FoxO1抑制劑細(xì)胞篩選模型的構(gòu)建與應(yīng)用

楊夢夏，張晉，杜郁，何維，王雪蕾，王麗，洪斌

糖代謝、脂質(zhì)代謝是十分復(fù)雜的生理過程，與營養(yǎng)調(diào)節(jié)[1]、激素調(diào)節(jié)[2]和體內(nèi)平衡[3]有關(guān)，而代謝受損是許多難治性慢性疾病如肥胖[4]、非酒精性脂肪肝[5]和 2 型糖尿病[3]的主要特征。目前的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子人叉頭框蛋白 O1（FoxO1）參與糖脂代謝并在相關(guān)疾病的發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[6-8]。動物實驗和臨床研究均顯示，在脂肪肝和胰島素抵抗的病理狀態(tài)下，肝細(xì)胞核內(nèi) FoxO1 表達(dá)明顯增加，從而引起糖脂代謝紊亂[9-10]。而伴隨體重減輕和胰島素抵抗的改善，可使 FoxO1 表達(dá)趨于正常并向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)移失活[11]。研究還證明，阻斷 FoxO1 的表達(dá)可顯著改善動物的血糖、血脂異常及肝內(nèi)的甘油三酯沉積[12-14]。因此調(diào)節(jié) FoxO1 的表達(dá)或活性有望成為糖尿病、脂代謝紊亂等疾病藥物發(fā)現(xiàn)的潛在靶標(biāo)。

FoxO 是 Forkhead 蛋白家族的亞群之一，它在哺乳動物細(xì)胞中由 4 個不同的基因編碼組成，分別為 FoxO1、FoxO3、FoxO4 和 FoxO6[15]。FoxO 家族廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞活動如應(yīng)激抵抗、代謝和細(xì)胞凋亡等[15]。FoxO 蛋白主要通過結(jié)合共有核心識別序列起轉(zhuǎn)錄激活的作用且其活性受到胰島素和胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factors-1，IGF-1）信號通路的調(diào)控[16-19]。FoxO1 是 FoxO 家族最早發(fā)現(xiàn)的成員[20]，可以通過識別靶基因啟動子區(qū)的胰島素反應(yīng)元件（insulin response element，IRE）繼而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。FoxO1 是磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）的底物[21]，在胰島素信號調(diào)控中起重要作用。轉(zhuǎn)錄因子 FoxO1 通過與糖異生關(guān)鍵酶葡萄糖 6 磷酸酶（glucose 6 phosphatase，G6Pase）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）基因啟動子區(qū)的 IRE 結(jié)合，調(diào)節(jié)這兩個基因的表達(dá)[22]，從而影響糖異生的過程。微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運蛋白（microsomal triglyceride transfer protein，MTP）是一種轉(zhuǎn)運蛋白，催化脂質(zhì)轉(zhuǎn)運到 apoB 分子上的，在極低密度脂蛋白（very lowdensity lipoprotein，VLDL）的組裝與合成中起重要作用[23]。研究表明，MTP 是 FoxO1 的靶基因，F(xiàn)oxO1 介 導(dǎo)胰島素依賴的肝 MTP 表達(dá)繼而調(diào)控肝臟 VLDL 的產(chǎn)生。載脂蛋白 C-III（apolipoprotein C-III，apoC-III）是高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）與富含甘油三酯（triglyceride，TG）顆粒（如VLDL、乳糜微粒等）進(jìn)行成分交換的載脂蛋白。研究發(fā)現(xiàn) FoxO1 可與 apoC-III 啟動子上的 IRE 位點結(jié)合促進(jìn) apoC-III 的表達(dá)[23]，從而引起富含 TG 顆粒的水解及清除障礙，導(dǎo)致血漿 VLDL、乳糜微粒的積聚，繼而促進(jìn)高脂血癥的發(fā)展。

