牛蒡皮固體培養(yǎng)靈芝多糖對(duì)慢性炎性痛小鼠的影響

董玉瑋，蔣如夢(mèng)，苗敬芝，*，李文，高甜慧，胡傳銀

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004；3.徐州天馬敬安食品有限公司，江蘇 徐州 221636）

牛蒡（Arctium lappa L.）是肉質(zhì)根類蔬菜，牛蒡根含有菊糖、多糖、皂苷、黃酮苷、膳食纖維、多酚類（如咖啡酸、綠原酸、異綠原酸等）等成分[1]，已在新型、功能型深加工產(chǎn)品、制藥、保健品等方面形成了較多研究成果[2]。在大力研究牛蒡根利用的同時(shí)，每年大量的牛蒡皮仍被作為廢棄物處理，利用率很低，造成極大的浪費(fèi)。導(dǎo)致這個(gè)現(xiàn)象的主要原因是牛蒡皮中含有較多木質(zhì)素和纖維素，難以再利用。如能變廢為寶，除可增加農(nóng)民收入，也可減少廢棄物的環(huán)境污染。

微生物尤其是一些藥食真菌，比如營養(yǎng)、保健價(jià)值較高的靈芝、茯苓、金針菇等，具有分解、利用木質(zhì)素和纖維素的能力[3]，同時(shí)牛蒡皮中含有的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分也可作為藥食真菌生長(zhǎng)的原料。如果以牛蒡皮作為營養(yǎng)基質(zhì)固體培養(yǎng)藥食真菌，可提高牛蒡、藥食真菌的利用價(jià)值。藥食真菌中的靈芝[Ganoderma lucidum（Leyss.ex.Fr.）Karst]是擔(dān)子菌綱靈芝屬的大型真菌，是目前研究最為深入的藥用真菌之一。靈芝多糖是靈芝中的重要活性成分，具有抗疲勞、延緩衰老、改善睡眠等功效[4]，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)脈硬化[5]、神經(jīng)衰弱[6]、腫瘤[7]等疾病的輔助治療。

慢性炎性痛作為一種病理性疼痛，是由于組織損傷、炎癥或者神經(jīng)系統(tǒng)損傷所導(dǎo)致的疼痛，持續(xù)時(shí)間在1 個(gè)月以上，通常伴有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)病理改變。因此通過治療神經(jīng)系統(tǒng)的病變可在一定程度上有效緩解慢性炎性痛的疼痛[8]。完全弗氏佐劑（complete freund adjuvant，CFA）是一種強(qiáng)大而有效的致炎劑，注射后可引起局部明顯且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的炎癥痛。在進(jìn)行疼痛機(jī)理和相關(guān)治療手段的研究中，常被用于制作疼痛模型[9]。已有報(bào)道表明，多糖具有鎮(zhèn)靜、抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)和修復(fù)神經(jīng)元的作用[10]，提示可能對(duì)慢性炎性痛也具有一定治療作用。

本課題以牛蒡皮為基質(zhì)，固體培養(yǎng)靈芝并優(yōu)化工藝條件，經(jīng)提取、純化后獲得牛蒡-靈芝菌質(zhì)多糖。通過構(gòu)建慢性炎性痛小鼠模型，腹腔注射牛蒡-靈芝菌質(zhì)多糖，探討菌質(zhì)多糖對(duì)慢性炎性痛小鼠的影響，為進(jìn)一步研究牛蒡-靈芝菌質(zhì)藥性成分，更好地全面利用牛蒡-靈芝菌質(zhì)提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種靈芝購自徐州市銅山縣食用菌科技開發(fā)服務(wù)中心，經(jīng)江蘇省高校食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室鑒定為多孔菌科靈芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst。經(jīng)誘變選育后，具有高產(chǎn)多糖的性能，保存于江蘇省高校食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室；牛蒡：徐州天馬敬安食品有限公司。

