銀耳藍莓酵素發(fā)酵過程中體外抗氧化性能變化及品質的研究

羅澤江，張永生，李琢偉，王鳳，張麗，王天一，劉俊梅

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

酵素是指利用益生菌發(fā)酵，由一種或多種新鮮蔬菜、水果、食用菌、中草藥等制備得到的功能性液體或固體，因富含功效酶、維生素、微量元素、有機酸、氨基酸和多酚類物質，從而受到國內(nèi)外研究人員的重視，具有極大的發(fā)展?jié)摿1]。

盡管酵素產(chǎn)品越來越被人們所關注，仍不能滿足市場需求，新型的功能性酵素產(chǎn)品（以人參、靈芝、食用菌等為原料）逐漸成為研究的熱點。隨著人民生活水平的提高和膳食結構的改善，食用菌產(chǎn)品已經(jīng)成為國內(nèi)外消費者主要食品之一[2]。以長白山有機銀耳、有機藍莓及植物提取液為主要原料，復合益生菌定植發(fā)酵，生產(chǎn)得到銀耳藍莓酵素。

銀耳藍莓酵素（tremella blueberry enzymes，TBE）中的主要原料銀耳，又稱白木耳，呈雛菊狀或雞冠狀，半徑3 cm～6 cm，柔軟有彈性。銀耳所含化學成分較為復雜，古今史著和歷代醫(yī)學家通過臨床驗證，銀耳具有滋養(yǎng)陰虛、滋潤肺部、清潔眼睛、緩解咳嗽、滋潤腸道、清爽大腦和保護皮膚等效果[3]。藍莓，又名歐洲越橘，屬于杜鵑花屬。藍莓果實的平均質量為0.5 g～2.5 g。作為一種新的果樹，歐美國家首先研究了藍莓的栽培和深加工[4]。藍莓果實具有很強的藥用價值和營養(yǎng)保健功能。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織還將藍莓列為人類5大健康食品之一（蘋果、杏、香蕉、黑莓、藍莓）。藍莓果實含有豐富的營養(yǎng)成分，具有改善腦力、預防便秘、改善視力、降低血糖水平和增強免疫力等功能。藍莓果實中還含有豐富的黃酮類和多糖類，花青素，維生素E和氨基酸遠遠超過其他水果。因此又被贊譽為“黃金漿果”。

酚類物質是銀耳藍莓酵素的一項重要指標，它決定了產(chǎn)品的色澤和風味，而且對產(chǎn)品的各種保健功效也有很大貢獻[5-6]。本試驗對不同發(fā)酵時期的銀耳藍莓酵素的總酚含量及相關抗氧化指標進行檢測分析，并對銀耳藍莓酵素的理化指標及主要功效酶進行分析測定。探討了銀耳藍莓酵素發(fā)酵過程中抗氧化活性動態(tài)的變化，評價銀耳藍莓酵素的抗氧化性能及其品質，為進一步研究銀耳藍莓酵素發(fā)酵過程的動態(tài)變化規(guī)律及發(fā)酵工藝的改善提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀耳藍莓酵素發(fā)酵液：吉林華鑫菌業(yè)有限公司。

福林酚、沒食子酸、鄰苯三酚、1,1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH）、2,2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS+）、過硫化鉀、三氯乙酸、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、3，5-二硝基水楊酸、維生素A、維生素C、維生素 E、2，6-二氯靛酚鈉、草酸、1，10-菲繞啉、三氯化鐵：北京鼎國生物試劑有限公司。

聚乙烯醇（polyvinyl alcohol vinylalcohol polymer，PVA）、硝基四氮咪唑藍（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）：美國 SGIMA 公司。

氫氧化鈉、鹽酸、福林試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、乳酸、乳酸鈉、硼酸鈉、三氯醋酸、干酪素、L-酪氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、甲苯、二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、EDTA、Tris（以上試劑均為分析純）：國藥化學試劑有限（上海）公司。

