高效液相色譜法測(cè)定獼猴桃酒中4 種有機(jī)酸含量

倪慧，李華佳，李可，尚雪嬌，朱永清，郭壯，*

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066）

獼猴桃又稱奇異果，因其口感酸甜，富含豐富的VE、VC、膳食纖維、黃酮和多酚等營(yíng)養(yǎng)成分[1-2]，且具有降血脂[3]和抗氧化[4]功能而深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。獼猴桃屬于呼吸躍變型水果，采摘后容易軟化和腐敗變質(zhì)[5]，因而對(duì)獼猴桃進(jìn)行深加工則顯得尤為重要。發(fā)酵制作獼猴桃酒不僅可以提高獼猴桃的利用率[6-7]，而且能更好發(fā)揮其特有的保健功效[8]，同時(shí)提高農(nóng)產(chǎn)品附加值。作為影響獼猴桃酒風(fēng)味形成的重要影響因素之一[9]，通過(guò)測(cè)定有機(jī)酸種類和含量可間接對(duì)獼猴桃酒品質(zhì)的優(yōu)劣進(jìn)行評(píng)價(jià)。

目前常采用酸堿滴定法[10]、離子色譜法[11]、紅外光譜法[12]和色譜法[13]對(duì)食品中有機(jī)酸的種類和含量進(jìn)行測(cè)定。GB5009.157-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中有機(jī)酸的測(cè)定》中約束了使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 測(cè)定食品中的有機(jī)酸，相較于其他方法，該方法具有準(zhǔn)確、方便和快捷等優(yōu)點(diǎn)。雖然可以參照GB2758-2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵酒及其配制酒》采用HPLC 法測(cè)定獼猴桃酒中的有機(jī)酸，但上述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)獼猴桃和獼猴桃酒中的特征酸——奎寧酸[14]的檢測(cè)方法并未加以描述，因此對(duì)獼猴桃酒中有機(jī)酸的測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化則顯得尤為重要。

本試驗(yàn)采用HPLC 對(duì)獼猴桃酒中奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的測(cè)定方法進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)10 個(gè)自釀獼猴桃酒中4 種有機(jī)酸的含量進(jìn)行了測(cè)定。通過(guò)本項(xiàng)目的開展，實(shí)現(xiàn)了獼猴桃酒中4 種有機(jī)酸的快速檢測(cè)和定量分析，以期為后續(xù)獼猴桃酒的生產(chǎn)工藝改良和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Lactobacillus plantarum（植物乳桿菌）：由湖北文理學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品菌種資源庫(kù)提供；獼猴桃酒：湖北文理學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所自釀；奎寧酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸：均為標(biāo)準(zhǔn)品，默克生命科學(xué)（上海）有限公司；磷酸氫二銨、磷酸二氫鉀、磷酸：均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；甲醇、乙腈、異丙醇：均為色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀、果膠酶（5 萬(wàn)U/g）：均為食品級(jí)，煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；0.22 μm 一次性針頭式過(guò)濾器和合成纖維樹脂濾膜：上海市新亞凈化器件廠。

LC-20ADXR 高效液相色譜儀（配置有LC-20AD XR 四元低壓梯度泵、SIL-20A XR 自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10AS vp 柱溫箱和SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器）、InertSustainSwift C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：日本島津公司；5810R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Ep－pendorf 公司；PHS-25 型pH 計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件的優(yōu)化

1.2.1.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.600 0 g 奎寧酸、0.600 0 g 蘋果酸、3.000 0 g 乳酸和1.200 0 g 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶解后于50 mL 容量瓶中定容，配制成不同濃度的有機(jī)酸母液待用。

1.2.1.2 供試溶液的配制

吸取各有機(jī)酸母液0.50 mL 于10 mL 容量瓶中，加入0.20 mL 的0.10 mol/L 磷酸溶液后定容，制成混合有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)供試溶液，取上清液過(guò)0.22 μm 針孔濾膜后直接進(jìn)樣。

1.2.1.3 磷酸鹽種類的選擇

分別配制溶度為0.08 mol/L 的磷酸氫二銨溶液和磷酸二氫鉀流動(dòng)相，pH 值為2.90，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

1.2.1.4 磷酸鹽濃度的選擇

分別配制溶度為 0.01、0.05、0.08 mol/L 的磷酸二氫鉀流動(dòng)相，pH 值為 2.90，進(jìn)樣量為 20 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

1.2.1.5 pH 值的選擇

配制溶度為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀流動(dòng)相，調(diào)節(jié)pH 值分別為 2.90、2.50 和 2.30，進(jìn)樣量為 20 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