試驗(yàn)動(dòng)物昆明白小鼠，購自山東魯康動(dòng)物飼料經(jīng)銷中心。

完全弗氏佐劑：sigma 公司；葡萄糖、乙醇、硫酸、苯酚、瓊脂：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基：按照GB 4789.15-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》配制，用于菌種的活化及保存。培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、維生素B110 mg，水 1 000 mL。

固體培養(yǎng)基：新鮮的牛蒡洗凈取皮，按比例加水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

HGB11.690-S-II 電熱恒溫培養(yǎng)箱：廣東躍進(jìn)醫(yī)療器材廠；XBHY-205 數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：上海香梅器材有限公司；FA22140 電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HJ-3 數(shù)顯恒溫磁力攪拌儀：國華電器有限公司；DL-5 低速大容量離心機(jī)：上海安亭儀器廠；390G1 熱輻射刺激儀：上海玉研科技儀器有限公司。

1.3 方法

動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)在徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，其余試驗(yàn)在徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3.1 靈芝菌種的活化

菌種活化：取靈芝菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上活化1 次～2 次。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

采用牛蒡皮固體培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝，考查液固比、裝瓶量、切片大小對(duì)固體培養(yǎng)靈芝多糖含量的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.3.2.1 液固比

牛蒡皮的切片大小（按長(zhǎng)cm×寬cm 換算為面積）控制在 0.5 cm2。以 0.15 g/mL 裝瓶量（牛蒡皮 g/培養(yǎng)瓶 mL）將牛蒡裝入100 mL 培養(yǎng)瓶中，按照液固比（蒸餾水mL/牛蒡皮 g）為 0 ∶1、0.33 ∶1、0.67 ∶1、1 ∶1、1.33 ∶1（mL/g）配制固體培養(yǎng)基，無菌接種，封口膜封口，黑暗條件下28 ℃固體培養(yǎng)14 d～21 d 至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，將菌質(zhì)于50 ℃烘干后粉碎，過60 目篩。

1.3.2.2 裝瓶量

牛蒡皮的切片大小控制在0.5 cm2，長(zhǎng)、寬誤差均為±0.2 cm。按照 0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g/mL 的裝瓶量（牛蒡皮g/培養(yǎng)瓶mL），在100 mL 培養(yǎng)瓶中裝入牛蒡，以液固比0.33 ∶1（mL/g）配制固體培養(yǎng)基，無菌接種，封口膜封口，黑暗條件下28 ℃固體培養(yǎng)14 d～21 d 至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，將菌質(zhì)于50 ℃烘干后粉碎，過60 目篩。

1.3.2.3 切片大小

牛蒡皮切片分別控制在 0.25、0.5、0.75、1、1.25 cm2。均以0.2 g/mL 裝瓶量將牛蒡皮裝入100 mL 培養(yǎng)瓶中，以液固比 0.33 ∶1（mL/g）配制固體培養(yǎng)基，無菌接種，封口膜封口，黑暗條件下28 ℃固體培養(yǎng)14 d～21 d至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，將菌質(zhì)于50 ℃烘干后粉碎，過60目篩。

1.3.3 牛蒡皮固體培養(yǎng)靈芝工藝優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert 8.06 試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)牛蒡固體培養(yǎng)靈芝工藝進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)方法，試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the experiment

1.3.4 多糖的提取與檢測(cè)

提取多糖使用水提醇沉法：將靈芝菌絲粉碎，稱5 g 于燒杯中，加入 50 mL 水混勻，60 ℃水浴 1.5 h，4 000 r/min 離心5 min，過濾，取沉淀重復(fù)提取3 次，合并提取液，置于60 ℃烘箱中濃縮至原體積1/5，濃縮液加入5 倍體積95%乙醇，溶解過夜。4 000 r/min 離心10 min，過濾取沉淀為粗多糖，60 ℃烘箱烘干，加入10 mL～50 mL 水充分溶解。測(cè)定多糖含量采用苯酚-硫酸法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算粗多糖含量（mg/g 菌絲）。