1.2 儀器與設備

AUY220 型精密電子天平：日本島津有限公司；3K15 高速冷凍離心機：美國 SGIMA 公司；SY11-Ni 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京市長風儀器儀表有限公司；UV-1700 紫外可見分光光度計：瑞士TECAN 公司；FE20K數(shù)顯pH 計：上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司；DG-800 型旋渦振蕩器：北京鼎國昌盛生物技術有限公司；ZSD-1160 型恒溫光照培養(yǎng)箱：哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總酚含量的測定

將0.5 mL 樣品溶液8 000 r/min 條件下離心10 min后，加入到5 mL 蒸餾水中，然后加入3 mL 福林酚試劑?；旌喜㈧o置3 min，加入6 mL 12%碳酸鈉溶液，用蒸餾水稀釋至25 mL。將數(shù)字恒溫水浴設定為25 ℃、2 h，并在760 nm 的波長下測量吸光度[7]。根據(jù)標準曲線Y=0.122 7 x+0.008 5 的線性回歸方程，總酚含量表示為沒食子酸當量，R2=0.999 3 對總酚含量進行測定。式中：Y 為顯色溶液的吸光度；x 為沒食子酸標準溶液的濃度（濃度為 100 μg/mL）。

1.3.2 抗氧化指標的測定

1.3.2.1 DPPH 自由基清除能力

2 mL 樣品液在8 000 r/min 條件下離心10 min 后與 2 mL 的 DPPH 溶液（將 0.1 mol/L 溶于95 %乙醇中），用渦旋混合器充分混合，反應在室溫下在避光放置30 min，并且在反應完成后，在517 nm 的波長下測量吸光度[8-9]。DPPH 清除率計算公式如下：

式中：A0為樣品液+乙醇的吸光值；A1為DPPH+樣品液的吸光值；A2為DPPH+乙醇的吸光值。

1.3.2.2 ABTS+自由基清除能力

用7 mmol/ L ABTS+（用5 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液，pH7.4 配制），加入過硫酸鉀使得最終濃度為2.45 mmol/L，在室溫條件下避光放置12 h～16 h。在使用前用磷酸鹽緩沖液稀釋ABTS+自由基以在734 nm的波長下具有 0.7±0.02 的吸光度值。將 100 μL 樣品溶液加入到10 mL 上述稀釋溶液中，并在25 ℃下反應10 min。以蒸餾水為參照溶液。在734 nm 波長處測定吸光度[10]。ABTS+自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為空白對照液的吸光度；A1為酵素樣品液的吸光度；A2是樣品底液的吸光度。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除能力

500 μL 樣品加入 500 μL 磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH7.4），然后加入 1 mL120 μmol/L PMS（用 0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液，pH7.4 配制），1 mL 936 μmol/L NADH（用 0.1 mol/L 的 PBS，pH7.4 配制） 和 1 mL 300 μmol/L NBT（用 0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液，pH7.4 配制）。在室溫條件下，反應5 min，以蒸餾水為參照溶液。在560 nm波長處測定吸光度[11-12]。超氧陰離子自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為空白對照液的吸光度；A1為酵素樣品液的吸光度；A2是樣品底液的吸光度。

1.3.2.4 羥基自由基清除能力

將 140 μL 樣品加入到 1.4 mL、6 mmol/L 過氧化氫，然后加入0.6 mL 20 mmol/L 水楊酸鈉和2 mL1.5 mmol/L硫酸亞鐵，37 ℃恒溫水浴1 h。以蒸餾水為參照溶液，在562 nm 波長處測定吸光度[13]。羥基自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為空白對照液的吸光度；A1為酵素樣品液的吸光度；A2是樣品底液的吸光度。

1.3.2.5 金屬離子還原能力的測定

1 mL 樣品液與2.5 mL 磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6），將2.5 mL 鐵氰化鉀均勻混合。然后在3 000 r/min，離心10 min，并將2.5 mL 上清液與蒸餾水和0.5 mL 氯化鐵混合。在靜置10 min 后在700 nm 下測量吸光度[14]。其中，吸光度值越大，金屬離子還原能力越強。

