IVIM評價兔VX2腫瘤血管生成的實驗性研究

楊亞旭 李躍華 魏小二

腫瘤微血管密度已經(jīng)作為評估腫瘤微血管生成的重要標志之一，是代表性的量化指標，其與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達正相關。MVD增加，腫瘤浸潤和轉移的惡性潛能也顯著增加，是腫瘤侵襲性的特征性生物學指標之一[1]。然而，目前評價MVD的方法是創(chuàng)傷性的、要求取材非常準確，并且無法對腫瘤血管生成活性進行功能評價，因此這些缺點使之不能成為一

種理想的檢查手段。體素內(nèi)不相干運動（intravoxel incoherent motion，IVIM）最早由Le等[2]學者提出，是一種多b值、無創(chuàng)性以及可重復性反映活體組織水分子運動的成像方法，對腫瘤解剖結構的顯示、腫瘤血管生成的評估以及抗腫瘤血管的療效和預后有著重大價值。國外學者已經(jīng)應用IVIM技術針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3]、乳腺病變[4]、肝硬化[5]、腎臟[6]及胰腺病變[7]進行成像，然而在軟組織腫瘤方面的研究還鮮有報道。

方 法

1.基本材料

將40只新西蘭大白兔隨機分為4組，分別為1周組（10只）、2周組（10只）、3周組（10只）、4周組（10只），以正常大腿肌肉組織作為對照組。將荷瘤兔腫瘤取出剪碎后制成VX2腫瘤懸液，將腫瘤懸液注入兔大腿肌肉內(nèi)制作成實驗兔后進行磁共振掃描。

2.MR掃描設備參數(shù)

上述4組實驗兔在VX2瘤細胞植入后1周均進行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）掃描，明確4組腫瘤種植是否成功以及了解4組間VX2腫瘤的初始狀況，同時1周組MRI掃描結束后處死荷瘤兔、取出腫瘤組織進行分析。完成第一次MRI掃描后，2周組在種植后2周、3周組在種植后3周、4周組在種植后4周進行MRI掃描，各組在MRI掃描后處死實驗兔，取出腫瘤組織進行分析。

采用 3.0T 臨床用MRI掃描儀（Ingenia， 荷蘭飛利浦公司）和8通道頭顱表面線圈（上海辰光醫(yī)療科技股份有限公司）進行掃描。具體掃描序列和 掃 描 參 數(shù) 如 下：T2W： TR/TE=2800/100ms，NSA=4， 層 厚 =2mm， FOV=180×180mm，矩 陣=224×224。T1W 和 增 強 后 T1W（post-T1W）：TR/TE=500/20ms， NSA=4， 層 厚 =2mm，F(xiàn)OV=180×180 mm，矩陣=224×224。DWI（彌散加權成像）采用ss-EPI序列（單次激發(fā)平面回波序列）來完成：TR/TE=2000/86ms， NSA=4，層厚=2mm，F(xiàn)OV=180×180mm，矩陣=75×75，b值分別為0，800s/mm2，ADC圖由掃描機器自帶軟件自動生成。IVIM序列參數(shù)與DWI一致，但是b值不同，b值分別采用0、25、50、75、100、150、200、400、600、800s/mm2。增強掃描如下：經(jīng)兔耳緣靜脈按0.1mmol/kg注射Gd-DTPA（馬根維顯，469.01mg/ml，拜爾先寧）后，進行增強后T1W掃描，掃描參數(shù)如前所述。

3.數(shù)據(jù)處理

將IVIM數(shù)據(jù)傳輸至后處理工作站，利用MRI/DWI Toolbox后處理軟件包生成D、D*、f偽彩圖。以T2W、T1W、post-T1W圖像為參考，在T2W橫斷面圖像中選取腫瘤組織最大層面圖像，避開囊變壞死，在腫瘤實性部分取3點作為ROI（region of intrest）區(qū)進行測量，分別測量D、D*、f值，三點平均值作為測量最終結果，ROI面積3.2～4.0cm2，平均3.5cm2。以post-T1W圖像為基礎來計算各組VX2腫瘤體積。同時在VX2腫瘤同側大腿肌肉劃定感興趣區(qū)，測量上述MRI定量參數(shù)作為參照。