1.3.5 粗多糖的純化

1.3.5.1 脫蛋白、透析

采用Sevag 法對(duì)粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理。按氯仿∶正丁醇體積比4 ∶1 配制Sevag 試劑，粗多糖溶液置于分液漏斗中，加入1/5 溶液體積的Sevag 試劑，振蕩20 min，4 000 r/min 離心 10 min 得上清液，繼續(xù)重復(fù)上次操作，直至氯仿層與正丁醇層之間沒有乳白色變性蛋白質(zhì)析出為止，合并上清液，倒入截留分子量為6 000 Da～8 000 Da 的半透膜袋中，蒸餾水透析48 h，期間每2 h 更換1 次水。

1.3.5.2 脫色

取透析后的粗多糖溶液配制成5 mg/mL 的溶液50 mL，加入 30%H2O21 mL，50 ℃保溫脫色 3 h，直至色值不再降低，濃縮后凍干得菌質(zhì)多糖。

1.3.6 多糖對(duì)慢性炎性痛小鼠的影響

1.3.6.1 小鼠喂養(yǎng)與體質(zhì)量測(cè)定

小鼠由徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房專人飼養(yǎng)并提供標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，飼料配方為：20%蛋白質(zhì)、60%碳水化合物、9%脂肪、11%纖維素，小鼠自由攝食與飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，自然晝夜交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，選取體質(zhì)量（22±2）g 雄性昆明小鼠 135 只進(jìn)行試驗(yàn)，隨機(jī)分成 9 組，每組 15 只。在注射 CFA 前 2 d 測(cè)定小鼠體質(zhì)量作為初始值，注射后第1、3、5 天分別測(cè)定1 次。

1.3.6.2 CFA 小鼠模型制作[11]

用微量進(jìn)樣器吸取50 μL CFA，圍繞小鼠左后足足跖關(guān)節(jié)部，皮下注射CFA，注射完成后旋轉(zhuǎn)針頭，皮下停留3 s～5 s 后拔出，造模完成。

1.3.6.3 小鼠腹腔注射生理鹽水和菌質(zhì)多糖[12]

9 組小鼠中1 組足底注射50 μL 生理鹽水作為對(duì)照，另外 8 組分別腹腔注射濃度為 5、10、30、50、70、90、110、130 mg/mL 的菌質(zhì)多糖溶液，注射量為小鼠體重的1%。共注射3 次，分別為小鼠造模后當(dāng)天（第1天）注射第1 次，以后每2 d 注射1 次。

1.3.6.4 熱縮足潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）的測(cè)定

根據(jù)Hargreaves 等報(bào)道的方法[13]，將透明有機(jī)玻璃箱中用玻璃板分隔成若干獨(dú)立空間，底層玻璃板厚3 cm，將每只小鼠放入玻璃板獨(dú)立空間，穩(wěn)定2 h 后，用熱輻射刺激儀照射小鼠左后足足心，照射開始至小鼠首次抬腿躲避時(shí)間即為熱縮足潛伏期。熱刺激強(qiáng)度調(diào)節(jié)至基礎(chǔ)值為10 s～12 s，自動(dòng)切斷時(shí)間為20 s，以免造成熱輻射損傷。共測(cè)定4 d，分別為造模前2 d、造模后第2 天、第4 天和第6 天，測(cè)定當(dāng)天每只小鼠測(cè)定3 次，每次間隔5 min，取3 次平均值作為小鼠TWL值。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液固比

不同液固比條件下，牛蒡皮培養(yǎng)靈芝菌質(zhì)后多糖含量見圖1。

圖1 液固比對(duì)牛蒡皮培養(yǎng)靈芝工藝的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the process of Ganoderma lucidum cultured by Arctium lappa L.peel

由圖1 可知，菌質(zhì)多糖含量在液固比 0 ∶1（mL/g）～1.33 ∶1（mL/g）范圍內(nèi)先增加后減少，在液固比為 0.67 ∶1（mL/g）時(shí)多糖含量達(dá)到最高，為20.82 mg/g。