1.3.3 理化指標的測定

能量的測定、碳水化合物的測定：參照GB/Z 21922-2008《食品安全國家標準食品營養(yǎng)成分基本術語》進行測定[15]；蛋白質的測定：參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》進行測定[16]；脂肪的測定：參照GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》進行測定[17]；維生素A 的測定：參照楊志孝等[18]的紫外分光光度法測定；維生素C 的測定：參照2，6-二氯靛酚鈉法進行測定[19]；維生素E的測定：參照龔經(jīng)緯等[20]的紫外分光光度法。

1.3.4 功效酶活力的測定

蛋白酶活力的測定：參照GB/T 23527-2009《食品安全國家標準/國內(nèi)標準蛋白酶制劑》進行測定[21]；脂肪酶活力的測定：參照GB/T 23535-2009《食品安全國家標準/國內(nèi)標準脂肪酶制劑》進行測定[22]；α-淀粉酶活力的測定：參照GB/T 24401-2009《食品安全國家標準/國內(nèi)標準α-淀粉酶制劑》進行測定[23]；超氧化物歧化酶活力的測定：參照鄰苯三酚自氧化法進行測定[24]。

1.3.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均為3 次重復試驗的平均值，結果表示為平均值±標準偏差。應用SPSS24.0 軟件進行顯著性和相關性分析，采用prism 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 銀耳藍莓酵素發(fā)酵過程中總酚含量變化的分析測定

本研究采用福林酚法測定總酚含量，該反應是在恒溫下伴隨有磷鎢酸和磷鉬酸參與的復雜還原反應。吸光度越高，總酚含量越大[14]。發(fā)酵過程中銀耳藍莓酵素總酚含量變化如圖1所示。

圖1 發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.1 Changes in total phenolic compounds during fermentation

由圖1 可知，隨著發(fā)酵時間的延長，銀耳藍莓酵素發(fā)酵液中總酚含量總體呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，但是在發(fā)酵初期（發(fā)酵0～1 d）時總酚含量變化不明顯。發(fā)酵結束時總酚含量由發(fā)酵前的2.86 mg/g 上升到4.76 mg/g。發(fā)酵前后總酚含量上升了39.99%。在TBE 發(fā)酵過程中，由于微生物把復雜的大分子酚類物質轉化成小分子酚類物質從而導致總酚含量的增加[25]。

2.2 銀耳藍莓酵素發(fā)酵過程中抗氧化性能變化的分析測定

2.2.1 DPPH 自由基清除能力

DPPH 自由基清除能力廣泛應用于評價短時間內(nèi)的抗氧化活性[26]。銀耳藍莓酵素在發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化如圖2所示。

圖2 發(fā)酵過程中DPPH 自由基清除能力的變化Fig.2 Changes in DPPH scavenging ability during fermentation

由圖2 可知，銀耳藍莓酵素對DPPH 自由基清除清除作用在1 d～7 d 內(nèi)由64.41%上升至77.74%，其中發(fā)酵前3 d 增長幅度最為明顯，漲幅為8.06%。從發(fā)酵第8 d 開始直至發(fā)酵第17 d，DPPH 自由基清除率緩慢上升，發(fā)酵15 d 后趨于穩(wěn)定，在發(fā)酵結束時最高，清除率達到81.62%。發(fā)酵前后DPPH 自由基清除率上升了17.21%。由于多酚類物質能很容易地給出一個氫離子，并通過共振雜化而達到穩(wěn)定，最終導致自由基清除能力升高[27]。

2.2.2 ABTS+自由基清除能力

銀耳藍莓酵素發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除能力的變化如圖3所示。

圖3 發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除能力的變化Fig.3 Changes in ABTS+radical scavenging ability during fermentation

由圖3 可知，銀耳藍莓酵素ABTS+自由基清除能力在發(fā)酵前9 d 一直屬于增長狀態(tài)，這段時間里ABTS+自由基清除率提高了15.63 %。在第9 天至第17天總體呈現(xiàn)升高的現(xiàn)象。在發(fā)酵結束后，ABTS+自由基清除率達到79.53%，與未發(fā)酵前相比增加了15.40%。ABTS+自由基是一種過氧化氫酶的底物[28]，而有機酸、維生素和酚類物質具有清除ABTS+自由基的能力，它們的作用取決于分子質量、芳香環(huán)的數(shù)量和羥基取代基等性質[29]。

