人精子IZUMO蛋白的制備與人抗精子抗體間接ELISA檢測方法的建立

劉雨晴，王鑫，劉鳳輝，羅厚龍，徐軍發(fā)

不孕不育是指夫妻在婚后至少同居一年，有正常性生活，未采取任何避孕措施而不能生育的狀態(tài)[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全世界有 6000 萬～8000 萬夫婦處于不育不孕的狀態(tài)，并且由于環(huán)境、激素和相關(guān)疾病等因素的影響，不孕不育夫婦的數(shù)量日益增多[2-3]。據(jù)統(tǒng)計，在所有引起不孕不育的原因中，免疫學(xué)因素所致的不孕不育癥占 10%～28%[4-5]。免疫性不孕不育是指由于生殖系統(tǒng)抗原的自身免疫或同種免疫引起的不孕不育癥。據(jù)報道，79% 的不明原因的不孕婦女體內(nèi)有抗精子抗體（ASAb）；在不孕不育癥患者中，16% 的男性患者和 29% 的女性患者體內(nèi)含有抗精子抗體，女方抗體發(fā)生率較男方高，強(qiáng)陽性者較 多[6]。

精子可以成為自身抗原和同種抗原，精子抗原可以使人體產(chǎn)生抗精子抗體。精子多肽抗原有很多種[7-9]，其中 IZUMO 蛋白在精子表面特異性表達(dá)，精子頂體反應(yīng)后可以與抗 IZUMO 抗體結(jié)合，而沒有發(fā)生頂體反應(yīng)的精子表面沒有 IZUMO 蛋白[10]。當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生抗 IZUMO 抗體，精子和卵細(xì)胞的結(jié)合會受到阻礙，受精卵無法形成[11]。

IZUMO 蛋白含有 377 個氨基酸，分為大片段胞外區(qū)域、跨膜區(qū)域和小片段胞內(nèi)區(qū)域，胞外區(qū)域包含 319 個氨基酸[12]。IZUMO 蛋白在哺乳動物中具有高度保守性，IZUMO 蛋白可分為 PA、PB、PC 三個區(qū)域，其中 PB 中的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（Ig-like domain）具有強(qiáng)烈的免疫原性，是使機(jī)體產(chǎn)生抗體的主要區(qū)域[13]，IZUMO 蛋白 PB 中的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（氨基酸 167～253）是影響精子和卵細(xì)胞結(jié)合的重要片段。

檢測抗精子抗體的方法有很多種，不同的方法，其敏感性、特異性及重復(fù)性有所不同[14-15]。ELISA 具備耗時短、可以大批量檢測、費用低、技術(shù)成熟等優(yōu)點，目前在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料

目的基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；質(zhì)粒 pET30a、菌株E.coliBL21 購于北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeI、HindIII 和 rTaqDNA 聚合酶購于日本 Takara 公司；PCR 擴(kuò)增試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、人 IgG 標(biāo)準(zhǔn)液、終止液購于北京索萊寶科技有限公司；Ni2+-NTA 凝膠層析柱購于美國 GE 公司；His-tag 小鼠單克隆抗體 IgG 購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IPTG 購于北京鼎國生物工程有限公司；96 孔酶標(biāo)板購于美國 Costar Inc 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人單克隆 IgG、TMB 一步法顯色劑購于美國 Thermo Fisher 公司。收集 2017年8 - 12月在東莞東華醫(yī)院生殖中心的 180 例血清標(biāo)本，其中健康孕婦血清 90 例、不孕婦女血清 90 例。

1.2 方法

1.2.1 人精子 IZUMO 蛋白基因序列的合成及重組質(zhì)粒的構(gòu)建 考慮到 IZUMO 蛋白的結(jié)構(gòu)特征，選擇 IZUMO 的 Ig 樣結(jié)構(gòu)域作為抗原，并選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) pET30a 用于表達(dá)具有 6 × His 的重組人 IZUMO。根據(jù) NCBI 基因庫（ID284359）人 IZUMO 的堿基序列和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏好，對目的序列進(jìn)行了修飾，插入酶切位點NdeI、Hind III 以及 6 × His 組氨酸標(biāo)簽，人工合成重組人 IZUMO 基因序列，其上下游引物分別是：IZUMO-P1 5' GGCATTCGACGACAGCAGGACTCC 3'；IZUMO-P2 5' GACCGACACTAAGTTTGCATGGCC 3'。PCR 擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件具體為：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 40 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。將酶切后的目的基因 PCR 片段和經(jīng)過雙酶切的載體 pET30a 大片段加入到 1.5 ml EP 管中，再加入 T4 DNA 連接酶，輕輕混勻后 16 ℃ 連接過夜。將擴(kuò)增后的目的基因克隆到 pET30a 載體構(gòu)建人 IZUMO 表達(dá)質(zhì)粒（pET30a-IZUMO-His）。雙酶切分析和 DNA 測序鑒定 IZUMO 基因及重組質(zhì)粒。

