玻璃酸二甲基硅烷醇酯對(duì)黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

孟祥璟,張祥奎,陳建英,楊素珍，陳玉榮，劉少英，凌沛學(xué),

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 205101；2.山東福瑞達(dá)生物工程有限公司，山東 濟(jì)南 250101；3.山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

玻璃酸又名透明質(zhì)酸（hyalouronic acid， HA），它是構(gòu)成皮膚、玻璃體、關(guān)節(jié)滑液和軟骨組織的重要成分，具有良好的潤(rùn)滑性、黏彈性、高親水性和保濕性[1-2]，但也存在滲透性差、易降解、黏膩感較強(qiáng)等缺點(diǎn)[3]。玻璃酸二甲基硅烷醇酯（dimethyl silanol hyaluronate，DSHA）是一種HA酯化衍生物，具有保濕、消除黏濕感、抗降解及預(yù)防和修復(fù)皮膚損傷的作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)HA能促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而增加表皮的厚度，提高皮膚的屏障功能，還可為創(chuàng)傷組織提供良好的微環(huán)境、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合[5]。DSHA不僅保留了HA優(yōu)異的保濕效果，還更加穩(wěn)定，可開發(fā)為化妝品原料或醫(yī)用原料[6]。

DSHA的保濕和隔離作用有助于清除鼻腔污物、消除異物感，使鼻黏膜功能恢復(fù)正常，緩解由于干燥環(huán)境、霧霾、粉塵、藥物刺激等造成的鼻腔干癢、灼熱、刺痛等癥狀，恢復(fù)鼻腔黏膜的自凈功能，預(yù)防和減少鼻炎的發(fā)生。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DSHA對(duì)兔鼻腔黏膜細(xì)胞的毒性，采用醋酸氯己定對(duì)兔鼻腔黏膜細(xì)胞和人陰道黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行損傷，檢測(cè)不同濃度DSHA對(duì)黏膜的保護(hù)作用，為DSHA作為鼻腔黏膜保護(hù)劑的開發(fā)提供支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ClassII Type A2生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司）；HERACell 240i CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific）；倒置相差顯微鏡（日本Nikon）；Tecan SUNRISE酶標(biāo)儀（瑞士TECAN）；TS-2000 脫色搖床（北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所）。

1.2 試劑與耗材

DSHA（山東福瑞達(dá)生物工程）；醋酸氯己定（湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技公司）；DMEM 培養(yǎng)液，胎牛血清（美國(guó)Gibco）；胰蛋白酶-EDTA 消化液，噻唑藍(lán)（MTT，美國(guó) Sigma）；CCK8試劑盒（美國(guó)MCE）；DMSO（上海生工）；肌肽（德國(guó) Symrise公司）；透明質(zhì)酸酶，膠原酶I，青霉素，鏈霉素（北京索萊寶）；其他為分析純化學(xué)試劑。

細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，無菌離心管（美國(guó) Corning）；0.22 μm無菌濾器（美國(guó)Millipore）。

1.3 動(dòng)物與細(xì)胞

新西蘭家兔，體質(zhì)量2.3～2.5 kg[山東省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）2009-0013]；兔鼻黏膜上皮細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)）；人陰道黏膜上皮細(xì)胞VK2/E6E7（武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)）。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 醋酸氯己定溶液制備 配制為10 mg/ml的乙醇溶液，使用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋至0.01 mg/ml。

2.1.2 肌肽溶液制備 固體粉末用培養(yǎng)液溶解配制為4 mg/ml溶液并推濾除菌，使用時(shí)稀釋至2 mg/ml。

2.1.3 DSHA溶液制備 用DMSO溶解DSHA，配制為濃度為10 %的母液，用無血清培養(yǎng)液稀釋至1.25，0.25，0.05，0.01，0.002 mg/ml系列溶液。

2.2 兔鼻黏膜上皮細(xì)胞毒性試驗(yàn)