2.2.3 超氧陰離子自由基清除能力

機體內(nèi)生成的活性氧自由基，能引發(fā)體內(nèi)脂質過氧化，導致皮膚到內(nèi)部器官整個肌體的衰老過程大大加快，并可誘發(fā)皮膚病變、心血管疾病、癌癥等，嚴重危害人體健康，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）將體內(nèi)的活性氧自由基轉化為過氧化氫和氧氣并消除它們。超氧陰離子自由基在活性氧物質的形成中起重要作用，例如過氧化氫，羥基自由基和單線態(tài)氧。這些物質能夠誘導脂質，蛋白質和核酸的氧化損傷[30]。銀耳藍莓酵素發(fā)酵過程中超氧自由基清除能力的變化如圖4所示。

圖4 發(fā)酵過程中超氧陰離子自由基清除能力的變化Fig.4 Changes in superoxide radical scavenging ability during fermentation

由圖4 可知，銀耳藍莓酵素超氧陰離子自由基的清除率呈現(xiàn)先增加后略微降低再增加的趨勢，其中發(fā)酵前9 d 增長幅度較大，發(fā)酵后比發(fā)酵前增加了18.07%。在發(fā)酵第11 天時達到最大，清除率為74.95%；發(fā)酵第17 天稍有下降，清除率為74.92%，在這個發(fā)酵階段超氧陰離子自由基清除能力總體是趨于穩(wěn)定的。具有自由羥基的酚類物質和A 環(huán)或B 環(huán)上有多羥基取代或有自由的3-羥基取代的黃酮化合物都可以呈現(xiàn)出超氧自由基清除能力[31]。

2.2.4 羥基自由基清除能力

羥基自由基作為生物系統(tǒng)產(chǎn)生的反應性和高反應性自由基，可對自由基病理學造成高度損害。它的破壞能力幾乎存在于每個活細胞中[32]。銀耳藍莓酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力的變化如圖5所示。

圖5 發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力的變化Fig.5 Changes in hydroxyl radical scavenging ability during fermentation

由圖5 可知，銀耳藍莓酵素羥基自由基的清除率在發(fā)酵過程中總體呈現(xiàn)增長的趨勢。相對其他自由基的清除能力，在發(fā)酵過程中銀耳藍莓酵素羥基自由基的清除能力的增幅相對較小，發(fā)酵前羥基自由基清除率為45.34%，發(fā)酵后羥基自由基清除率達到59.81%，發(fā)酵結束時增加了10.47%。發(fā)酵第3 天到第5 天，增長最為劇烈，清除率增加7.01%。在發(fā)酵第5 天到第9天經(jīng)歷了先上升又下降的趨勢，隨后不斷上漲，在發(fā)酵15 d 后較為穩(wěn)定。

2.2.5 金屬離子還原能力

銀耳藍莓酵素在發(fā)酵過程中金屬離子還原能力變化如圖6所示。

圖6 發(fā)酵過程中金屬離子還原能力的變化Fig.6 Changes in reducing power ability during fermentation

由圖6 可知，銀耳藍莓酵素中金屬離子還原能力在發(fā)酵前7 d 大幅度提高，與發(fā)酵開始相比上升了8.47%，發(fā)酵結束比發(fā)酵開始金屬離子還原能力上升了7.30%。在發(fā)酵第9 天達到最高值，隨后出現(xiàn)了小幅度的降低。

2.3 銀耳藍莓酵素中總酚和抗氧化性能的相關性分析

對銀耳藍莓酵素發(fā)酵過程中的總酚含量與DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和金屬離子還原能力進行了皮爾遜相關性分析，結果如表1所示。

表1 銀耳藍莓酵素中總酚含量和抗氧化性能的相關性分析Table 1 Correlation analysis of total phenol content and antioxidant performance in TBE

由表1 可知，在銀耳藍莓酵素發(fā)酵過程中，總酚含量與DPPH 自由基、ABTS+自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除能力呈極顯著正相關（P＜0.01）。但是總酚含量與金屬離子還原能力相關性較弱，二者無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05）。這些研究結果表明，銀耳藍莓酵素在發(fā)酵過程中抗氧化性能的增加與多酚類物質的轉化及代謝有一定關系；同時酚類化合物也是銀耳藍莓酵素中抗氧化性能的主要來源。