1.2.1.6 有機(jī)相的選擇

分別設(shè)置乙腈和水相的體積比為 0 ∶100、5 ∶95 和10 ∶90，流動(dòng)相為 0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液，pH 值為2.90，進(jìn)樣量為 20 μL，柱溫為 30 ℃，流速為 1.00 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

1.2.1.7 流速的選擇

分別設(shè)置流速為 0.05、0.80、1.00 、1.20 mL/min，流動(dòng)相為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀，pH 值為2.90，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

1.2.1.8 柱溫的選擇

分別設(shè)置柱溫為25、30、35 ℃，流動(dòng)相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀，pH 值為2.90，進(jìn)樣量為20 μL，流速為1.00 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

1.2.2 獼猴桃酒中4 種有機(jī)酸的測(cè)定

1.2.2.1 獼猴桃酒的制作

稱取成熟獼猴桃洗凈打漿，添加4 g 的偏重亞硫酸鉀和0.06%的果膠酶攪拌均勻后調(diào)節(jié)糖度為22°Brix，接種60 g 釀酒酵母6 h 后分裝并按107CFU/mL 獼猴桃酒添加量分別接入10株植物乳桿菌，于22 ℃發(fā)酵7 d，再18 ℃進(jìn)行后發(fā)酵20 d 后待用，其編號(hào)為GJ1～GJ10。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別吸取 0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL 不同母液于10 mL 容量瓶，加0.20 mL 的0.10 mol/L 磷酸溶液后定容，配制出不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，溶液過(guò)0.22 μm 的針孔濾膜待用。分別以4 種有機(jī)酸的濃度為自變量x，峰面積為因變量y，采用外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算。

色譜條件：流動(dòng)相為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀，pH值為2.90；進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。

1.2.2.3 獼猴桃酒中4種有機(jī)酸含量的測(cè)定

吸取2.0 mL 獼猴桃酒于10 mL 容量瓶中，加入0.20 mL 的 0.10 mol/L 磷酸溶液，用 0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液定容?；旌暇鶆蚝筠D(zhuǎn)移至離心管中10 000 r/min離心15 min，取上清液過(guò)0.22 μm 針孔濾膜后直接進(jìn)樣，按照1.2.2.2 的色譜條件進(jìn)行4 種有機(jī)酸含量的測(cè)定。

1.2.3 方法性能研究

1.2.3.1 精密性試驗(yàn)

將1.2.1.2 中的供試樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣7 次，分別對(duì)檸檬酸、蘋果酸、乳酸和奎寧酸的峰面積進(jìn)行測(cè)定，然后計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（relative standard deviation，RSD）。色譜條件同 1.2.2.2。

1.2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取GJ1 樣品2 mL 于10 mL 容量瓶中，并加入0.20 mL 的0.01 mol/L 磷酸溶液，用0.01 mol/L 磷酸二氫鉀定容?；旌暇鶆蚝筠D(zhuǎn)移至離心管中10 000 r/min離心15 min，取上清液過(guò)0.22 μm 針孔濾膜待用。按照1.2.2.2 的色譜條件對(duì)其峰面積進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)操作7 次。

1.2.3.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取1.2.3.2 中濾液4 份，分別編號(hào)為GJ11、GJ12、GJ13 和 GJ14，其中 GJ11 不做任何處理，GJ12、GJ13 和GJ14 分別加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，色譜條件同1.2.2.2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用高效液相色譜工作站自帶的LCsolution 軟件將色譜圖另存為數(shù)據(jù)矩陣后，使用Origin 8.5 軟件（O－riginLab，MA，ΜSA）作圖。使用高效液相色譜工作站自帶的LCsolution 軟件對(duì)4 種有機(jī)酸進(jìn)行定性和定量分析。采用保留時(shí)間對(duì)有機(jī)酸種類進(jìn)行定性，采用外標(biāo)法對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 磷酸鹽的選擇

磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨對(duì)4 種有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果的影響如圖1所示。

圖1 流動(dòng)相磷酸鹽種類對(duì)4 種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.1 Effects of phosphate type of mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖1 可知，當(dāng)選擇磷酸鹽作為流動(dòng)相時(shí)，4 種有機(jī)酸都能得到較好的分離，且當(dāng)選擇磷酸氫二銨時(shí)，各有機(jī)酸的保留時(shí)間相較于磷酸二氫鉀小，檢測(cè)時(shí)間更短。但對(duì)比兩圖可知，以磷酸氫二銨作為流動(dòng)相時(shí)，奎寧酸、乳酸和檸檬酸的峰形相較之磷酸二氫鉀差，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。因此，本研究選擇使用磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相。