耳緣靜脈空氣栓塞法處死新西蘭兔，從鼻中隔解剖兔鼻腔，75 %酒精消毒鼻腔內(nèi)外，將鼻腔組織完全離斷，75 %醫(yī)用酒精浸泡消毒后，在超凈臺(tái)上分離鼻黏膜，剔除周圍的軟組織。仔細(xì)清除鼻腔表層，用刀片削下鼻黏膜并切碎為1～4 mm2小塊，放入預(yù)冷無菌含有雙抗（100 U/mL青霉素和100 μg/ml鏈霉素）的0.01 mol/L PBS液中，反復(fù)沖洗3～5次，將其放置在DMEM完全培養(yǎng)基中，37 ℃孵育0.5～1 h；再次用預(yù)冷無菌含雙抗的0.01 mol/L PBS清洗孵育，用預(yù)熱的混合消化酶（0.25 %透明質(zhì)酸酶、0.05 %膠原酶I和0.05 %胰蛋白酶的混合液）消化40 min，以DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。反復(fù)吹打消化液，靜止5～10 min，1500 r/min離心5 min，棄上清，然后加入DMEM完全培養(yǎng)基，重新懸浮細(xì)胞沉淀，將收集到的鼻黏膜細(xì)胞按接種于培養(yǎng)瓶。37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，每3 d換液一次。

將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞收集、計(jì)數(shù)后，稀釋至濃度為5×104個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔100 μl，置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組各孔分別加含DSHA的培養(yǎng)液100 μl（終濃度為1.25，0.25，0.05，0.01，0.002 mg/ml），陰性對(duì)照孔加不含DSHA的培養(yǎng)液100 μl。細(xì)胞給藥后培養(yǎng)24 h，加入CCK8溶液10 μl，避光，37 ℃孵育4 h，以不含DSHA的培養(yǎng)液200 μl+CCK8 10 μl為空白對(duì)照，波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定所有樣品孔孵育后溶液的吸光度值（A450）。

式中，A加藥為實(shí)驗(yàn)組吸光度值，A陰性為陰性對(duì)照組吸光度值，A空白為空白對(duì)照組吸光度值。

2.3 兔鼻黏膜上皮細(xì)胞保護(hù)試驗(yàn)[7]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期兔鼻腔黏膜上皮細(xì)胞100 μl 接種于 96 孔培養(yǎng)板，細(xì)胞種植密度為5×104個(gè)/mL，置5 % CO2培養(yǎng)箱，37 ℃過夜培養(yǎng)，分為8組：空白對(duì)照組，細(xì)胞正常培養(yǎng)；陰性對(duì)照組，正常培養(yǎng)后用醋酸氯己定（終濃度0.01 mg/ml）處理1 h；陽性對(duì)照組，肌肽（2 mg/ml）共孵育后用醋酸氯己定（終濃度0.01 mg/ml）處理1 h；實(shí)驗(yàn)組：用不同濃度（終濃度0.002，0.01，0.05，0.25，1.25 mg/ml）DSHA孵育后，用醋酸氯己定處理1 h。醋酸氯己定處理后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組分別繼續(xù)加入含不同濃度DSHA或肌肽的培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組更新培養(yǎng)液但不添加受試物。37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h。然后每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，置培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h。吸棄上清，每孔加入DMSO 100 μl。避光，置搖床低速振蕩20 min，測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處吸光度值A(chǔ)，按下式計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖率。

相對(duì)增殖率（%）=（An-A0）/（Ay-A0）×100 %

式中，An為實(shí)驗(yàn)組吸光度值，Ay為陰性對(duì)照組吸光度值，A0為空白對(duì)照組吸光度值。

2.4 人陰道黏膜上皮細(xì)胞保護(hù)試驗(yàn)

按2.3項(xiàng)方法，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人陰道黏膜上皮細(xì)胞VK2/E6E7用0.01 mg/ml醋酸氯己定處理1 h制備細(xì)胞損傷模型，參照2.3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)步驟以MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)增殖率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，檢測(cè)DSHA（濃度0.002～1.25 mg/ml）對(duì)人陰道黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果與討論