本研究將 FoxO1 靶基因結(jié)合位點 IRE 克隆至 pcDNA3.0，構(gòu)建熒光素酶及綠色熒光蛋白雙報告基因重組質(zhì)粒 pc-IRE-LE，瞬時轉(zhuǎn)染入 HEK293T 細(xì)胞中，經(jīng)優(yōu)化和評價最終建立適用于高通量篩選 FoxO1 抑制劑的細(xì)胞模型。通過篩選獲得的陽性化合物可有效抑制報告基因的表達(dá)，并且能夠調(diào)控 FoxO1 靶基因的表達(dá)，有望成為 FoxO1 抑制劑的新型先導(dǎo)化合物，為應(yīng)用于糖脂代謝紊亂相關(guān)疾病的藥物發(fā)現(xiàn)提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料及試劑 真核細(xì)胞表達(dá)載體 pcDNA3.0 購自美國 Invitrogen 公司；克隆載體 pEASY Blunt zero、大腸桿菌 Trans5α、Trans110、TransT1、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶（HindIII、BglII、XbaI）、T4 DNA 連接酶購自美國 New England BioLabs 公司；引 物合成由美國 Invitrogen 公司完成；細(xì)胞株 HEK293T、HepG2 為本室保存；DMEM 培養(yǎng)基、 無糖 DMEM 培養(yǎng)基、葡萄糖、胎牛血清、0.25% 胰酶均購自美國 Gibco 公司；FoxO1 抑制劑 AS1842856 購自美國 Selleck 公司；MTT 溶液購自北京索萊寶科技有限公司；轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒提取試劑盒、螢火蟲熒光素酶試劑盒購自美國 Promega 公司；轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM3000 購自美國 Invitrogen 公司；總 RNA 提取試劑盒 Mag-Bind?Total RNA Kit 購自美國 Omega 公司；熒光定量 PCR 試劑盒 FastStart Universal SYBR Green PCR Master 購自瑞士 Roche 公司。

1.1.2 儀器 Veriti 96 Well Thermal Cycler 型PCR 儀為美國 Applied Biosystems 公司產(chǎn)品；EPS 301 型電泳儀為瑞典 Amersham Biosciences 公司產(chǎn)品；Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；Victor X5 型多標(biāo)記微孔板檢測儀為美國 PerkinElmer 公司產(chǎn)品；HERAcell 150 型 CO2培養(yǎng)箱和 Heraeus Fresco 17 centrifuge 臺式高速冷凍離心機為美國 Thermo Scientific 公司產(chǎn)品；CKX41 型倒置顯微鏡和 IX71 型熒光顯微鏡為日本 Olympus 公司產(chǎn)品；CFX96 型實時熒光定量 PCR 儀為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；MLS-3020 型高壓滅菌鍋為日本 Sanyo 公司產(chǎn)品；DYY-6C 型水平電泳槽為北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 pc-IRE-LE 雙報告基因表達(dá)載體的構(gòu) 建 將螢火蟲熒光素酶報告基因序列（GenBank No：KM359772，141-1790 bp）以及綠色熒光蛋白序列（Beyotime：D2707，677-1393 bp）用自我剪切肽 P2A[24]序列（GenBank No：KM359772，1791-1856 bp）連接，兩端加上酶切位點HindIII 和XbaI，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行全基因合成，獲得含有合成融合基因序列的酶切重組質(zhì)粒 pBluescript II SK-LE。雙酶切獲得目的片段及待連接的真核表達(dá)載體 pcDNA3.0 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用膠回收試劑盒對其純化提取，用 T4 DNA 連接酶于 16 ℃ 連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，于含濃度 100 μg/ml 氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)基平皿上選擇培養(yǎng)。挑取單克隆，擴增并提取質(zhì)粒，用內(nèi)切酶酶切鑒定。正確的重組質(zhì)粒命名為 pc-LE。設(shè)計的重組報告基因的調(diào)控序列為 5 個串聯(lián)排列的 IRE[25]序列 5 ×（5' TTGTTTTG 3'），其下游連接基本啟動子（minimal promoter，minP；GenBank No：KM359772，78-108 bp）序列。并在整個片段的 5'末端和 3' 末端分別設(shè)計了BglII 和HindIII 酶切位點。退火形成雙鏈的 5 × IRE 和 minP 片段，用上述方法酶切連入重組質(zhì)粒 pc-LE。在此過程中將只含 minP 的序列也按照同樣方式操作，作為實驗的陰性對照。

1.2.2 HEK293T 細(xì)胞系的培養(yǎng)及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 將凍存的 HEK293T 細(xì)胞株從液氮罐取出，細(xì)胞經(jīng)常規(guī)復(fù)蘇及傳代，培養(yǎng)基為 90% DMEM 完全培養(yǎng)基加入 10% 胎牛血清，細(xì)胞置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。待 HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度為 80% 時，用 0.25% 胰蛋白酶消化，用完全培養(yǎng)基稀釋接種于 96 孔板中，并同時使用脂質(zhì)體 LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染 pc-IRE-LE。