2.1.2 流動(dòng)相中磷酸鹽濃度的選擇

濃度為 0.01、0.05、0.08 mol/L 磷酸二氫鉀對(duì) 4 種有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果的影響如圖2所示。

圖2 流動(dòng)相磷酸二氫鉀濃度對(duì)4 種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.2 Effects of monopotassium phosphate concentration in mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖2 可知，磷酸二氫鉀的濃度對(duì)于4 種有機(jī)酸的保留時(shí)間和峰形均具有一定的影響，對(duì)比3 個(gè)不同磷酸二氫鉀濃度的色譜圖可知，隨著磷酸二氫鉀濃度的降低4 種有機(jī)酸的保留時(shí)間也相應(yīng)的縮短，從而縮短單次分析的時(shí)間。同時(shí)，觀察3 號(hào)和4 號(hào)峰可知，隨著磷酸二氫鉀濃度的升高，3 號(hào)和4 號(hào)峰的峰形也越差，且當(dāng)磷酸二氫鉀的濃度為0.08 mol/L 時(shí)，基線出現(xiàn)下偏。因此，本研究選擇0.01 mol/L 的磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相。

2.1.3 流動(dòng)相pH 值的選擇

pH 值為 2.30、2.50 和 2.90 的磷酸二氫鉀流動(dòng)相對(duì)4 種有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果的影響如圖3所示。

圖3 流動(dòng)相pH 值對(duì)4 種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.3 Effect of pH of mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖3 可知，流動(dòng)相的pH 值對(duì)4 種有機(jī)酸的保留時(shí)間和峰形均存在較大的影響，對(duì)比不同pH 值的色譜圖可知，隨著pH 值的上升4 種有機(jī)酸的保留時(shí)間均有較大的縮短，特別是檸檬酸的保留時(shí)間由7.20 min縮短至5.90 min。由圖3 亦可知，當(dāng)pH 值為2.30 時(shí)，基線并不穩(wěn)定，而有向上漂移的趨勢(shì)；當(dāng)pH 值為2.50時(shí)，3 號(hào)峰和4 號(hào)峰的分離度過(guò)大，保留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，且對(duì)比 3 個(gè)圖發(fā)現(xiàn)，pH 值為 2.30 和 2.50 時(shí)，均出現(xiàn)不同程度的拖尾現(xiàn)象。因此，本研究選擇磷酸鹽溶液的pH 值為2.90。

2.1.4 流動(dòng)相中有機(jī)相比例的選擇

調(diào)節(jié)乙腈和磷酸鹽溶液的體積比分別為0 ∶100、5 ∶95 和 10 ∶90，研究其對(duì) 4 種有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 流動(dòng)相中乙腈比例對(duì)4 種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.4 The effect of acetonitrile percentage in mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖4 可知，隨著有機(jī)相比例的不斷增加，4 種有機(jī)酸的保留時(shí)間也不斷縮短，且峰形、分離度和響應(yīng)信號(hào)均發(fā)生了較大變化。對(duì)比3 個(gè)圖可知，當(dāng)乙腈添加比例為0 時(shí)，4 種有機(jī)酸能達(dá)到很好的分離效果；而當(dāng)乙腈的添加比例為5%或10%時(shí)，4 種有機(jī)酸并不能達(dá)到相應(yīng)的分離效果，且與不添加乙腈相比，添加乙腈以后的檢測(cè)基線并不穩(wěn)定且噪音較大。因此，本研究選擇不添加乙腈。

2.1.5 流速的選擇

流動(dòng)相流速為 0.05、0.80、1.00、1.20 mL/min 時(shí)對(duì) 4種有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果的影響如圖5所示。

圖5 流動(dòng)相流速對(duì)4 種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.5 Effect of flow rate of mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖5 可知，流速對(duì)4 種有機(jī)酸的保留時(shí)間的峰形具有較大影響，隨著流速的增加，4 種有機(jī)酸的保留時(shí)間會(huì)有明顯的縮短，值得注意的是，當(dāng)流速為1.00 mL/min和1.20 mL/min 時(shí)，檸檬酸的保留時(shí)間并沒(méi)有較大差異。由圖5 亦可知，隨著流速的降低，4 種有機(jī)酸峰寬逐漸增加，且出現(xiàn)較為明顯的拖尾現(xiàn)象，而對(duì)比流速為1.00 mL/min 和1.20 mL/min 時(shí)的色譜圖發(fā)現(xiàn)，流速為1.20 mL/min 時(shí)檸檬酸的峰形較差且壓力相對(duì)較高。因此，本研究選擇流速為1.00 mL/min。