1.2.2 重組 IZUMO 蛋白的表達(dá)、純化與鑒定 將含有正確 IZUMO 基因序列的菌液接種于含有 50 μg/ml 卡那霉素的液體 LB 培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)過夜。當(dāng)菌液培養(yǎng)至OD600值約 0.6 時，用濃度為 1 mmol/L 的 IPTG 誘導(dǎo)，分別于 15 ℃ 誘導(dǎo) 16 h，37 ℃ 誘導(dǎo) 4 h。10 000 ×g離心 20 min 后收集菌體，超聲破碎，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳和 Western blot 來確定蛋白是可溶性表達(dá)還是包涵體表達(dá)。根據(jù)實驗，發(fā)現(xiàn)大部分目的蛋白存在于包涵體中。因此，將菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，收集包涵體提取蛋白，用含有鎳柱樹脂的層析柱進(jìn)行蛋白純化，對純化后的樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析，SDS-PAGE 電泳后的蛋白凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜并用 Western blot 檢測目的蛋白，加入稀釋濃度為 1:1000 抗 His-tag 小鼠單克隆抗體，室溫孵育 1 h；洗滌后，加入稀釋濃度為 1:1000 的 HRP 標(biāo)記的兔抗鼠 IgG，室溫孵育 1 h，曝光后在凝膠成像儀中拍照，分析免疫反應(yīng)條帶。

1.2.3 基于重組 IZUMO 蛋白的間接 ELISA 方法的建立以及臨床樣本的初步檢測 間接 ELISA 方法具體實驗步驟有：包被、封閉、加樣品、加一抗、加酶標(biāo)二抗、顯色、終止、比色。

用棋盤滴定法確定抗原包被濃度、最佳抗原包被液、最佳包被時間、最佳封閉液、最佳封閉條件、陽性標(biāo)準(zhǔn)品最佳稀釋濃度、最佳二抗工作濃度、最佳顯色時間等。優(yōu)化該方法的條件后，用 IZUMO 標(biāo)準(zhǔn)抗體，分別用同一試劑板和不同時間包被的試劑板進(jìn)行檢測，評價 IZUMO 抗體間接法檢測試劑盒的重復(fù)性。

用優(yōu)化的間接 ELISA 方法對收集的 90 位正常孕婦血清和 90 位臨床診斷為不孕的患者血清進(jìn)行檢測，制作 ROC 曲線，評價該方法的特異性與敏感性。

2 結(jié)果

2.1 人精子 IZUMO 蛋白基因序列的合成及重組質(zhì)粒的 構(gòu)建

從 NCBI 獲得人 IZUMO 基因序號：Gene ID284359，同時獲得人 IZUMO 具體堿基序列。IZUMO 基因經(jīng)插入修飾后全長為 384 bp，經(jīng)NdeI、HindIII 雙酶切為 41 bp 和 302 bp 兩個片段（圖1），連接到載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒 pET30a-IZUMO-His 分子量約為 5714 bp，經(jīng)NdeI、HindIII 雙酶切為 5422 bp 和 302 bp 兩個片段（圖2）。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21 菌種，體外擴(kuò)增并測序（圖3），目的堿基序列與 IZUMO 蛋白基因序列符合度高達(dá) 100%，測序正確的菌種可用于接下來的蛋白表達(dá)。

圖1 Nde I、Hind III 雙酶切鑒定 IZUMO 基因

圖2 Nde I、Hind III 雙酶切鑒定 pET30a-IZUMO-His 重組質(zhì)粒

圖3 陽性克隆菌 pET30a-IZUMO-His 質(zhì)粒堿基序列匹配度

圖4 純化、鑒定重組人 IZUMO 蛋白（A：重組 IZUMO 蛋白在 BL21 表達(dá)的 SDS-PAGE 分析；B：純化重組 IZUMO 蛋白 SDS-PAGE 分析；C：重組 IZUMO 蛋白在 BL21 表達(dá)的 Western blot 分析；D：純化重組 IZUMO 蛋白 Western blot 分析）

