艾塞那肽單克隆抗體的制備及其ELISA檢測方法的建立

倪曉燕，杜賢宇，周樂春，程婷，儲成風(fēng)，沈毅，王榮海，宋禮華

艾塞那肽（exenatide）是 Exendin-4 的人工合成品，是首獲批準(zhǔn)應(yīng)用于 2 型糖尿病的胰高血糖素樣肽 1 受體激動劑（glucagon-like peptide-1 receptor agonist，GLP-1RA）[1-2]。注射給藥后，通過模擬胰島素抑制胰高血糖素的分泌，減慢胃排空和減少食欲從而達(dá)到控制血糖的效果[3-10]。研究資料表明，艾塞那肽的測定方法目前主要有高效液相法[11]和 ELISA 試劑盒法。其中高效液相法主要用于艾塞那肽制劑的含量、純度等檢測；ELISA 方法靈敏度高，樣品適用性廣，可用于艾塞那肽血藥濃度測定，但進(jìn)口試劑盒價格十分昂貴，且難以獲得，國產(chǎn)的試劑盒對樣品的處理要求較高、不易獲得穩(wěn)定的檢測結(jié)果。鑒于艾塞那肽的臨床應(yīng)用價值和未來的廣泛使用，建立一種靈敏、適用性強(qiáng)的艾塞那肽含量檢測方法具有十分重要的意義。

本文成功制備了艾塞那肽的單克隆抗體（McAb），并建立了檢測血樣中艾塞那肽含量的 ELISA 檢測方法，成功用于艾塞那肽制劑的臨床前藥學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及細(xì)胞 6～8 周齡雌 Balb/c 小鼠和 6 周齡 SD 大鼠均由安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司動 物實驗中心提供；SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞由安徽省醫(yī)學(xué)研究所 贈送。

1.1.2 試劑 艾塞那肽注射液（0.25 mg/ml）購自美國 Baxter Pharmaceutical Solutions LLC 公司；艾塞那肽由安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司生產(chǎn)；HAT 培養(yǎng)液、HT 培養(yǎng)液購自北京索萊寶科技有限公司；弗氏佐劑購自美國 Sigma 公司；辣根過氧化物酶（HRP）購自上海國源生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白購自美國 Amresco 公司；PierceTMUnstained Protein MW Marker 購自美國 Thermo Scientific 公司；吐溫 20、硫酸、辛酸、硫酸銨、TMB 等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 艾塞那肽單克隆抗體制備

1.2.1.1 細(xì)胞株制備 取艾塞那肽與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻乳化，分別免疫各雌鼠，每只 0.5 mg，7 d 給藥1 次；42 d 從雌鼠的尾部取血，間接 ELISA 法[12]測血清滴度，將滴度最高的雌鼠用艾塞那肽免疫，每只 1 mg，3 d 后取該雌鼠的脾細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將得到的脾細(xì)胞懸液與 骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0 混合，并在融合劑 PEG 的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，間接 ELISA 法進(jìn)行篩選，采用有限稀釋法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化，將雜交瘤細(xì)胞株分別注入不同的雌鼠體內(nèi)，收集腹水[13-14]。

1.2.1.2 McAb 的純化和篩選 將腹水中的抗體采用辛 酸-硫酸銨沉淀法[15]純化。取部分純化后的艾塞那肽單克隆抗體，采用 HRP 分別進(jìn)行標(biāo)記，加入等體積甘油，凍存，然后用棋盤法[16]進(jìn)行抗體篩選。具體方法為：用包被緩沖液稀釋艾塞那肽 McAb，濃度為 10、5.0、2.5 μg/ml 包被酶標(biāo)板，每一濃度包被 4 個縱行，每孔 100 μl，每孔均作復(fù)孔。4 ℃ 過夜，洗滌 3 次；封閉酶標(biāo)板，37 ℃ 孵育 2 h，洗滌 3 次；在橫行包被孔中依次加入系列倍比稀釋艾塞那肽（20、2、0.2 ng/ml），各 100 μl，同時設(shè)空白對照 37 ℃ 孵育 2 h，洗滌 3 次；在每一包被濃度的一個縱行中分別加入按 1:500、1:1000、1:2000、1:4000 稀釋的 HRP 標(biāo)記艾塞那肽 McAb，37 ℃ 孵育 2 h，洗滌 5 次；加 TMB 顯色液，37 ℃ 避光顯色 10～15 min，用 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取吸光度（A）值。

1.2.1.3 雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性考察 艾塞那肽 McAb 細(xì)胞株連續(xù)培養(yǎng)，按月檢測，小鼠體內(nèi)傳代，按傳代次數(shù)檢測，分別在 3 個月、6 個月復(fù)蘇檢測分泌抗體能力。

1.2.2 雙抗夾心 ELISA 方法的建立

1.2.2.1 雙抗夾心 ELISA 檢測方法 采用包被液將艾塞那肽 McAb 稀釋、包被、封閉；加入待測溶液，37 ℃ 溫育 2 h、洗滌 3 次；加入 HRP 標(biāo)記艾塞那肽 McAb（1:1000 倍稀釋），37 ℃ 溫育 1 h、洗滌 3 次；加入 TMB 混合液，37 ℃ 避光，顯色 15 min；加入終止液（2 mol/L 硫酸溶液）。酶標(biāo)儀 450 nm 波長條件下檢測吸光度值，根據(jù)吸光度值選用合適的抗體濃度和選取艾塞那肽檢測的線性范圍。

