛力。Shin等[16]的研究則揭示，與BPE相比，肺腺癌來源MPE中miR-134、miR-185和miR-22的表達水平較低。鑒于這些miRNAs均已被證實是腫瘤抑制因子[17-18]，故聯(lián)合應(yīng)用這些miRNAs和癌胚抗原水平檢測可大大提高肺腺癌來源MPE診斷的靈敏度（達92%）和特異性（達92.5%）[16]。

Wang等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，MPE中的一種miRNAs“指紋圖譜”（miR-100高表達以及miR-134、miR-345、miR-151和miR-93低表達）與NSCLC患者的低生存率有關(guān)，可用作NSCLC患者不良預(yù)后的獨立影響因子。Qian等[20]的研究揭示，miR-93可經(jīng)負調(diào)節(jié)血管生成素-2的表達而干擾上皮細胞的遷移、侵襲和增殖，從而影響腫瘤的血管和淋巴管生成，進而抑制MPE生成。該研究還發(fā)現(xiàn)，與預(yù)后差、疾病無進展生存期短的MPE患者相比，預(yù)后良好的MPE患者MPE中的miR-93表達量明顯更高。Han等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，與BPE相比，肺腺癌來源MPE中的miR-198表達量大大降低；聯(lián)合應(yīng)用miR-198和癌胚抗原水平檢測能較單用CYFRA 21-1水平檢測更有效地區(qū)分肺腺癌來源的MPE和BPE，靈敏度和特異性分別達89.2%和85.0%。

2.2 胞外微囊泡miRNAs用于胸腔積液鑒別診斷的研究進展

近年來，有關(guān)胞外微囊泡miRNAs的研究也越來越多。Lin等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，與肺炎和肺癌患者相比，肺結(jié)核患者胸腔積液中的miR-378i表達量明顯更高，而miR-205-5p和miR-200b的表達量在肺癌患者胸腔積液中明顯升高。Wang等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，微囊泡miRNAs在肺腺癌來源胸腔積液、肺結(jié)核來源胸腔積液和BPE中的表達譜不盡相同，其中9種微囊泡miRNAs（miR-205-5p、miR-483-5p、miR-375、miR-200c-3p、miR-429、miR-200b-3p、miR-200a-3p、miR-203a-3p和miR-141-3p）在肺腺癌來源胸腔積液中的表達量明顯更高，3種微囊泡miRNAs（miR-148a-3p、miR-451a和miR-150-5p）在肺結(jié)核來源胸腔積液和BPE中的表達量差異較大，提示可據(jù)此區(qū)分肺結(jié)核來源胸腔積液和BPE。另有研究顯示，miR-200家族與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及其上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化機制密切相關(guān)[24-25]，提示miR-200家族可能與MPE生成有重要關(guān)聯(lián)。

3 miRNAs用于胸腔積液鑒別診斷的研究方向

miRNAs用作診斷生物標志物具有很多優(yōu)點，尤其是在惡性腫瘤的診斷中，相較其他診斷標志物，靈敏度和特異性均更高，具體優(yōu)點包括：①miRNAs在多種體液中穩(wěn)定存在，易獲得，易存儲；②研究表明，miRNAs的表達不僅具有一定的腫瘤特異性，而且還與腫瘤的某些生物學(xué)特性相關(guān)；③miRNAs能被精確、經(jīng)濟（約10美元）和快速（約3.5 h）地檢測[目前主要有3種檢測方法，即miRNAs芯片、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction， PCR）和深度測序技術(shù)]。miRNAs用作診斷生物標志物的難點主要在于許多miRNAs的特異性現(xiàn)還難以判別，亟待更多、更深入的研究的揭示。

上海翔瓊生物技術(shù)有限公司與復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科合作，開展了miRNAs用于MPE診斷和預(yù)后的技術(shù)研究，應(yīng)用熒光定量PCR法對MPE和BPE患者胸腔積液中的miRNAs進行大范圍的檢測（共計1 920種miRNAs），并篩選出與MPE相關(guān)的96種miRNAs陣列，通過樣本測試和數(shù)據(jù)分析等，建立了支持向量機數(shù)學(xué)模型。目前，不僅篩選出可用于輔助MPE診斷的由10種miRNAs組成的miRNAs“指紋圖譜”，還發(fā)現(xiàn)一種miRNAs組合能很好地區(qū)分肺癌來源和肺腺癌來源的胸腔積液，且診斷的準確性均達90%以上。由于國家對生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展的高度重視與大力支持，基于miRNAs檢測的腫瘤篩查和診斷技術(shù)已在我國得到很好的發(fā)展并取得良好的實效。例如，miR-92a檢測試劑盒（熒光定量PCR法）已于2018年3月獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局的批準注冊，用于輔助大腸癌診斷。相信在不久的將來，miRNAs檢測將會更廣泛地用于腫瘤篩查和診斷。

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