茶葉中蒽醌的內(nèi)標(biāo)-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定

高慧，汪洋，邢燕，*，王勤，尚萌琳

（1.淄博市疾病預(yù)防控制中心，山東 淄博 255026；2.山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 濟南 250000）

中國是全球較早的茶葉出產(chǎn)和銷售的國家，也是全球最大的茶葉消費國，隨著經(jīng)濟全球化發(fā)展，茶葉的出口量也持續(xù)增加。蒽醌在自然界中廣泛存在，茶葉中蒽醌的殘留污染可能來源于農(nóng)藥殘留或產(chǎn)品包裝。因歐盟認(rèn)為蒽醌具有致癌性，2014年10月，歐盟新發(fā)布的（EU）No1146/2014 中規(guī)定了茶葉中蒽醌的最高限量為0.02 mg/kg[1]。我國尚無最高限量要求。2014年我國茶葉出口同比下降。中國輸歐茶葉因不符合限值要求被通報27 次，其中蒽醌8 次，居首位[2]。研究茶葉中蒽醌的污染來源和控制技術(shù)，降低茶葉中蒽醌污染物含量，破除歐盟技術(shù)壁壘是一個急需解決的問題，因此，建立茶葉中蒽醌的定量檢測方法至關(guān)重要。

9，10-蒽醌，又名蒽醌（anthraquinone，CAS No.84-65-1），是一種黃色針狀結(jié)晶，易溶于熱苯、熱甲苯、乙醇、乙醚和氯仿，不溶于水，蒽醌常存在于高等植物和低等植物地衣類和真菌類的代謝產(chǎn)物中，主要用于染料生產(chǎn)的中間體，是媒染染料、酸性染料和還原染料的主要原料。還用做紙制品印花的導(dǎo)氧劑。GB/T 23204-2008《茶葉中519 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜法》[3]涉及蒽醌殘留量的測定，但為定性檢測方法，不適合于茶葉中微量蒽醌的測定。目前報道的蒽醌類定量測定的方法主要有分光光度法[4-7]、高效液相色譜法[8-10]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-16]、高效毛細(xì)管電泳法[17]等。其中分光光度法和高效液相色譜法多為測定總蒽醌含量，不適合于茶葉中蒽醌的測定；氣相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法多為凝膠聯(lián)合凈化或SPE 小柱凈化，能夠較好的純化分離出目標(biāo)物，但凈化過程比較繁瑣，耗時較長；高效毛細(xì)管電泳法普及率比較低。本研究通過對樣品前處理條件、色譜條件等的優(yōu)化，建立了一種準(zhǔn)確、快速測定茶葉中蒽醌的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）內(nèi)標(biāo)分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7010 三重四極桿氣質(zhì)譜聯(lián)用儀[配電子轟擊離子源（EI）]：美國 Agilent 公司；N-EVAP 112 氮吹濃縮儀：美國 OA-SYS 公司；CP-225D 電子天平：德國Sartorius 公司；ST-16R 高速冷凍離心機：美國Thermo公司；KS-500D 型超聲波清洗器：寧波科生儀器廠；Milli-Q 超純水系統(tǒng)：美國Millipore 公司。N-丙基乙二胺（Bondesil-PSA，40 μm，100 gm）、Bondesil-C18（40 μm，100 mg）：美國 Agilent 公司。無水硫酸鈉（AR 級）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（HPLC 級）、丙酮（HPLC級）、環(huán)己烷（HPLC 級）、乙酸乙酯（HPLC 級）：德國Merck 公司；蒽醌（純度≥98.0%）：上海安譜公司；蒽醌-D8 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度＞99.0%）：美國TRC 公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