2.4 銀耳藍莓酵素理化品質的分析測定

對發(fā)酵前后的銀耳藍莓酵素進行相關理化指標的分析結果如表2所示。

由表2 可知，銀耳藍莓酵素發(fā)酵前的pH 值為4.18、總酸含量為3.02 g/L、糖度為18.6 及還原糖含量為29.351 mg/mL。發(fā)酵后的pH 值為2.91、總酸含量為7.48 g/L、糖度為7.9 及還原糖含量10.940 mg/mL。銀耳藍莓酵素發(fā)酵前后維生素含量也發(fā)生了一定的改變。發(fā)酵前維生素A 含量為72.40 IU/g，維生素C、維生素E含量分別為21.90、18.91 μg/mL；發(fā)酵后維生素A 含量為150.20 IU/g，維生素C、維生素E 含量分別為26.75、30.43 μg/mL。由此可知，發(fā)酵對銀耳藍莓酵素中維生素含量有一定的影響，銀耳藍莓酵素發(fā)酵液維生素含量隨著發(fā)酵時間的推移不斷增加，其中維生素A 含量增加幅度最大，增幅為107.46%。

表2 銀耳藍莓酵素理化指標的分析測定Table 2 Analysis of physical and chemical indexes of TBE

2.5 銀耳藍莓酵素功效酶的酶活力的分析測定

對發(fā)酵前后的銀耳藍莓酵素進行功效酶活力的測定分析結果如表3所示。

表3 銀耳藍莓酵素功效酶活力的分析測定Table 3 Analysis of enzyme activity of tremella blueberry enzyme

由表3 可知，銀耳藍莓酵素在發(fā)酵前的脂肪酶和SOD 的酶活力均低于發(fā)酵后的含量；發(fā)酵前的蛋白酶和α-淀粉酶的酶活力均高于發(fā)酵后的含量。發(fā)酵前蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶和SOD 的酶活力分別為73.32、5.421、0.897 U/mL 和 103.48 U/mL。發(fā)酵后的蛋白酶、脂肪酶和SOD 的酶活力為 51.10、5.640 U/mL 和138.75 U/mL。銀耳藍莓酵素中SOD 的酶活力相對較高，具有較好的抗衰老及強身健體的效果。測定銀耳藍莓酵素主要功效酶的酶活力，對于科學合理評價銀耳藍莓酵素的質量指標、開發(fā)利用銀耳藍莓酵素產(chǎn)品有重要的指導意義。

3 結論

利用長白山有機銀耳和有機藍莓發(fā)酵制備得到的銀耳藍莓酵素產(chǎn)品具有較強的功效酶酶活力，豐富的營養(yǎng)成分及良好的抗氧化性能。由于藍莓中含有大量花青素（anthocyanidin，ANC）等酚類化合物，抗氧化性能良好，因此監(jiān)測了銀耳藍莓酵素在發(fā)酵過程中抗氧化性能的變化?？寡趸阅苎芯匡@示，DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、超氧自由基清除能力、羥基自由基清除能力和金屬離子還原能力隨銀耳藍莓酵素發(fā)酵時間的延長均顯示出不同程度的增加。同時，自由基清除能力與發(fā)酵過程中總酚含量呈顯著正相關（P＜0.05）。銀耳藍莓酵素發(fā)酵前后主要功效酶的酶活力發(fā)生了一定的變化，其中α-淀粉酶在發(fā)酵后并未檢出。發(fā)酵后銀耳藍莓酵素的pH 值、糖度、還原糖較發(fā)酵前均出現(xiàn)了一定程度的下降。然而，與發(fā)酵前相比，總酸和維生素含量增加。綜上所述，銀耳藍莓酵素具有營養(yǎng)補給、抗氧化、改善腸道代謝等功效，發(fā)酵能夠提高其抗氧化性能。本研究結果為長白山有機銀耳、有機藍莓的多功能開發(fā)利用、新型食用酵素產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)工藝的改進提供了一定的參考。