3.1 DSHA對(duì)兔鼻黏膜上皮細(xì)胞增殖率的影響

結(jié)果見圖1。0.002～1.25 mg/ml濃度范圍內(nèi)，DSHA處理組的細(xì)胞相對(duì)增殖率均＞98 %，隨著濃度的增大，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞相對(duì)增殖率有下降趨勢(shì)，表明DSHA無明顯細(xì)胞毒性。

圖1 不同濃度DSHA對(duì)兔鼻黏膜上皮細(xì)胞增殖率的影響（n=6）

3.2 DSHA對(duì)兔鼻腔黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

結(jié)果見圖2、圖3。與陰性對(duì)照相比，提前進(jìn)行藥物干預(yù)的細(xì)胞損傷后的修復(fù)狀態(tài)較好，細(xì)胞相對(duì)增殖率在60 %以上。其中，陽性對(duì)照組提前用2 mg/ml肌肽孵育細(xì)胞，對(duì)醋酸氯己定造成的損傷的修復(fù)效果與陰性對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；試驗(yàn)組提前用DSHA孵育細(xì)胞，藥物濃度大于0.01 mg/ml時(shí)，對(duì)醋酸氯己定造成的細(xì)胞損傷有修復(fù)效果，其中藥物濃度為0.05 mg/ml時(shí)，細(xì)胞相對(duì)增殖率與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），濃度為0.25，1.25 mg/ml時(shí)，與陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞相對(duì)增殖率差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。濃度低于0.01 mg/ml的藥物修復(fù)效果較弱，細(xì)胞相對(duì)增殖率與陰性對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由圖3可見，沒有使用醋酸氯己定損傷的細(xì)胞（C0）生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照組（C-）有醋酸氯己定損傷，因無任何藥物干預(yù)，所以細(xì)胞生長(zhǎng)狀況較差，陽性對(duì)照組（C+）有肌肽干預(yù)，所以細(xì)胞得到了明顯的修復(fù)。DSHA實(shí)驗(yàn)組中，濃度為0.25 mg/ml時(shí)，細(xì)胞的修復(fù)效果最明顯；濃度為0.002 mg/ml時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不良，與陰性對(duì)照組相比，只有少量增殖。

圖2 不同濃度DSHA對(duì)兔鼻黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用（n=6）。

圖3 兔鼻腔黏膜上皮細(xì)胞損傷模型及不同處理組細(xì)胞形態(tài)

3.3 DSHA對(duì)人陰道黏膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

結(jié)果見表1。使用醋酸氯己定對(duì)VK2/E6E7細(xì)胞進(jìn)行損傷處理后，陽性對(duì)照組（肌肽）的細(xì)胞相對(duì)增殖率與陰性對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DSHA濃度＞0.01 mg/ml時(shí)可減弱醋酸氯己定對(duì)VK2/E6E7細(xì)胞的損傷作用，其中0.25，1.25 mg/ml組與陰性對(duì)照組的細(xì)胞相對(duì)增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DSHA濃度低于0.05 mg/ml細(xì)胞相對(duì)增殖率與陰性對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 DSHA對(duì)VK2/E6E7的保護(hù)作用（n=6）

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示DSHA對(duì)兔鼻黏膜上皮細(xì)胞無毒性，先采用DSHA與細(xì)胞共孵育，能減輕醋酸氯己定損傷對(duì)黏膜細(xì)胞的刺激，對(duì)兔鼻腔黏膜上皮細(xì)胞和人陰道黏膜上皮細(xì)胞的微小損傷的恢復(fù)有顯著的促進(jìn)作用。DSHA除保濕、潤(rùn)滑作用外，可有效減輕外界因素對(duì)黏膜的刺激，恢復(fù)黏膜的正常功能，預(yù)防和減少相關(guān)疾病的發(fā)生，在鼻黏膜保護(hù)劑領(lǐng)域有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。