2.1.2 裝瓶量

不同裝瓶量條件下，牛蒡皮培養(yǎng)靈芝菌質(zhì)后多糖含量見圖2。

由圖2 可知，菌質(zhì)多糖含量在裝瓶量0.1 g/mL～0.3 g/mL 范圍內(nèi)先增加后減少，在裝瓶量為0.20 g/mL時(shí)多糖含量達(dá)到最高，為21.26 mg/g。

2.1.3 切片大小

不同切片大小條件下，牛蒡皮培養(yǎng)靈芝菌質(zhì)后多糖含量見圖3。

圖2 裝瓶量對(duì)牛蒡皮培養(yǎng)靈芝工藝的影響Fig.2 Effect of bottling amount on the process of Ganoderma lucidum cultured by Arctium lappa L.peel

圖3 切片大小對(duì)牛蒡皮培養(yǎng)靈芝工藝的影響Fig.3 Effects of slice size on the process of Ganoderma lucidum cultured by Arctium lappa L.peel

由圖3 可知，菌質(zhì)多糖含量在切片大小0.75 cm2時(shí)，多糖含量達(dá)到最高，為20.43 mg/g。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)制定詳細(xì)的分析方案，多糖含量預(yù)測(cè)值與實(shí)際值見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果Table 2 Analysis and results of response surface

續(xù)表2 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果Continue table 2 Analysis and results of response surface

2.3 回歸模型的建立和檢驗(yàn)

對(duì)液固比（A）、裝瓶量（B）和切片大?。–）3 個(gè)單因素進(jìn)行回歸擬合，得出多糖含量（Y）回歸方程：

Y=21.62-0.33A-0.38B-0.34C+0.090AB-0.63AC-0.11BC-1.88A2-1.5B2-0.96C2

分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3、表4所示。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

表4 預(yù)測(cè)模型的可靠性分析Table 4 Reliability analysis of prediction model

由表3 可知，此模型的擬合程度較好，決定系數(shù)R2為 0.988 6，P 值＜0.01，說明該方程與實(shí)際情況相符，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著。液固比、裝瓶量、切片大小的P 值都小于0.01，對(duì)多糖含量影響都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。液固比和裝瓶量、裝瓶量和切片大小兩兩交互作用對(duì)多糖含量的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，液固比和切片大小兩兩交互作用對(duì)多糖含量的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 兩因素間的交互效應(yīng)分析

液固比（A）、裝瓶量（B）、切片大?。–）3 個(gè)因素兩兩交互作用對(duì)靈芝多糖含量的影響等高線圖和響應(yīng)面圖，見圖4。

圖4 響應(yīng)面分析圖和等高線圖Fig.4 Response surface analysis and contour map

由圖4 可知，交互影響作用大小排序?yàn)椋阂汗瘫扰c切片大?。狙b瓶量與切片大?。疽汗瘫扰c裝瓶量。3 個(gè)因素對(duì)多糖含量的影響大小依次為：裝瓶量＞切片大?。疽汗瘫?。

2.5 最佳條件優(yōu)化及驗(yàn)證結(jié)果

回歸模型確定的最佳培養(yǎng)工藝為液固比0.49∶1（mL/g），裝瓶量0.19 g/mL，切片大小為0.71 cm2，預(yù)測(cè)得到的多糖含量最高為21.68 mg/g。對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，考慮實(shí)際操作，選擇液固比 0.5 ∶1（mL/g），裝瓶量 0.2 g/mL，切片大小為0.7 cm2條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，提取的多糖平均含量值為21.87 mg/g，相對(duì)誤差0.898%，和預(yù)期結(jié)果基本相符，回歸模型的預(yù)測(cè)性能較好，可用于優(yōu)化牛蒡固體培養(yǎng)靈芝工藝。