稱取0.010 0 g 蒽醌，加丙酮超聲、溶解、稀釋定容至10 mL，濃度為1 000 μg/mL，即為蒽醌標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取蒽醌標(biāo)準(zhǔn)儲備液10 μL，加環(huán)己烷-乙酸乙酯（1+1）至 10 mL，即為蒽醌應(yīng)用液，濃度為 1 μg/mL，于 0 ℃～4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。稱取0.010 0 g 蒽醌-D8 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加丙酮超聲、溶解、稀釋定容至10 mL；再取100 μL，加環(huán)己烷-乙酸乙酯（1+1）至 1 mL，即為蒽醌-D8 內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液，濃度為 100 μg/mL，于 0 ℃～4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：HP-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣，純度＞99.999%，恒流模式，進(jìn)樣口溫度：280 ℃；流速1.0 mL/min；程序升溫：初溫100 ℃，保持1 min，以 10 ℃/min 升到 200 ℃，保持 2 min，繼續(xù)以 25 ℃/min升到 280 ℃，保持 10 min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電子轟擊離子源（EI）；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：300 ℃；電子能量 70 eV；碰撞氣：高純氬氣，純度＞99.999%，；溶劑延遲：3.75 min；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式；駐留時間：0.10 s。標(biāo)準(zhǔn)的保留時間、定性離子、定量離子對等具體質(zhì)譜參數(shù)見下表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜參數(shù)表Table 1 The mass spectrometry parameters of standards

1.3.3 樣品前處理

將100 g 茶葉用粉碎機粉碎，混勻，分裝于兩個50 mL 潔凈棕色玻璃瓶中，一份用于遮光密閉保存留樣，另外一份用于檢測。

1.3.3.1 樣品提取

精確稱取2 g（精確至0.001 g）粉碎、混勻茶葉樣品于50 mL 離心管中，加水3 mL，加蒽醌-D8 內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液 10 μL，渦旋 30 s 潤濕樣品，加 10 mL 乙腈，超聲提取30 min，加無水硫酸鈉2 g，渦旋混勻1 min，以8 000 r/min 離心10 min。上清液待凈化。

1.3.3.2 樣品QuEChERS 凈化

取乙腈提取液約8 mL，加入0.8 g 無水硫酸鈉，0.8 g PSA 粉末和0.4 g C18 固相吸附劑，渦旋1 min，8 000 r/min 離心 5 min。取上清液 5.0 mL，40 ℃氮吹濃縮至近干，加1.0 mL 乙腈溶解殘渣，渦旋1 min，以8 000 r/min 離心 5 min，上清液過 0.22 μm 聚四氟乙烯過濾膜，待測定。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別準(zhǔn)確吸取1.2 中蒽醌標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（1 μg/mL）10、20、50、100、150、200 μL 于 1 mL 樣品瓶中，分別各加入蒽醌-D8 內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液（100 μg/mL）5 μL，用乙腈定容至 1 mL，蒽醌-D8 的濃度為 0.50 μg/mL，蒽醌標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為 10、20、50、100、150、200 ng/mL。以蒽醌的濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對（208＞180）的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)總離子流圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)總離子流圖Fig.1 The total ion chromatogram of standard

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇與優(yōu)化

由于茶葉中基質(zhì)復(fù)雜，測定茶葉中蒽醌必須選擇能夠很好的把目標(biāo)物與干擾物分離的色譜柱，試驗比較了 HP-5MS、DB-5MS、DB-1701P 3 種不同的色譜柱，DB-5MS、DB-1701P 和 HP-5MS 3 種色譜柱的樣品加標(biāo)色譜圖見圖2、圖3、圖4。

改變色譜分離條件，觀察分離情況，不同色譜柱對目標(biāo)物的分離情況見下表2。

表2 結(jié)果表明，HP-5MS 較其他兩種色譜柱分離效果更好。

進(jìn)樣口溫度過高，會致使蒽醌分解，溫度過低，蒽醌汽化不完全，靈敏度均會下降。考查了240 ℃到290 ℃之間的進(jìn)樣口溫度，不同進(jìn)樣口溫度對蒽醌峰面積的影響見圖5。