1.2.3 化合物的篩選 將瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的 HEK293T 細(xì)胞于 96 孔板中培養(yǎng)，20 h 后換為無血清培養(yǎng)基，初篩樣品存放于 96 孔板中，每個化合物樣品濃度為 10 mg/ml。加入待篩選的化合物，篩選用終濃度為 10 μg/ml，作用 24 h 后，用熒光顯微鏡觀察放大 200 倍的細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)，有明顯抑制作用的孔次拍攝保存。繼而用螢火蟲熒光素酶試劑盒檢測熒光值。

1.2.4 化合物毒性實驗 將待測化合物作用于 HEK293T 細(xì)胞 24 h 后，每孔加入 0.5% 的 MTT 溶液 10 μl，使 MTT 的終濃度為 0.5 mg/ml，繼續(xù)在 37 ℃ 條件下孵育 4 h。棄去培養(yǎng)液，PBS 漂洗 1 次，每孔加入 100 μl DMSO，顯微鏡下觀察結(jié)晶物都已充分溶解。在 570 nm 波長下檢測各孔的光吸收值（A）。細(xì)胞存活率（%）=（A加藥組/A對照組）× 100%。

1.2.5 實時熒光定量 RT-PCR 待測化合物作用 于 HepG2 細(xì)胞 24 h 后，提取細(xì)胞的總 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，采用熒光定量 PCR 試劑盒進(jìn)行實時熒光定量 PCR 反應(yīng)，利用數(shù)據(jù)分子軟件并計算 Ct 值并以 GAPDH 為內(nèi)參，采用相對 Ct 的方法對基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 Graphpad 5.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有的結(jié)果均以±s形式表示。兩組間比較采用非配對t檢驗，如果P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FoxO1 抑制劑高通量篩選模型的構(gòu)建

圖1 重組載體 pc-IRE-LE 的構(gòu)建及酶切鑒定[A：重組質(zhì)粒 pc-LE 經(jīng) Hind III 和 Xba I 酶切鑒定（M：DNA marker；1：錯誤轉(zhuǎn)化子；2～3：質(zhì)粒 pc-LE）；B：重組質(zhì)粒經(jīng) Hind III 和 Bgl II 雙酶切鑒定（M：DNA marker；1：錯誤轉(zhuǎn)化子；2：質(zhì)粒 pc-IRE-LE；3：質(zhì)粒 pc-minP-LE）；C：重組質(zhì)粒 pc-IRE-LE 構(gòu)建示意圖；D：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞的熒光素酶活性檢測；E：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞的 EGFP 表達(dá)的檢測；***P ＜ 0.001；n = 3；標(biāo)尺 = 1 mm]Figure 1 Construction and identification of recombinant plasmid pc-IRE-LE [A：Recombinant plasmid pc-LE was identified by Hind III and Xba I digestion (M：DNA marker; 1：Incorrect transformant; 2 - 3：Plasmid pc-LE); B：Recombinant plasmids were identified by Hind III and Bgl II (M：DNA marker; 1：Incorrect transformant; 2：Plasmid pc-IRE-LE; 3：Plasmid pc-minP-LE); C：Schematic diagram of recombinant plasmid pc-IRE-LE; D：Detection of luciferase activity in HEK293T cells transfected with recombinant plasmids; E：Detection of EGFP expression in HEK293T cells transfected with recombinant plasmids; ***P ＜ 0.001; n = 3; Scale bar = 1 mm]

首先將重組質(zhì)粒 pBluescript II SK-LE 通過Hind III 和XbaI 雙酶切獲得合成的融合基因序列（約 2.4 kb）連接至 pcDNA3.0 質(zhì)粒的多克隆位點，酶切鑒定結(jié)果如圖1A 所示。2 號、3 號克隆 的酶切片段大小正確，選取 2 號克隆命名為 pc-LE 并用于后續(xù)實驗。隨后將同時包含 FoxO1 結(jié)合位點（5 × IRE）和基本啟動子（minimal promoter，minP）的片段（約 70 bp）以及只含 minP 的片段（約 30 bp）連接至重組質(zhì)粒 pc-LE 報告基因上游，酶切鑒定結(jié)果如圖1B 所示，其中 2 號、3 號克隆大小正確，隨后測序鑒定序列均正確，分別命名為 pc-IRE-LE 及 pc-minP-LE。pc-IRE-LE 重組質(zhì)粒示意圖如圖1C 所示。