2.2 重組 IZUMO 蛋白的表達(dá)、鑒定

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌種后，獲得含有目的重組質(zhì)粒的工程菌，IPTG 誘導(dǎo)工程菌表達(dá)相對分子質(zhì)量為 10.7 kD 的蛋白，與含有 6 × His 的重組蛋白的預(yù)期分子量大小相符 （圖4A）。工程菌用 IPTG 在 37 ℃ 誘導(dǎo) 4 h，可高效表達(dá)重組 IZUMO 蛋白，且重組 IZUMO 主要存在于細(xì)胞裂解液沉淀物中，可溶性表達(dá)較少。用 His-tag 抗體進(jìn)行 Western blot 分析發(fā)現(xiàn)工程菌裂解產(chǎn)物的沉淀中含有大量相對分子質(zhì)量為 10.7 kD 的蛋白（圖4C）。綜上，工程菌在 37 ℃ 經(jīng) IPTG 誘導(dǎo) 4 h 后可高效表達(dá)不可溶性 IZUMO 蛋白。蛋白經(jīng)鎳柱純化后，純度可到 97% 以上，用 SDS-PAGE 電泳和 Western blot 對蛋白進(jìn)行再次鑒定（圖4B 和 4D）。重組 IZUMO 蛋白可成功大量表達(dá)，純化后的重組 IZUMO 蛋白可用于后期的間接 ELISA 實驗方法的建立。

2.3 基于 IZUMO 重組蛋白的間接 ELISA 方法的建立

通過對各組分的摸索和研究，當(dāng)陽性O(shè)D值接近 1，且陰性O(shè)D值小于 0.2，P/N 值較大，陰性對照較小時，最終建立的間接 ELISA 方法如下：抗原最佳包被濃度為 5 ng/ml、最佳抗原包被液為碳酸鈉緩沖液、最佳包被時間為 12～16 h、最佳封閉液為 3% 脫脂奶粉的 PBST、最佳封閉條件為 37 ℃ 2 h、陽性標(biāo)準(zhǔn)品最佳稀釋濃度為 1:100、二抗最佳工作濃度為 1:5000、最佳顯色時間為 20 min。

2.4 基于 IZUMO 重組蛋白的間接 ELISA 方法的重復(fù)性 評價

在同一包被板中檢測同一濃度 IZUMO 抗體標(biāo)準(zhǔn)品（1:1000 稀釋度），做 10 個復(fù)孔，計算復(fù)孔平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)，批內(nèi)重復(fù)性試驗 CV 值小于 0.05。此外，在不同時間包被 5 板該試劑盒，用于檢測 1:1000 稀釋度的 IZUMO 抗體，計算 5 板均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)，結(jié)果顯示批間重復(fù)性試驗變異系數(shù)也小于 0.05，該 ELISA 檢測方法的重復(fù)性良好（表1）。

表1 IZUMO 抗體間接法檢測試劑盒重復(fù)性評價

2.5 臨床標(biāo)本初步檢測及 ELISA 方法的特異性和敏感度

用上述優(yōu)化的間接 ELISA 方法對收集的 90 位正常孕婦血清和 90 位臨床診斷為不孕的婦女血清進(jìn)行檢測，OD值作 ROC 曲線（圖5），當(dāng) cut off 值為 3 時，該診斷方法的敏感度為 15.6%，特異性為 100%，曲線下面積為 0.945，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），說明該方法有一定的診斷價值。

圖5 間接 ELISA 檢測人血清 IZUMO 蛋白 ROC 曲線

3 討論

抗精子抗體的檢測對于不孕不育的診斷具有重要的臨床意義，而以重組人精子 IZUMO 蛋白為抗原的 ELISA 試劑盒，理論上既可以高效特異性捕獲女性不孕不育患者血清中的抗 IZUMO 抗體，又可以大批量操作，有望成為臨床檢測不孕不育的有效試劑盒。臨床上已經(jīng)有很多抗精子抗體試劑盒，但是據(jù)報道，國內(nèi)試劑盒靈敏度低，特異性差，無法滿足臨床診斷需求，錯誤判斷患者病情。國外試劑盒檢出率為 21.5%，符合文獻(xiàn)報道的 10%～30%[16]，但是價錢昂貴，無法推廣。且目前國內(nèi)外并沒有將重組 IZUMO 蛋白研制成試劑盒的報道，也沒有相關(guān)專利。本研究通過制備重組人精子 IZUMO 蛋白，成功建立并優(yōu)化了基于該蛋白的人抗精子抗體的間接 ELISA 檢測方法，建立了一種特異性好、價錢便宜的人抗精子抗體檢測方法。

利用優(yōu)化后的試劑盒對健康孕婦與不孕患者進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該方法的敏感度為 15.6%，特異性為 100%，提示該方法有一定的初步診斷價值。該方法敏感度低的原因可能是由于 IZUMO 抗體并非存在于每一位不孕患者外周血血清中，且導(dǎo)致不孕的原因有多種，免疫學(xué)因素所致的不孕不育癥僅占 10%～28%[4-5]。因此該方法在篩查臨床不孕不育時應(yīng)結(jié)合其他抗精子抗體的檢測方法。接下來仍需進(jìn)一步優(yōu)化該試劑盒，并擴(kuò)大臨床樣本，驗證上述試驗結(jié)果。若該方法具有臨床診斷價值，可納入更多患者，評價該試劑盒用于診斷不孕不育的靈敏度和特異性等臨床診斷效能。