由圖5 發(fā)現(xiàn)溫度在280 ℃時，蒽醌氣化完全，未見分解。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇與優(yōu)化

圖2 DB-5MS 樣品加標(biāo)色譜圖Fig.2 The total ion chromatogram of adding sample separating by DB-5MS chromatographic column

圖3 DB-1701 樣品加標(biāo)色譜圖Fig.3 The total ion chromatogram of adding sample separating by DB-1701 chromatographic column

圖4 HP-5MS 樣品加標(biāo)色譜圖Fig.4 The total ion chromatogram of adding sample separating by HP-5MS chromatographic column

表2 不同色譜柱的分離情況Table 2 The separation results of adding sample by different chromatographic columns

圖5 不同進(jìn)樣口溫度對蒽醌峰面積的影響Fig.5 The effect of different inlet temperatures on anthraquinone peak area

在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行全掃描（Scan），得到蒽醌的質(zhì)譜圖，選擇質(zhì)核比較大，相對豐度高的離子作為產(chǎn)物離子。再用MRM 方式掃描，為保證掃描結(jié)果的準(zhǔn)確度，按待測組分保留時間分組，使待測物有充足的時間掃描。分別選擇了豐度較高的兩組離子m/z 208，180，m/z 208，152 為定量和定性離子對，對產(chǎn)物離子進(jìn)行掃描。為提高檢測的靈敏度，根據(jù)離子信息，選取不同的碰撞能量觀察離子對的響應(yīng)情況，最終選取了10 eV 做為定量和定性離子對的碰撞能量。

2.3 樣品的基質(zhì)效應(yīng)

氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品時，有時基質(zhì)對待測物的離子具有抑制或增強效應(yīng)，因此選用內(nèi)標(biāo)法定量以提高靈敏度和準(zhǔn)確性。分別制備用空白基質(zhì)樣品溶液和乙腈稀釋的蒽醌和蒽醌-D8 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，對空白茶葉樣品進(jìn)行低、中、高3 個濃度的添加水平試驗，用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，乙腈配制與空白基質(zhì)樣品溶液配制的工作曲線回收率沒有明顯差異，比較接近，故選用了乙腈配制標(biāo)準(zhǔn)工作液。不同溶劑蒽醌的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

表3 不同溶劑蒽醌的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 The recovery rate and relative standard deviation（RSD）of anthraquinone in different solvents

2.4 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.4.1 提取效應(yīng)

為了測試茶葉樣品加水后檢測，對檢測結(jié)果有無影響。試驗稱取了8 份蒽醌陽性茶葉樣品，其中4 份加水3 mL，渦旋30 s 潤濕樣品，另4 份不加水，分別加入10 mL 乙腈，后續(xù)步驟按照1.3.3.1 和1.3.3.2 提取、凈化。試驗數(shù)據(jù)顯示，茶葉樣品加水潤濕后再加溶劑提取、凈化，回收率更高。結(jié)果見表4。

表4 樣品測試結(jié)果比較Table 4 The comparison of sample results

2.4.2 樣品凈化的選擇

分別選用了SPE 小柱和QuEChERS 兩種凈化方式進(jìn)行比較。首先選用了TPC（ProElut TPC-2 固相萃取柱，6 mL，迪馬公司）小柱填充物上加入1 g 無水硫酸鈉，用 10 mL 乙腈-甲苯（3+1，體積比）活化；乙腈提取液 5.0 mL 上樣，棄去流出液；用 8 mL 甲苯-乙腈（1+3，體積比）淋洗，棄去流出液；再用12 mL 甲苯-乙腈（1+3，體積比）洗脫，抽干，收集洗脫液。40 ℃氮吹濃縮至近干，加 1.0 mL 乙腈溶解殘渣，渦旋 1 min，8 000 r/min 離心5 min，上清液過0.22 μm 聚四氟乙烯過濾膜，待測定。QuEChERS 凈化方式一：取乙腈提取液約8 mL，加入0.8 g 無水硫酸鈉，0.8 g 石墨化炭黑粉末和0.4 g C18 固相吸附劑，渦旋 1 min，8 000 r/min 離心 5 min。取上清液5.0 mL，40 ℃氮吹濃縮至近干，加1.0 mL 乙腈溶解殘渣，渦旋1 min，以8 000 r/min 離心5 min，上清液過0.22 μm 聚四氟乙烯過濾膜，待測定。QuECh－ERS 凈化方式二同1.3.3.2。不同凈化方式對蒽醌回收率的影響見圖6。