將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pc-IRE-LE 轉(zhuǎn)染至 HEK293T 細(xì)胞，并分別對其熒光素酶和綠色熒光蛋白報告基因的活性進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 pc-minP-LE 較轉(zhuǎn)染 pcDNA3.0 的細(xì)胞而言，熒光素酶活性顯著增加了 50 余倍（P＜ 0.001，圖1D），綠色熒光蛋白表達(dá)也顯著增強（圖1E），說明重組質(zhì)粒 pc-minP-LE 熒光素酶和綠色熒光蛋白都可以正常表達(dá)。與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒 pc-minP-LE 相比，轉(zhuǎn)染 pc-IRE-LE 的細(xì)胞的熒光素酶活性顯著增強了 1.5 倍（P＜ 0.001，圖1D），綠色熒光蛋白表達(dá)量也明顯增加（圖1E）。結(jié)果表明 FoxO1 結(jié)合位點的存在顯著增強了下游雙報告基因的活性，說明轉(zhuǎn)染 pc-IRE-LE 的細(xì)胞可用于構(gòu)建 FoxO1 抑制劑高通量篩選模型。

2.2 FoxO1 抑制劑高通量篩選模型的優(yōu)化

首先通過改變脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM3000 的用量對重組質(zhì)粒 pc-IRE-LE（0.1 μg）的轉(zhuǎn)染效率加以考察。通過優(yōu)化重組質(zhì)粒 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑兩者比例，確定當(dāng)脂質(zhì)體用量為 0.3 μl 時，重組質(zhì)粒 pc-IRE-LE 的轉(zhuǎn)染效率最高，熒光素酶的表達(dá)具有顯著的增強作用（圖2A），綠色熒光蛋白的表達(dá)也有所增加（圖2B）。

圖2 FoxO1 抑制劑高通量模型篩選條件優(yōu)化（A：不同劑量轉(zhuǎn)染試劑對該模型熒光素酶活性的影響；B：不同劑量轉(zhuǎn)染試劑對該模型 EGFP 的影響；C：不同濃度 DMSO 對該模型的熒光素酶活性的影響；D：0.5% DMSO 對該模型的 EGFP 表達(dá)的影響；***P ＜ 0.001 vs 溶劑對照；n = 3；標(biāo)尺 = 1 mm） Figure 2 Optimization of screening conditions of high-throughput model for FoxO1 inhibitor (A：Effect of different doses of transfection reagent on the luciferase activity in this model; B：Effect of different doses of transfection reagent on the expression of EGFP in this model; C：Effect of different concentrations of DMSO on the luciferase activity in this model; D：Effect of 0.5% DMSO on the expression of EGFP in this model; ***P ＜ 0.001 vs veh; n = 3; Scale bar = 1 mm)

二甲基亞砜（DMSO）作為待篩選化合物的主要溶劑，對細(xì)胞活性和生長有一定的影響。因此我們考察了不同濃度 DMSO 對重組質(zhì)粒 pc-IRE-LE 轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞的熒光素酶及綠色熒光蛋白活性的影響。結(jié)果如圖2C 所示，1% 及以內(nèi)濃度的 DMSO 均不會影響細(xì)胞熒光素酶的活性。結(jié)合化合物庫的情況，最終我們確定化合物篩選用濃度為 10 μg/ml，DMSO 終濃度為 0.5%，該濃度對細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)無影響（圖2D）。

2.3 FoxO1 抑制劑高通量篩選模型的評價

實驗室前期構(gòu)建了 FoxO1 表達(dá)質(zhì)粒 pc-FoxO1，我們通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pc-FoxO1 至 HEK293T 細(xì)胞從而表達(dá) FoxO1（圖3A），檢測構(gòu)建模型的反應(yīng)性。以不同的轉(zhuǎn)染比例（0:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1 和 5:1）將重組質(zhì)粒 pc-FoxO1 和 pc-IRE-LE 共轉(zhuǎn)染至 HEK293T 細(xì)胞，通過檢測雙報告基因從而對該細(xì)胞篩選模型加以考察。熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，隨著 FoxO1 表達(dá)量的增加，熒光素酶活性顯著增強（P＜ 0.001，圖3B）。同時，F(xiàn)oxO1 基因的過表達(dá)也可明顯增加綠色熒光蛋白的表達(dá)（圖3C）。以上結(jié)果說明該模型能夠靈敏且合理地反映 FoxO1 對 IRE 的調(diào)節(jié)作用。

