茚三酮比色法測定湘西臘肉甘氨酸含量*

鄧湘波 鄧湘平

1（郴州市食品藥品檢驗檢測中心，湖南郴州 423000）2（郴州市蘇仙區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，湖南郴州 423000）

臘肉是一種歷史悠久的中式傳統(tǒng)肉制品。臘肉種類繁多，主要根據(jù)地域性進(jìn)行分類。湖南湘西臘肉的風(fēng)味、色澤是我國眾多臘肉品種中比較突出的,是湖南臘肉中的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，也是西部民族地區(qū)飲食文化的特色之一。

湘西臘肉因其獨特的配方和工藝，形成了湘西臘肉獨特的味香和口感。對于風(fēng)味性食品，食品的揮發(fā)性化合物決定了香氣特性并對食品的特征風(fēng)味貢獻(xiàn)最大。肉類產(chǎn)生芳香揮發(fā)物質(zhì)的主要反應(yīng)是氨基酸和還原糖之間發(fā)生美拉德反應(yīng)和脂質(zhì)熱降解,其主要反應(yīng)有:氨基酸和肽熱降解、糖降解、硫胺素?zé)峤到?、類脂類物質(zhì)氧化作用以及不飽和脂肪酸雙鍵斷裂。研究鑒定食品的揮發(fā)性風(fēng)味化合物已成為食品科技人員的重要任務(wù)。湘西臘肉作為一種典型的風(fēng)味性食品，研究臘肉中氨基酸含量，對其揮發(fā)性風(fēng)味成分的研究具有重要意義。

甘氨酸（Gly）又名氨基乙酸，為人體非必需氨基酸。甘氨酸是氨基酸系列中結(jié)構(gòu)最簡單，組成蛋白質(zhì)的20 多種氨基酸中的一種。目前甘氨酸被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)藥等領(lǐng)域。在湘西臘肉中，由于其特有的加工工藝及湘西黑豬原材料，使甘氨酸在湘西臘肉中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他食品。

目前，氨基酸的檢測方法有很多，主要有氨基酸自動分析儀法（GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》、GB/T18654.11—2008《養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗第11 部分：肌肉中主要氨基酸含量的測定》和高效液相色譜法QB/T 4356—2012《黃酒中游離氨基酸的測定》）。雖然都是國家推薦分析方法，但這些方法前處理均較繁雜，同時要求的儀器設(shè)備費用高，操作相對繁瑣。本研究采用紫外分光光度計，用茚三酮比色法測定湘西臘肉中甘氨酸含量，該方法操作簡單，儀器設(shè)備要求低，具有普遍的可行性。利用茚三酮在一定條件下與甘氨酸顯色的原理，重點研究了溶液pH、顯色劑用量、乙醇用量、加熱溫度、加熱時間和冷卻時間對茚三酮比色法定量檢測甘氨酸的影響，效果較為滿意，可供臘肉中甘氨酸含量檢驗檢測提供參考。并在線性范圍內(nèi)建立測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過分光光度法對其定量測定。

1 試驗部分

1.1 試驗儀器與試劑

1.1.1 試驗儀器

S220 酸度計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-9000S 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；ML204 電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.1.2 試驗試劑

甘氨酸，優(yōu)級純；茚三酮、95%乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉，均為分析純。

1.1.3 試驗原料

從湖南湘西地區(qū)的吉首市瀘溪縣、花垣縣、保靖縣、古丈縣、永順縣、龍山縣等7 市縣隨機(jī)抽取小作坊和工廠加工的臘肉產(chǎn)品（主要為背部肉部分）各2 份，共計14 份樣品，置于清潔塑料袋內(nèi)送回試驗室檢測。

1.2 溶液的制備

1.2.1 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取0.200 g 甘氨酸于燒杯中，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至1 L 容量瓶中，定容至刻度，作標(biāo)準(zhǔn)儲備液備用。

