微生物基因功能的研究策略與方法

陳寶花， 鄒婷婷， 龍中兒， 黃運(yùn)紅

(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022)

微生物體形微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但在食品發(fā)酵、醫(yī)藥衛(wèi)生、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域都發(fā)揮著極其重要的作用。為了揭示微生物的生命活動(dòng)規(guī)律及其作用機(jī)制，提高微生物的利用率，1994年美國(guó)DOE啟動(dòng)了微生物基因組計(jì)劃(Microbial Genome Program，MGP)，越來(lái)越多的科學(xué)家開(kāi)始了對(duì)微生物基因組的研究，至今可從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋到超過(guò)4萬(wàn)種微生物的基因組序列，促使微生物基因組學(xué)研究進(jìn)入了后基因組時(shí)代，即微生物基因功能的研究。當(dāng)前，微生物基因功能研究的常用方法有生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、基因表達(dá)譜分析、基因敲除技術(shù)、基因敲入技術(shù)、基因沉默技術(shù)和基因編輯技術(shù)等。在實(shí)際的研究工作中，研究者可根據(jù)實(shí)際情況，依照微生物目標(biāo)基因(組)功能研究的前提條件，制定出針對(duì)性的研究方案(如圖1所示)，并選用合適的微生物基因功能研究方法，有時(shí)還需要綜合利用兩種或兩種以上方法相互印證。本文就微生物基因功能研究的方法與策略作一綜述。

1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

生物信息學(xué)(Bioinformatics)是一門(mén)通過(guò)計(jì)算來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)生命系統(tǒng)科學(xué)理解的學(xué)科，它將生物的分子描述符與生物過(guò)程聯(lián)系起來(lái)，促進(jìn)知識(shí)的發(fā)現(xiàn)和數(shù)據(jù)的挖掘。生物信息學(xué)是支撐微生物生物技術(shù)和基因組研究的關(guān)鍵平臺(tái)。研究者在獲得微生物基因或其產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息后，可通過(guò)分析比較工具(如BLASTn、BLASTx)對(duì)微生物的基因或蛋白質(zhì)氨基酸序列的各類(lèi)信息進(jìn)行識(shí)別、比較，確定基因或蛋白質(zhì)氨基酸序列之間的同源性，從而獲得基因序列之間的進(jìn)化關(guān)系，在此基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)基因的功能、基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系等。

圖1 微生物基因功能的研究策略

2 基因表達(dá)譜分析

微生物基因在微生物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段、不同條件下的表達(dá)量均不相同。因此，對(duì)不同條件下微生物基因的時(shí)空表達(dá)譜進(jìn)行分析，可以用來(lái)研究微生物基因的功能?；虻谋磉_(dá)譜分析包括mRNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平。

2.1 mRNA水平的基因表達(dá)譜分析

mRNA水平的基因表達(dá)譜分析方法有原位雜交技術(shù)、RT-PCR和Northern Blot等。原位雜交技術(shù)是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將探針與組織、細(xì)胞或染色體內(nèi)待測(cè)的mRNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合形成專(zhuān)一的雜交分子，并通過(guò)一定的檢測(cè)手段將其位置顯示出來(lái)，主要分為基因組原位雜交技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、多彩色熒光原位雜交技術(shù)和原位PCR技術(shù)。原位雜交技術(shù)因其高度的敏感性和準(zhǔn)確性被廣泛應(yīng)用于微生物基因功能的研究。RT-PCR是將RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與cDNA聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合的技術(shù)，主要有半定量RT-PCR、實(shí)時(shí)定量RT-PCR和競(jìng)爭(zhēng)性定量RT-PCR。半定量RT-PCR操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但精度不高，只能測(cè)定mRNA 的相對(duì)含量，多用于微生物基因表達(dá)水平的初步分析；實(shí)時(shí)定量RT-PCR操作簡(jiǎn)便、快速高效,降低了操作過(guò)程中PCR受污染的可能性，但無(wú)法避免擴(kuò)增出基因組DNA和消除樣品處理、儀器差異帶來(lái)的誤差[1]；競(jìng)爭(zhēng)性定量RT-PCR是將與目的基因相同的引物序列的DNA片段作為競(jìng)爭(zhēng)模板與目的基因一起擴(kuò)增，一同競(jìng)爭(zhēng)與引物的結(jié)合，其重復(fù)率高，并可解決幾對(duì)引物在同一PCR管擴(kuò)增不同基因發(fā)生干擾的問(wèn)題。Northern Blot技術(shù)多應(yīng)用于特定基因在mRNA水平上動(dòng)態(tài)表達(dá)的研究，可對(duì)基因進(jìn)行特異的定量檢測(cè)，但測(cè)定效率和靈敏度不高，無(wú)法檢測(cè)出微小的基因表達(dá)量。