為了模擬高糖病理狀態(tài)下的細(xì)胞，我們在完全無糖的培養(yǎng)基中加入不同濃度的葡萄糖，以檢測本模型對糖的反應(yīng)并且獲得能刺激 FoxO1 表達(dá)的葡萄糖最佳作用濃度。結(jié)果如圖3D 所示，在一定范圍內(nèi)，隨著葡萄糖濃度的增加，熒光強度也隨之增加。當(dāng)葡萄糖濃度為 4.5 g/L 時，熒光強度基本達(dá)到飽和，且該濃度符合人體高糖病理細(xì)胞所能達(dá)到的葡萄糖濃度[26]。所以，我們最終確定添加 4.5 g/L 的葡萄糖用于后續(xù)化合物的篩選。

AS1842856 是一個已報道的 FoxO1 小分子抑制劑，可通過影響 FoxO1 與其靶基因啟動子區(qū)的結(jié)合從而抑制其對下游靶基因的調(diào)節(jié)作用[27]。與 溶劑對照相比，AS1842856（1 μmol/L）作用后，熒光素酶活性顯著下降 50%（P＜ 0.001，圖3E），說明 AS1842856 可以顯著抑制 FoxO1 的結(jié)合活性。我們進(jìn)一步檢測了化合物 AS1842856 作用的量效關(guān)系，通過熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn) AS1842856 可劑量依賴地抑制 FoxO1 的結(jié)合活性，量效關(guān)系曲線如圖3G 所示，經(jīng)計算其 IC50為 1.2 μmol/L。AS1842856（1 μmol/L）也可明顯抑制綠色熒光蛋白的表達(dá)（圖3F）。

利用該陽性化合物 AS1842856 對本模型進(jìn)行了高通量篩選的進(jìn)一步評價，以熒光素酶活性定量計算篩選窗相關(guān)系數(shù) Z' 因子為 0.56，符合高通量篩選的要求。除此之外，我們通過對信噪比（S/N）、信號本底比（S/B）和信號本底變異系數(shù)（CV%）等各項參數(shù)從不同的角度對模型的置信程度、靈 敏度、重現(xiàn)性和有效性做出衡量和評價，根據(jù)細(xì)胞表達(dá)熒光素酶活性的變化，上述參數(shù)的結(jié)果分別 為 4.27、32.52 和 2.35，均符合高通量篩選標(biāo)準(zhǔn)。綜上評價，說明該模型構(gòu)建成功并可用于高通量 篩選。

2.4 FoxO1 抑制劑高通量篩選模型的應(yīng)用

本工作構(gòu)建的 FoxO1 抑制劑高通量篩選模型經(jīng)過優(yōu)化和評價之后，應(yīng)用該模型對國家新藥（微生物）篩選實驗室樣品庫進(jìn)行高通量篩選，初步 篩選了 6000 余個化合物，初篩獲得陽性化合物 110 個，初篩陽性率為 1.83%（圖4A）。對初篩陽性化合物進(jìn)行復(fù)篩，最終獲得陽性化合物 6 個，陽性率為 0.15%。這些化合物均可劑量依賴地抑制熒光素酶報告基因的表達(dá)（圖4B），同時還可明顯減少綠色熒光蛋白的表達(dá)（圖4C）。以上結(jié)果均說明篩選獲得的陽性化合物在模型上均有一定的 FoxO1 抑制劑活性。為了進(jìn)一步在細(xì)胞水平驗證這些陽性化合物的 FoxO1 抑制活性，我們首先利用 MTT 比色法檢測了不同濃度的陽性化合物對 HEK293T 細(xì)胞存活的影響。結(jié)果顯示，這些陽性化合物在 10～50 μg/ml 之間的濃度時，細(xì)胞存活率為對照組的 85% 以上，而低于 10 μg/ml 時，化合物對細(xì)胞的生長存活沒有影響（圖4D）。