4.組織學分析

實驗兔在完成MRI掃描后處死實驗兔，將位于兩側后肢根部背側的VX2腫瘤完整剝離切除，經(jīng)10%甲醛溶液固定，切取相應組織塊進行石蠟包埋，選取與MRI像最大層面相對應的石蠟塊進行切片，分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色和CD34免疫組化分析。最后再對CD34的結果進行半定量分析，來計算微血管數(shù)。

5.統(tǒng)計學分析

使用 SPSS 16.0進行統(tǒng)計學分析（Chicago，IL，USA)，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)值均輸入到excel表格并以均數(shù)±標準差來表示。使用單因素方差分析分析各組間病灶體積、MVD數(shù)以及各MRI參數(shù)之間的差異，利用Pearson相關檢驗分析MRI參數(shù)與MVD指數(shù)之間的相關關系。

結 果

1.一般情況

4組實驗兔均完成了最終的MRI掃描，所有實驗兔均造模成功，共發(fā)現(xiàn)80個VX2腫瘤。4組實驗兔的肌肉組織的ADC值、D值、D*值和f值之間均無明顯統(tǒng)計學差異（P均＞0.05），表明本研究所采用的MRI-IVIM掃描以及后處理方法也是穩(wěn)定、可靠的。此外，各組在腫瘤種植后1周時腫瘤體積、ADC值、D值、D*值和f值之間也均無統(tǒng)計學差異（P均 ＞0.05）。

2.腫瘤體積、MVD以及ADC值、D值、D*值和f值參數(shù)的動態(tài)變化

隨著時間的推移，腫瘤體積急劇增加，在2周時出現(xiàn)壞死。2周組體積大于1周組（P=0.054），3周組大于2周組（P＜0.001）、4周組大于3周組（P＜0.001）。關于VX2腫瘤的ADC值，2周組的小于1周組（P＜0.001），3周組小于2周組（P＜0.001），4周組也小于3周組（P=0.013）。腫瘤的MVD在腫瘤的不同階段也存在差異，2周組的MVD大于1周組（P＜0.001），3周組的 MVD大于 2周組（P＜0.001），而4周組的MVD也小于3周組的MVD（P＜0.001）。2周組的f值大于1周組（P＜0.001），3周組的f值大于2周組（P＜0.001），而4周組的f值小于3周組（P＜0.001）。2周組的D值小于1周組（P＜0.001），3周組的D值小于2周組（P=0.004），而3周組和4周組D值之間的值無明顯統(tǒng)計學差異（P=0.212）。2周組的D*值大于1周組（P＜0.001），3周組的D*值小于2周組（P＜0.001），而4周組的D*值相對于3周組有降低的趨勢（P=0.067）（表1，圖1、2）。

表1 各組VX2腫瘤ADC值、MVD計數(shù)、D值、D*值和f值之間的比較

表2 VX2腫瘤的ADC值、D值、D*值和f值與MVD計數(shù)之間的相關性

圖1 每組代表性實驗兔的MRI圖像。不同時間點的VX2腫瘤，其ADC值、f值、D值和D*值也發(fā)生動態(tài)變化。

圖2 每組代表性實驗兔的CD34免疫組化圖。CD34染色顯示CD34陽性內(nèi)皮細胞染成褐色，與相鄰腫瘤細胞有明顯分離，不同時間點的VX2腫瘤CD34陽性存在差異。

3.MRI-IVIM定量參數(shù)與MVD計數(shù)之間的相關性

4周組D*值與MVD計數(shù)之間存在統(tǒng)計學相關性趨勢，其他各組D*值和f值與MVD計數(shù)之間均存在統(tǒng)計學相關性，而各組ADC值和D值與MVD計數(shù)之間均無明顯統(tǒng)計學相關性（表2）。