2.6 CFA模型建立結(jié)果

注射CFA 前后小鼠左后足形態(tài)對(duì)比見圖5。

圖5 注射弗氏佐劑前后小鼠左后足對(duì)比Fig.5 Contrast of left hind foot in mice before and after injection of Freund's adjuvant

從圖5 可以看出，在注射弗氏佐劑前，小鼠左后足無腫脹現(xiàn)象，注射CFA 后，小鼠左后足出現(xiàn)明顯腫脹，說明CFA 模型建立成功。

2.7 菌質(zhì)多糖對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

分別在造模前2 d、造模后第1、3、5 天測(cè)定小鼠體質(zhì)量，結(jié)果見表5。

對(duì)同一天同一組數(shù)據(jù)做方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果表明：在造模前后，生理鹽水組和多糖組小鼠體質(zhì)量組內(nèi)F 值均大于0.05，因此不顯著，說明每組數(shù)據(jù)系統(tǒng)誤差較小，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

表5 小鼠體質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination of body mass in mice

從表5 可以看出，經(jīng)Duncan 檢驗(yàn)，①同一天內(nèi)，在造模前和造模第1 天，生理鹽水組和多糖組之間，小鼠體質(zhì)量差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②造模第3 天，注射130 mg/mL 多糖組與其它組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；③造模第 5 天，注射 90、110、130 mg/mL 多糖組與其它組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明90 mg/mL～130 mg/mL 多糖濃度有促進(jìn)小鼠體質(zhì)量增加的作用。

2.8 菌質(zhì)多糖對(duì)小鼠慢性炎性痛的影響

分別在造模前2 d、造模后第1、3、5 天測(cè)定小鼠TWL，結(jié)果見表 6。

表6 小鼠熱縮足潛伏期的測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination of thermal withdrawal latency in mice

對(duì)同一天同一組數(shù)據(jù)做方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果表明：在造模前后，生理鹽水組和多糖組小鼠TWL 組內(nèi)F 值均大于0.05，因此不顯著，說明每組數(shù)據(jù)系統(tǒng)誤差較小，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

從表6 可以看出，經(jīng)Duncan 檢驗(yàn)，①生理鹽水組小鼠第2、4 天TWL 與造模前和第6 天TWL 之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第 6 天 TWL 與前 3 次 TWL之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明CFA 對(duì)生理鹽水組小鼠足部損傷的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在造模后第6 天 TWL 尚未恢復(fù)到造模前的正常水平；②5、10、30、50、70 mg/mL 多糖組各組每次TWL 之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明小鼠在造模第2 天TWL 就已恢復(fù)到正常水平，因此4 組濃度多糖有助于減輕小鼠足部炎性痛反應(yīng)；③90、110、130 mg/mL 多糖組在造模后第 2 天TWL 與造模前相比有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明第2 天小鼠足部炎性痛尚未恢復(fù)；90、110 mg/mL 多糖組在造模后第4、6 天TWL 與造模前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明小鼠足部炎性痛已恢復(fù)正常；130 mg/mL 多糖組在造模后第4、6 天TWL 與造模前相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明小鼠足部炎性痛尚未恢復(fù)到造模前的正常水平。綜上所述，低、中劑量多糖濃度（5、10、30、50、70 mg/mL）對(duì)減輕小鼠足部炎性痛反應(yīng)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其影響效果優(yōu)于注射90、110 mg/mL 多糖，當(dāng)注射130 mg/mL 高濃度多糖時(shí)，對(duì)減輕小鼠足部炎性痛反應(yīng)影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)牛蒡加工過程中，牛蒡皮都作為廢棄物，無法再利用。由于牛蒡皮木質(zhì)素、纖維素含量較高，并含有多糖、維生素、氨基酸等成分，為靈芝等藥食真菌固體培養(yǎng)提供了適宜的營養(yǎng)基質(zhì)。采用牛蒡皮固體培養(yǎng)靈芝，菌絲生長(zhǎng)速度、菌質(zhì)多糖含量與傳統(tǒng)固體培養(yǎng)無明顯差異，工藝簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，不需額外添加化學(xué)試劑，既節(jié)省了原料和成本，又合理利用了作為廢棄物的牛蒡皮。目前本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)利用牛蒡皮，成功固體培養(yǎng)了茶薪菇、金針菇、杏鮑菇，液體培養(yǎng)了毛木耳、茶新菇、平菇等多個(gè)品種食用菌，顯示出牛蒡皮在固體、液體培養(yǎng)藥食真菌中具有普遍的規(guī)律性和適用性，相關(guān)工藝技術(shù)已在藥食真菌培養(yǎng)、牛蒡綜合利用、植物-藥食真菌復(fù)合型飲料制備方面開展了系列應(yīng)用，符合現(xiàn)代綠色、高效農(nóng)業(yè)的理念，具有很好的推廣前景。