1.2.2 顯色劑的制備

精密稱取2.0 g 茚三酮，加入30 mL 乙醇溶液，低溫加熱溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，冷卻后，用乙醇定容至刻度，置于0 ℃～5 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 緩沖溶液的制備

0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液：準(zhǔn)確稱取28.4 g 磷酸氫二鈉，加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至1 L 容量瓶中定容，備用。

0.1mol/L 檸檬酸溶液：準(zhǔn)確稱取21.01 g 檸檬酸（C6H8O7H2O)，加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至1 L 容量瓶中定容，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取干燥后粉碎的樣品2.0 g，置于燒杯中，加入20 mL 蒸餾水混勻，然后加入10 mL 6 mol/L 的鹽酸溶液和5 g 活性炭，在沸水浴中加熱水解1.0 h，然后將水解溶液轉(zhuǎn)移至110 ℃±1 ℃過夜，用30 mL 熱蒸餾水洗滌活性炭，收集濾液于100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻備用。

2.2 檢測波長的選擇

分別移取1 mL pH 值為6.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液于7 支25 mL 比色管，依次加入3 mL 0.2 mg/mL 的甘氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液和1.0 mL 2.0%茚三酮乙醇溶液，置入90 ℃水浴加熱15 min，室溫下以70%乙醇溶液定容至25 mL，放置20 min 后以空白溶液作參比測量不同波長下的吸光度，結(jié)果見下頁圖1。

2.3 最佳反應(yīng)條件的選擇

2.3.1 反應(yīng)pH 的選擇

圖1 最大吸收波長選擇

分別取2.0 mL 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于7 支25 mL 比色管中，管中分別加入1.0 mLpH 為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鈉緩沖鹽溶液和2.0 mL2.0%茚三酮溶液，5 mL 乙醇溶液，于100 ℃水浴加熱15 min，冷卻10 min，用水定容至刻度。在568 nm 處測定不同條件下顯色體系的吸光度，結(jié)果見圖2。

圖2 pH 對甘氨酸溶液吸光度的影響

由圖2 可知，甘氨酸溶液在pH 為7.0 處有最大吸光度，即甘氨酸與茚三酮的顯色反應(yīng)適宜在弱酸環(huán)境下進(jìn)行，這與文獻(xiàn)報道相吻合。

2.3.2 顯色劑用量的選擇

分別取3.0 mL 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于7 支25 mL 比色管中，加入1.0 mL pH7.0 的緩沖鹽溶液，5 mL乙醇溶液，分別加入1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.7 mL、2.0 mL、2.2 mL、2.5 mL2.0%茚三酮溶液于100 ℃水浴加熱15 min，冷卻10 min 用水定容至刻度。在568 nm處測定不同顯色體系的吸光度，結(jié)果見圖3。

由圖3 可知，隨茚三酮顯色劑用量的增加，溶液的吸光度先增大后趨于平衡，在顯色劑用量為2.0 mL 時溶液的吸光度接近最大值，繼續(xù)增加顯色劑用量，甘氨酸溶液的吸光度不再發(fā)生明顯變化，從取樣和節(jié)省顯色劑方面考慮，確定2.0 mL 為最佳茚三酮溶液用量。

2.3.3 乙醇用量的選擇

圖3 顯色劑用量對甘氨酸溶液吸光度的影響

分別取3.0 mL 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 支25 mL 比色管中，加入1.0 mLpH6.0 緩沖溶液，2.0 mL2.0%茚三酮溶液，分別加入1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、10.0 mL95%乙醇溶液，于100 ℃水浴加熱15 min，冷卻10 min，用水定容至刻度，在568 nm處測定顯色體系吸光度，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇用量對甘氨酸溶液吸光度的影響