圖6 不同凈化方式對蒽醌回收率的影響Fig.6 The effect of different purification ways on the recovery rate of Anthraquinone

圖6 檢測結(jié)果表明，選用QuEChERS 凈化方式二凈化效果較好和回收率最高，因此選用了1.3.3.2 QuEChERS 凈化方式。

2.5 線性范圍及檢出限

在本試驗條件下，按照1.3 的試驗條件進(jìn)行測定，以蒽醌的濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對（208＞180）的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：蒽醌在10 ng/mL～200 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。同時做空白樣品加標(biāo)試驗，以3 倍信噪比計算檢出限（limit of detection，LOD），以信噪比 10 倍計算定量限（limit of quantitative determination，LQD），結(jié)果見表5。

表5 蒽醌的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、LOD、LQDTable 5 The linear equation，linear range，correlation coefficient，LOD，LQD of anthraquinone

2.6 加標(biāo)回收率和精密度

選取了未檢出蒽醌的綠茶、紅茶、烏龍茶、白茶4種樣品，分別稱取2 g（精確至0.001 g）樣品于50 mL離心管中，分別添加質(zhì)量濃度為20、50、200 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平取6 份平行樣，充分混勻后，按照最佳前處理和色譜質(zhì)譜分析條件進(jìn)行測定，回收率在 87.1%～98.4%之間，RSD 為 1.23%～4.12%，結(jié)果見表6。茶葉樣品總離子流圖見圖7，茶葉樣品加標(biāo)總離子流圖見圖8。

表6 蒽醌的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 6 The recovery and relative standard deviation（RSD）of anthraquinone

2.7 樣品測定

隨機采集市售茶葉50 份，包括綠茶15 份、紅茶15 份、烏龍茶10 份、白茶10 份。其中蒽醌檢出12 份，檢出率24.0%，其中紅茶檢出率最高為33.3%，白茶檢出率最低為13.3%；超標(biāo)8 份，超標(biāo)率為16.0%，其中、綠茶 2 份、紅茶 3 份、烏龍茶 2 份、白茶 1 份。通過測定結(jié)果可以看出，茶葉中的蒽醌確有檢出。該方法適用于茶葉中蒽醌的測定。

3 結(jié)論

本研究通過對茶葉樣品的前處理條件和色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化，選擇了最佳檢測條件，實現(xiàn)了對茶葉中蒽醌的測定，達(dá)到了很好的分離效果。該方法具有操作簡便、線性范圍寬、檢出限低、靈敏度高、雜質(zhì)干擾少及結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點。因茶葉中干擾物復(fù)雜，本文選用了QuEChERS 凈化方式，選用了無水硫酸鈉、

圖7 茶葉樣品的總離子流圖Fig.7 The total ion chromatogram of tea sample

圖8 茶葉樣品加標(biāo)的總離子流圖Fig.8 The total ion chromatogram of adding tea sample

PSA 粉末和C18 固相吸附劑，既能實現(xiàn)茶葉中復(fù)雜干 擾物的去除又能實現(xiàn)待測物的完全保留和洗脫，實現(xiàn)了氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對茶葉中蒽醌的定量檢測，滿足了茶葉中蒽醌的分析測試要求。