2.1.6 柱溫的選擇

柱溫箱的溫度為25、30、35 ℃時(shí)對(duì)4 種有機(jī)酸保留時(shí)間及分離效果的影響如圖6所示。

圖6 柱溫對(duì)4 種有機(jī)酸分離效果的影響Fig.6 Effect of column temperature on the separation of 4 kinds organic acids

由圖6 可知，柱溫對(duì)于奎寧酸、蘋果酸和乳酸的保留時(shí)間并沒(méi)有較大影響，而對(duì)檸檬酸的保留時(shí)間影響卻較大，當(dāng)柱溫為30 ℃時(shí)，單次分析時(shí)間最短。由圖6亦可知，當(dāng)柱溫為25 ℃和35 ℃，蘋果酸、乳酸和檸檬酸的峰形相較于30 ℃時(shí)的峰形差。因此本研究選擇柱溫為30 ℃。

2.2 獼猴桃酒中4 種有機(jī)酸含量的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)回歸方程

分別以4 種有機(jī)酸的濃度為自變量x，色譜峰面積為因變量y 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的計(jì)算，結(jié)果如表1。

表1 4 種有機(jī)酸回歸方程Table 1 Linear regression equations of detection for 4 kinds organic acids

由表1 可知，4 種有機(jī)酸的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)均在0.999 0 以上，可見(jiàn)各有機(jī)酸在濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。同時(shí)其檢出限在4.50 mg/L～6.60 mg/L 之間，具有較高的精度，可以滿足試驗(yàn)要求。

2.2.2 獼猴桃酒中4 種有機(jī)酸含量的測(cè)定

使用HPLC 法對(duì)10 個(gè)獼猴桃酒樣品中4 種有機(jī)酸測(cè)定的結(jié)果如表2所示。

表2 HPLC 法測(cè)定獼猴桃酒中4 種有機(jī)酸含量（n=10）Table 2 Contents of 4 kinds organic acids in 10 kiwifruit wine samples（n=10）

由表2 可知，10 種獼猴桃酒中均檢測(cè)出奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸，其含量范圍分別為7.83 mg/mL～8.60 mg/mL、7.17 mg/mL ～7.66 mg/mL、0.84 mg/mL ～0.94 mg/mL 和 4.53 mg/mL～6.09 mg/mL。由此可見(jiàn)，奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸為獼猴桃酒中的主要有機(jī)酸。

2.3 方法性能研究

2.3.1 精密性試驗(yàn)結(jié)果

將1.2.1.2 中的供試樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣7 次，分別對(duì)4 種有機(jī)酸的峰面積進(jìn)行測(cè)定，然后計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（relative standard deviation，RSD），精密度試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

由表3 可知，奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值均在0.10%以下，因而使用本研究?jī)?yōu)化的色譜條件測(cè)定獼猴桃酒中4 種有機(jī)酸時(shí)具有良好的精密性。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.2.2 中的色譜條件對(duì)GJ1 獼猴桃果酒中各有機(jī)酸含量進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)操作7 次，計(jì)算4 種有機(jī)酸峰面積的RSD，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision experiment results

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Repetitive test results

由表4 可知，奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值均在1.00%以下，因而使用本研究?jī)?yōu)化的色譜條件測(cè)定獼猴桃酒中4 種有機(jī)酸時(shí)具有良好的重復(fù)性。

2.3.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

參照1.2.2.2 中的色譜條件進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，其結(jié)果如表5所示。

由表5 可知，奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸其平均回收率分別為100.19%、99.64%、99.25%和99.67%，因而使用本研究?jī)?yōu)化的色譜條件測(cè)定獼猴桃酒中4 種有機(jī)酸時(shí)可以很好的滿足試驗(yàn)要求。

表5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Spiking recovery test results

續(xù)表5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Continue table 5 Spiking recovery test results

3 結(jié)論

本研究建立了反相高效液相色譜法快速測(cè)定獼猴桃酒中奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的方法，流動(dòng)相為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀，pH 值2.90，色譜柱為InertSustainSwift C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速為1.00 mL/min，柱溫為 30 ℃，進(jìn)樣量為 20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，采用該方法分析發(fā)現(xiàn)，奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸為獼猴桃酒中的主要有機(jī)酸。