2.5 篩選獲得的陽性化合物對 FoxO1 靶基因表達(dá)的影響

糖異生關(guān)鍵酶葡萄糖 6 磷酸酶（G6Pase）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）[22]、載脂蛋白 apoC-III 和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運蛋白（MTP）[23]是 FoxO1 轉(zhuǎn)錄因子的靶基因。為了確定 FoxO1 抑制劑篩選模型篩選獲得的陽性化合物是否影響 FoxO1 靶基因的表達(dá)，我們檢測了 HepG2 細(xì)胞中 PEPCK、G6Pase、apoC-III 和 MTP 的 mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示，已知陽性化合物 AS1842856 對 PEPCK、G6Pase、apoC-III 基因均有顯著的抑制作用，其結(jié)果與文獻(xiàn)[27]報道一致，而對 MTP 則表現(xiàn)出上調(diào)的作用。而經(jīng)該模型篩選獲得的陽性化合物中，化合物 7625-H9 除可顯著性降低 PEPCK、G6Pase、apoC-III 的 mRNA 水平外，還可以顯著抑制 MTP 的表達(dá)。某些陽性化合物如 7018-B3、7039-E6、7058-F2 等表現(xiàn)出對某些靶基因的抑制作用不明顯或者有上調(diào)作用，相關(guān)機制有待于進(jìn)一步的討論和研究。

圖3 FoxO1 抑制劑高通量篩選模型的評價[A：質(zhì)粒 pc-FoxO1 對 HEK293T 細(xì)胞中 FoxO1 mRNA 水平的影響；B：過表達(dá) FoxO1 對該模型中熒光素酶活性的影響（***P ＜ 0.001 vs 0:1）；C：過表達(dá) FoxO1 對該模型中 EGFP 表達(dá)的影響（pc-FoxO1:pc-IRE-LE = 5:1 的比例共轉(zhuǎn)染）；D：不同濃度葡萄糖對該模型的影響；E：AS1842856（1 μmol/L）對該模型中熒光素酶活性的影響；F：AS1842856（1 μmol/L）對該模型中 EGFP 表達(dá)的影響；G：AS1842856 在該模型中的量效關(guān)系曲線；***P ＜ 0.001；n = 3；標(biāo)尺 = 1 mm]Figure 3 Evaluation of high-throughput screening model for FoxO1 inhibitors [A：Effect of FoxO1 mRNA level by plasmid pc-FoxO1 in HEK293T cells; B：Effect of overexpression of FoxO1 on luciferase activity in this model (***P ＜ 0.001 vs 0:1); C：Effect of overexpression of FoxO1 on EGFP expression in this model (pc-FoxO1:pc-IRE-LE=5:1,co-transfected); D：Effect of different concentration of glucose in this model; E：Effect of AS1842856 (1 μmol/L) on luciferase activity in this model; F：Effect of AS1842856 (1 μmol/L) on EGFP expression in this model; G：Dose-effect curve of AS1842856 in this model; ***P ＜ 0.001 vs veh; n = 3; Scale bar = 1 mm]

圖4 FoxO1 抑制劑高通量篩選模型的應(yīng)用（A：利用該模型對化合物初步篩選的結(jié)果；B：該模型陽性化合物的量效關(guān)系曲線；C：10 μg/ml 陽性化合物對該模型 EGFP 表達(dá)的影響；D：該模型陽性化合物在 HEK293T 細(xì)胞上的細(xì)胞毒性檢測；veh 為溶劑對照即 0.5% DMSO；標(biāo)尺 = 1 mm） Figure 4 Application of the high-throughput screening model for FoxO1 inhibitors (A：Results of preliminary screening of compounds using this model; B：Dose-effect curves of positive compounds of this model; C：Effect of 10 μg/ml positive compounds on the EGFP expression in this model; D：Cytotoxicity assay of positive compounds in HEK293T cells; 0.5% DMSO; Scale bar = 1 mm)

圖5 陽性化合物對 HepG2 細(xì)胞中不同 FoxO1 靶基因 mRNA 水平的影響（A：化合物對 PEPCK mRNA 水平的影響；B：化合物對 G6Pase mRNA 水平的影響；C：化合物對 apoC-III mRNA 水平的影響；D：化合物對 MTP mRNA 水平的影響；化合物的濃度均為 10 μg/ml；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；n = 3） Figure 5 Effects of positive compounds on the mRNA levels of FoxO1 target genes in HepG2 cells (A：Effect of compounds on the mRNA level of PEPCK; B：Effect of compounds on the mRNA level of G6Pase; C：Effect of compounds on the mRNA level of apoC-III; D：Effect of compounds on the mRNA level of MTP; The concentration of compounds is 10 μg/ml; *P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001; n = 3)