1.2.2.2 重復(fù)性檢測[17]批內(nèi)重復(fù)：用同一批制備的艾塞那肽 McAb，包被 1 塊 ELISA 板，檢測 6 組動物試驗血樣中陽性血清（百泌達(dá)注射組），每份血清設(shè)置 4 個復(fù)孔，測其A450，計算 CV 值得出批內(nèi)誤差。

批間重復(fù)：用同一批制備的艾塞那肽 McAb，包被 3 塊 ELISA 板，在相同條件下分別在 3 塊 ELISA 板內(nèi)檢測 6 份陽性血清，每份血清設(shè)置 4 個復(fù)孔，計算 CV 值得出批間誤差。

1.2.2.3 標(biāo)本檢測 待測樣品制備：精密稱取艾塞那肽，用稀釋液稀釋至 0.25 g/L，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液備用。選用試驗級 SD 大鼠（6 周齡左右）18 只，隨機(jī)分為 6 組，每組 3 只；每組隨機(jī)選 1 只皮下注射艾塞那肽注射液（百泌達(dá)），1 只注射等量生理鹽水，另 1 只不給藥，6 組動物分別進(jìn)行實驗，每組給藥后分別按第 0、5、15、30、60、120、180、240 min 采集血樣，離心取血清凍存待用。不給藥的大鼠血清作為稀釋血清用。按照建立的雙抗夾心 ELISA 方法，對 6 組動物血清進(jìn)行測定，記錄吸光度值描繪藥代曲線。

2 結(jié)果

2.1 檢測用單抗的確定

用艾塞那肽免疫 Balb/c 小鼠 5 次后，測定血清效價，血清稀釋度從 1:100 倍比稀釋至 1:25600，ELISA 檢測血清效價后選取血清效價為 1:25600 的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，融合率在 95% 以上。有限稀釋法 4 次克隆后獲得 5 株分泌高效價 McAb 雜交瘤細(xì)胞株（5F3、1C9、5C3、4H10 和 3D7）。棋盤法篩選出 2 株雜交瘤細(xì)胞（3D7、5F3）用于 ELISA 檢測。3D7、5F3 連續(xù)培養(yǎng) 6 個月，小鼠體內(nèi)的傳代 4 次以上，液氮中保存半年后復(fù)蘇，分泌抗體能力不變。純化后 3D7、5F3 McAb 的純度可達(dá) 90% 以上，見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以 10 μg/ml 的 3D7 為包被抗體，HRP-5F3（即辣根過氧化物酶標(biāo)記的艾塞那肽 McAb 5F3）為檢測抗體，HRP-5F3 的工作濃度 1:1000 倍稀釋，線性范圍以艾塞那肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.25 g/L）為母液梯度稀釋，結(jié)果在 0.125～16 ng/ml 范圍線性較好（圖2），檢測限為 2 ng/ml。

圖1 McAb 純化后的 SDS-PAGE

2.3 重復(fù)性

批內(nèi)重復(fù)性試驗的 CV 值為 5.7%，批間重復(fù)性試驗的 CV 值為 7.6%，說明本研究建立的方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.4 標(biāo)本檢測結(jié)果

采用建立的雙抗夾心 ELISA 方法，對 6 組動物血清進(jìn)行測定，結(jié)果基本一致，各時間點A值取平均值后繪制A值-時間曲線（圖3）。百泌達(dá)組在注射 5～30 min 后血樣A值會達(dá)到波峰，注射 180 min 后A值與生理鹽水組的A值數(shù)值趨向一致。

3 討論

研究獲得了分泌高效價 McAb 的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)純化、篩選后，McAb 純度大于 90%，液氮保存 6 個月，分泌抗體能力不變，證明制備方法可行。所建立的艾塞那肽含量雙抗夾心 ELISA 方法靈敏度高、重復(fù)性好，經(jīng)過樣本檢測驗證，此方法可用于藥代實驗中動物血樣的檢測。

雙抗夾心法的關(guān)鍵在于獲得包被抗體與酶標(biāo)抗體的最佳配伍，研究中以 3D7 為包被抗體，以 HRP-5F3 為檢測抗體，一系列稀釋后加入已知的不同濃度艾塞那肽標(biāo)準(zhǔn)品，選擇空白組A值較小，且A值和標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度之間的線性關(guān)系最為密切的作為最佳檢測工作濃度（3D7 包被濃度 10 μg/ml，HRP-5F3 的工作濃度 1:1000 倍稀釋為最佳 配伍）。

圖2 艾塞那肽 ELISA 檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 動物藥代實驗血樣測定結(jié)果

血樣樣本檢測中，除了文中涉及的研究之外，項目組還對不同稀釋液稀釋艾塞那肽標(biāo)準(zhǔn)品可能產(chǎn)生的差異進(jìn)行了研究。分別采用 PBS 稀釋和大鼠血清稀釋艾塞那肽標(biāo)準(zhǔn)品至不同濃度，記錄A值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，大鼠血清稀釋的A值會降低，但也具有良好的線性關(guān)系。因此，本研究建立的方法既可以檢測血清中艾塞那肽的含量，也可以檢測藥物制劑中艾塞那肽的含量，但在檢測不同樣本時，應(yīng)注意采用相同樣品稀釋液。