討 論

本研究采用彌散序列成像來反映腫瘤組織內(nèi)的灌注信息，盡管彌散與灌注之間存在一定的聯(lián)系，但兩者之間仍然存在一定的差異。目前臨床內(nèi)應用的彌散序列所包含的不僅僅是水分子運動的信息，也包含了毛細血管灌注信息，即在小b值彌散成像時所得到的ADC值主要由毛細血管內(nèi)的血液灌注所貢獻。本研究在應用多b值成像時利用低b值的圖像部分從而獲得腫瘤內(nèi)的灌注信息。從病理學角度來看，毛細血管內(nèi)灌注與腫瘤內(nèi)MVD密切相關，其血管密度直接決定了單位時間內(nèi)從毛細血管內(nèi)流入腫瘤細胞內(nèi)的血流量。從本研究結果來看，隨著VX2腫瘤的進展，MVD的變化與D*及f值呈一定的相關性，而與ADC及D值無明顯相關性。對此我們的解釋是MVD主要反映了腫瘤微血管的定量指標，即在單位組織內(nèi)毛細血管的量化。D*值主要是反映毛細血管內(nèi)流出到組織間隙的灌注值，f值反映的是微循環(huán)灌注所占整個血流灌注的比值。本研究中在腫瘤生長早期的大多數(shù)腫瘤細胞處于G1期及S期，VX2的種植時間延長，腫瘤的進展，在S期及G2期其表達急劇增加，腫瘤細胞增殖活躍，其侵襲性更強、惡性程度更高，其特征表現(xiàn)為腫瘤微血管的密度增加。隨著腫瘤進展，腫瘤細胞密度相對增加，其對應的影像學指標ADC值相對也降低，同時D值是反映水分子彌散的指標，隨著腫瘤進展，D值下降，這與以往研究結果較為一致。Chandarana等[8]在以IVIM研究腎臟時發(fā)現(xiàn)，D*及f值針對腎臟腫瘤的定性與分型具有重要的意義。在與病理對照研究發(fā)現(xiàn)，f值及D*值可以反映腫瘤血管的密集程度與VEGF的表達。而本研究中的其他參數(shù)如ADC值在b值＞200mm2/s所反映主要是水分子彌散與血流灌注的綜合值；D值則反映的是水分子彌散的實際情況，二者與腫瘤血管的量化相關性不如f值及D*值。本研究只研究到腫瘤種植后的28天，其主要原因為在28天左右的大體病理標本中已經(jīng)出現(xiàn)腫瘤的壞死。在腫瘤出現(xiàn)壞死后，影響其血流灌注的因素將多樣化，隨著腫瘤細胞進展，腫瘤的供血不足時，腫瘤細胞的灌注不僅僅由MVD所決定，其他因素如組織內(nèi)靜水壓在腫瘤進展末期由次要因素變?yōu)橹饕蛩亍?/p>

腫瘤血管生成是實體性腫瘤生長和轉移的基礎，間質流體壓力（IFP）是反映腫瘤血管的一項指標，在正常組織中，新生血管受促血管生成因子和抗血管生成因子的共同作用調(diào)控，處于一種平衡狀態(tài)。然而腫瘤組織中，這種平衡被打破，導致雜亂的不正常新生血管生成， 這些不正常的結構導致了腫瘤血管上的滲漏及血管中血液的異常，進而導致淋巴系統(tǒng)的異常，因此增加了組織液壓。腫瘤部位的異常脈管系統(tǒng)與較高的IFP阻礙了藥物的傳輸，并且有研究指出IFP在腫瘤缺氧、周圍血管生成、腫瘤周圍淋巴管生成和淋巴結轉移的發(fā)展中起著重要作用。因此，IFP已被認為是治療實體腫瘤的關鍵障礙之一。比較困難的是目前沒有可靠的生物標志物來檢測IFP。先前研究表明，IFP的升高會導致腫瘤血流減少，我們假設可以用擴散加權圖像（DWI）作為一種手段來檢測毛細血管血流減少。Kim等[9]采用擴散加權圖像（DWI）對乳腺癌模型小鼠進行研究，并在此基礎上進行了針刺IFP測定。用傳統(tǒng)的單指數(shù)模型和雙指數(shù)模型進行Voxel分析后得出結論：擴散系數(shù)D與IFP相關，IFP與f和D*的中位數(shù)乘積相關，支持使用IVIMDWI指標作為腫瘤IFP的無創(chuàng)生物標志物，利用這一無創(chuàng)性的成像方法在抗腫瘤血管生成治療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，非侵入性、快速、可重復地顯示腫瘤血管特征的特性，對于評估腫瘤血管生成，抗血管生成藥物療效和預后具有重要的臨床意義。本研究以兔的肌肉組織VX2模型為研究對象，采用IVIM 成像技術研究不同時期腫瘤內(nèi)MVD變化，發(fā)現(xiàn)IVIM成像可以用來評價腫瘤血管的特性并具有一定的價值。