3 討論

目前高通量藥物篩選是應(yīng)用較為廣泛的一種藥物研發(fā)手段。增強型綠色熒光蛋白是一種優(yōu)化的綠色熒光蛋白，具有諸多優(yōu)點，如結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、高效表達(dá)、檢測便捷、無種系依賴性等，是常用的熒光蛋白類報告基因之一[28]。但 EGFP 信號不易定量檢測，適用于初步定性分析。熒光素酶基因是一種具有靈敏度高、線性范圍廣、適用于定量檢測等特點的報告基因[29]，但其檢測費用較高。因此通過構(gòu)建同時含有這兩種報告基因的重組質(zhì)粒，可以整合兩者的優(yōu)勢，應(yīng)用更加準(zhǔn)確及便利。P2A 是一種具有自我加工能力的短肽，最早被研究鑒定的 2A 肽源于口蹄疫病毒，其剪切蛋白的功能是經(jīng)核糖 體“跳躍”而不是通過蛋白酶水解作用來實現(xiàn) 的[24,30]。將兩個基因克隆到 P2A 序列的兩側(cè)構(gòu)建融合基因，翻譯出的多聚蛋白會在編碼 P2A 區(qū)域的 C 末端斷裂為兩個蛋白，產(chǎn)生 C 端融合了 P2A 的上游熒光素酶蛋白和完整的下游綠色熒光蛋白[31-33]。使用核糖體進(jìn)入位點（internal ribosome entry site，IRES）也是較為常用的連接兩種報告基因的方式，但是 IRES 后面的 ORF 翻譯蛋白的水平有可能與 IRES 前面的 ORF 蛋白水平不一致，導(dǎo)致兩種蛋白表達(dá)量差異較大。而 P2A 則可保證兩種蛋白的表達(dá)量基本一致，兩者的摩爾比理論上是 1:1。因此本文利用雙報告基因的優(yōu)勢，在 HEK293T 細(xì)胞中實現(xiàn) Luc2 和 EGFP 兩個報告基因的同時表達(dá)，通過熒光顯微鏡檢測綠色熒光的強度可初步篩選出陽性化合物，隨后利用熒光素酶活性檢測進(jìn)行進(jìn)一步驗證，既節(jié)約成本又能提高篩選效率，保證實驗的準(zhǔn)確性。

我們對該細(xì)胞模型進(jìn)行了多方面深入的評價。首先利用重組質(zhì)粒 pc-FoxO1 轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞從而過表達(dá)細(xì)胞中的 FoxO1，隨著 FoxO1 表達(dá)量的增加，該模型的兩個報告基因的表達(dá)或活性也 均有顯著性的增強，說明模型對 FoxO1 信號敏感，可以利用該模型篩選 FoxO1 調(diào)節(jié)劑。再者，動物實驗研究表明，2 型糖尿病小鼠的肌肉組織和肝組織中 FoxO1 的表達(dá)量明顯高于對照組[34]。所以，為了模擬高糖病理狀態(tài)下的細(xì)胞，我們檢測了不同葡萄糖濃度條件下雙報告基因的響應(yīng)情況且獲得篩選用最佳葡萄糖作用濃度，為更合理地篩選出糖脂代謝相關(guān)的 FoxO1 抑制劑奠定基礎(chǔ)。葡萄糖濃度上調(diào)，該模型兩個報告基因的表達(dá)或活性也均有顯著增強，與文獻(xiàn)[27]報道一致，說明模型對葡萄糖信號敏感，模型可靠性強，結(jié)果具有可信度。然后，利用 FoxO1 小分子抑制劑 AS1842856 作為評價本篩選模型的陽性化合物。通過檢測熒光素酶活性發(fā)現(xiàn)，AS1842856 可使熒光素酶活性顯著下降 50%，并且 AS1842856 可劑量依賴地抑制 FoxO1 的結(jié)合活性，與文獻(xiàn)[27]報道一致，可用于對 FoxO1 抑制劑進(jìn)行篩選。最后，我們對篩選窗相關(guān)系數(shù)（Z' 因子）、信噪比（S/N）、信號本底比（S/B）和信號本底變異系數(shù)（CV%）等各項參數(shù)進(jìn)行檢測，從不同的角度對模型的置信程度、靈敏度、重現(xiàn)性和有效性做出衡量和評價，上述參數(shù)均符合高通量篩選標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述，我們通過增加或抑制 FoxO1 的表達(dá)或活性，多方位全面地對該模型進(jìn)行了評價，證實該篩選模型可靠、有效，可用于 FoxO1 抑制劑的高通量篩選。