由圖4 可知，隨著乙醇用量的變化，溶液的吸光度先增大后減小，在用量為5 mL 時溶液的吸光度達(dá)最大，故5 mL 乙醇用量為最佳。

2.3.4 加熱溫度的選擇

分別取3.0 mL 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 支25 mL 比色管中，加入1.0 mLpH7.0 的緩沖鹽溶液，2.0 mL 2.0%茚三酮溶液，5 mL95%乙醇，分別于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴加熱15 min，冷卻10 min，在568 nm 處測定顯色體系的吸光度，結(jié)果見圖5。

圖5 加熱溫度對甘氨酸溶液吸光度的影響

由圖5 可知，隨著溫度的升高，溶液的吸光度不斷增加，為使樣品反應(yīng)更加充分，因此選用100 ℃作為最佳加熱溫度。

2.3.5 加熱時間的選擇

取3.0 mL 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 支25 mL 比色管中，加入1.0 mLpH7.0 的緩沖鹽溶液，2.0 mL2.0%茚三酮溶液，5 mL95%乙醇，分別于100 ℃水浴中，加熱5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，在568 nm 處測定顯色體系的吸光度，結(jié)果見圖6。

圖6 加熱時間對甘氨酸溶液吸光度的影響

由圖6 可知，加熱15 min 時甘氨酸溶液達(dá)到最大吸光度。

2.3.6 冷卻時間的選擇

分別取3.0 mL 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于6 支25 mL 容量瓶中，加入1.0 mLPH7.0 的緩沖鹽溶液，2.0 mL 2.0%茚三酮溶液，5 mL95%乙醇，于100 ℃水浴加熱15 min，分別冷卻4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、14 min，在568 nm 處測定顯色體系的吸光度，結(jié)果見圖7。

圖7 冷卻時間對甘氨酸溶液吸光度的影響

由圖7 可知，冷卻10 min 時甘氨酸溶液有最大吸光度。

2.4 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取2.0 mL 樣品溶液及2.0 mL 不同濃度的甘氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，分別加入5.0 mL pH 為6.0 的緩沖鹽溶液，充分搖勻后，加入2.0 mL質(zhì)量濃度為2.0%的茚三酮顯色液，5.0 mL 乙醇，搖勻，于沸水浴中加熱15 min，冷卻10 min 定容，用1.0 cm 比色皿，以零管調(diào)節(jié)零點，于波長568 nm 處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時做空白試驗。甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8 所示。

圖8 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖8 可知，甘氨酸溶液質(zhì)量濃度在0 μg/mL～50 μg/mL 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其回歸方程為：y=0.011 6 x+0.006 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，空白試樣質(zhì)量濃度為0.14 μg/mL。

2.5 加樣回收率試驗

取樣品溶液進(jìn)行測定，在顯色過程中按照樣品中甘氨酸的量，按5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10.0 μg/mL3 個濃度水平，精密加入適量甘氨酸對照品溶液，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

由表1 數(shù)據(jù)可知，3 個不同添加水平的回收率分別為99.1%、99.6%、100.5%，精密度在0.3%～1.5%之間，表明該方法測定結(jié)果穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

選取湖南湘西地區(qū)吉首市瀘溪縣、花垣縣、保靖縣、古丈縣、永順縣、龍山縣等7 區(qū)縣具有代表性的湘西臘肉樣品，采用茚三酮比色法測定臘肉中甘氨酸含量。通過對試驗前處理條件優(yōu)化，得出最佳試驗條件為：溶液pH=6.0，顯色劑用量2.0 mL，水浴溫度和時間分別為100 ℃、15 min，乙醇用量5.0 mL，冷卻時間為10 min。在568 nm波長下測定樣品溶液的吸光度，甘氨酸測定的線性范圍在0.14 μg/mL～50 μg/mL 時，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 4。加標(biāo)回收率達(dá)99.1%～100.5%，檢出限為0.14 μg/mL，測量結(jié)果的相對偏差為0.3%～1.5%（n=6）。試驗結(jié)果表明，該方法具有操作簡單，成本低廉，重現(xiàn)性穩(wěn)定等特點，可用于湘西臘肉中甘氨酸含量的測定。