李曉川等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖在一定劑量下能延長(zhǎng)小鼠的熱縮足潛伏期[14]；谷沖春等[15]、田香等[16]認(rèn)為靈芝多糖是通過清除小鼠腦內(nèi)自由基、抑制蛋白表達(dá)、降低神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度來達(dá)到對(duì)小鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用；賈薇等則對(duì)靈芝多糖改善小鼠睡眠效果作了分析[17]。本研究結(jié)果表明，在一定劑量濃度范圍內(nèi)（5 mg/mL～70 mg/mL），經(jīng)腹腔注射菌質(zhì)多糖后，對(duì)小鼠體重影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且對(duì)減輕小鼠足部炎性痛有較好的恢復(fù)作用，可能原因是多糖具有鎮(zhèn)痛、消炎、修復(fù)神經(jīng)、改善睡眠質(zhì)量的作用，有助于修復(fù)已有炎癥。李建軍等在研究靈芝多糖抗腫瘤作用時(shí)，多糖注射濃度為 100 mg/kg 體重～400 mg/kg 體重[18]；秦麗紅等在研究靈芝多糖對(duì)肺癌細(xì)胞的作用時(shí)，多糖注射濃度為2 000 mg/kg[19]；程俊文等進(jìn)行靈芝多糖提取物對(duì)小鼠免疫功能的研究時(shí)注射最高濃度為700 mg/kg，相當(dāng)于人推薦劑量的近30 倍[20]。本研究所注射的菌質(zhì)多糖高濃度分別為90、110、130 mg/mL，按小鼠體重?fù)Q算分別為900、1 100、1 300 mg/kg，約相當(dāng)于人推薦劑量的30 倍～50 倍，高于一般注射劑量，也高于程俊文等的注射劑量。結(jié)果表明，除130 mg/mL 以外，其余高濃度劑量菌質(zhì)多糖對(duì)小鼠足部炎性痛也有減輕作用，說明高濃度劑量菌質(zhì)多糖注射安全，但是效果低于低、中劑量組，因此5 mg/mL～70 mg/mL 菌質(zhì)多糖是減輕小鼠慢性炎性痛的最佳劑量濃度。

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面軟件優(yōu)化，確定牛蒡皮固體培養(yǎng)靈芝最佳工藝為：液固比 0.5 ∶1（mL/g），裝瓶量0.2 g/mL，切片大小0.7 cm2，此時(shí)多糖含量為21.87 mg/g。腹腔注射 5、10、30、50、70 mg/mL 多糖對(duì)小鼠體重影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；注射130 mg/mL 多糖第3天，注射 90、110、130 mg/mL 多糖第 5 天，小鼠體質(zhì)量與其它組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明注射90 mg/mL～130 mg/mL 多糖濃度有促進(jìn)小鼠體質(zhì)量增加的作用。腹腔注射 5、10、30、50、70 mg/mL 多糖對(duì)減輕小鼠足部炎性痛反應(yīng)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其影響效果優(yōu)于注射 90、110 mg/mL 多糖，注射130 mg/mL 高濃度多糖時(shí)，對(duì)減輕小鼠足部炎性痛反應(yīng)的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。