通過動物模型和人類疾病的大量研究，發(fā)現(xiàn) FoxO1 在 T2DM 以及 NAFLD 等許多疾病發(fā)病機制中都扮演著關(guān)鍵角色[6-8,35-37]。進(jìn)食后，胰島素可通過信號通路激活激酶 PI3K/Akt，進(jìn)而磷酸化 FoxO1 使其轉(zhuǎn)運出核，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性被抑制，從而抑制 FoxO1 所調(diào)控的下游靶基因的表達(dá)。研究報道，黃酮類化合物可通過使 FoxO1 出核并增強高脂飲食喂養(yǎng)和 db/db 小鼠的肝臟和脂肪組織中的 Akt 和 FoxO1 的磷酸化來防止 T2DM[38]。枸杞多糖（LBPs）可減少大鼠肝臟中非酒精性脂肪肝炎（NASH）引起的損傷，在 NASH 大鼠中，PI3K/Akt 的肝活性受到抑制，所以 FoxO1 活性增加。LBP 的添加則逆轉(zhuǎn)了 PI3K/Akt/FoxO1 途徑的變化，表明 FoxO1 的活化可加劇 NASH[39]。這些具有 FoxO1 抑制活性的化合物有望作為具有抗糖尿病治療前景的先導(dǎo)化合物進(jìn)行后續(xù)的開發(fā)與應(yīng)用。本研究通過構(gòu)建 FoxO1 抑制劑高通量篩選模型將有助于篩選獲得新的 FoxO1 抑制劑，有望成為糖脂代謝相關(guān)疾病的先導(dǎo)化合物。通過篩選，我 們共獲得 6 個有明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系的陽性化合物，但是不同化合物對下游靶基因的作用具有差異性。如化合物 7018-B3、7039-E6、7058-F2 等表現(xiàn)出對某些靶基因的抑制作用不明顯或者有上調(diào)作用。推測其原因可能是這些化合物不僅抑制 FoxO1 與 IRE 位點的結(jié)合作用，還作用于其他轉(zhuǎn)錄因子或者調(diào)控蛋白，通過其他通路直接或者間接地作用于這些靶基因，相關(guān)機制有待于進(jìn)一步的研究。化合物 7625-H9 對 FoxO1 多個靶基因（PEPCK、G6Pase、apoC-III 和 MTP）均具有顯著抑制作用，雖然活性不及已知陽性化合物 AS1842856，但是該化合物對 MTP 也具有顯著下調(diào)作用，推測其對 FoxO1 調(diào)節(jié)特異性可能優(yōu)于 AS1842856，相關(guān)機制還有待于進(jìn)一步研究。

總之，F(xiàn)oxO1 在體內(nèi)的作用十分復(fù)雜，與人體多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，近些年來仍是科學(xué)研究的熱點。FoxO1 抑制劑的發(fā)現(xiàn)將為糖脂代謝相關(guān)疾病的藥物發(fā)現(xiàn)帶來新的可能，為臨床治療開辟新的路徑。

本工作成功構(gòu)建了含雙報告基因的 FoxO1 抑制劑高通量篩選細(xì)胞模型。在對該模型進(jìn)行了優(yōu)化及評價后，應(yīng)用本模型對化合物樣品庫中的樣品進(jìn)行篩選，并對篩選獲得的陽性化合物的生物活性進(jìn)行了驗證。陽性化合物 7625-H9 等多個化合物可顯著抑制 FoxO1 的活性以及 FoxO1 下游糖脂代謝相關(guān)靶基因的表達(dá)，有望發(fā)展為新型調(diào)節(jié)糖脂代謝的先導(dǎo)化合物，而該模型也為今后藥物的發(fā)現(xiàn)及研究提供了可靠有效的方法。