2.2 蛋白質(zhì)水平的基因表達(dá)譜分析

蛋白質(zhì)水平的基因表達(dá)譜分析方法有免疫組織化學(xué)、Western Blot等。免疫組織化學(xué)是能夠準(zhǔn)確地定位微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的位置并對(duì)其進(jìn)行定量分析的重要方法。Western Blot不僅可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，還能檢測(cè)到蛋白質(zhì)的聚體形式和分子質(zhì)量大小。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)微生物蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。

3 基因敲除技術(shù)

基因敲除是一種使目標(biāo)基因失活或去除的方法、手段或途徑，為微生物的定向改造提供重要的技術(shù)支撐，不僅可克服傳統(tǒng)誘變方法的盲目性，還能使改造之后的基因穩(wěn)定地復(fù)制和遺傳，是微生物基因功能研究的最有效方法之一。

基因敲除技術(shù)主要應(yīng)用DNA同源重組的原理，利用設(shè)計(jì)的DNA同源片段替代目標(biāo)基因片段，達(dá)到基因敲除的目的。微生物內(nèi)源基因功能片段的敲除，引起內(nèi)源基因結(jié)構(gòu)或組成突變，基因功能喪失，微生物表現(xiàn)出特定的表型效應(yīng)，可以反映出目標(biāo)基因的功能。

3.1 Red同源重組技術(shù)

Red同源重組系統(tǒng)是一種基于K噬菌體Red重組酶的原核中斷系統(tǒng)，由傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)逐步發(fā)展而來(lái)。Red同源重組技術(shù)的敲除策略是將一段攜帶靶基因上下游各有40～60 bp同源序列的PCR片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在Red重組酶的作用下，將導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的線(xiàn)性DNA片段與載體特定的同源靶序列重組，從而替換靶基因。Red重組酶由K噬菌體的3個(gè)基因exo、bet、gam所編碼[2]。Exo蛋白結(jié)合在雙鏈DNA的末端，從5′端到3′端降解DNA，產(chǎn)生3′突出末端。Beta蛋白自發(fā)地與3′突出末端緊密結(jié)合，防止其被降解，同時(shí)還介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA的退火。Gam蛋白與宿主所表達(dá)的核酸外切酶結(jié)合抑制其降解體內(nèi)的外源DNA[3]。當(dāng)Beta蛋白與3′突出末端結(jié)合形成絲狀體之后，重組機(jī)制有鏈退火(single strand annealing)和鏈侵入(strand invasion)兩種模型。Red同源重組技術(shù)是一個(gè)獨(dú)立的重組系統(tǒng)，在同源重組時(shí)利用線(xiàn)性打靶DNA，不需要體外構(gòu)建重組質(zhì)粒，具有實(shí)驗(yàn)周期短，重組效率高的特點(diǎn)，主要應(yīng)用于大腸埃希菌[4]、痢疾桿菌[5]、鼠傷寒沙門(mén)氏菌[6]、綠膿桿菌[7]、銅綠假單胞菌[8]和桿狀病毒[9]。Red同源重組技術(shù)在其他微生物基因功能研究中存在同源臂過(guò)長(zhǎng)或重組效率較低的問(wèn)題，在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，如構(gòu)建新型質(zhì)粒pKD46[10]、與Rac噬菌體系統(tǒng)重組為Red/ET重組系統(tǒng)[11]可能會(huì)使該技術(shù)更廣泛地應(yīng)用于其他微生物中。

3.2 Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組技術(shù)

Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)由Cre重組酶和loxP位點(diǎn)組成。Cre重組酶最初是由Steinberg等[12]在大腸埃希菌噬菌體P1內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，它不僅能夠催化位點(diǎn)特異性重排反應(yīng)，還能識(shí)別特異的loxP位點(diǎn)并介導(dǎo)2個(gè)loxP位點(diǎn)之間的DNA進(jìn)行特異性重組。loxP是由兩側(cè)13 bp的反向重復(fù)序列和中間間隔的非對(duì)稱(chēng)的8 bp序列共同構(gòu)成的回文序列結(jié)構(gòu)。13 bp的反向重復(fù)序列是Cre重組酶特異性結(jié)合位點(diǎn)，而8 bp的間隔序列不僅能夠確定loxP的方向，還是DNA分裂和發(fā)生鏈交換的部位。Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)共有三種工作方式：①兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于同一分子中且方向相同時(shí)，兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA片段重組后被剔除；②兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于同一分子中且方向相反時(shí)，兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA片段重組之后發(fā)生倒位；③兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于不同的分子上時(shí)，可使DNA發(fā)生交換或易位[13]。Cre/loxP系統(tǒng)作用專(zhuān)一，無(wú)需其他輔助因子，能特異性地敲除基因，且不攜帶抗性標(biāo)志物，但僅適用標(biāo)記基因的刪除和外源基因的定點(diǎn)整合，使該技術(shù)的發(fā)展受到了很大的局限。目前，Cre/loxP系統(tǒng)已成功應(yīng)用于乳酸鏈球菌的基因組重排[14]、炭疽桿菌[15]和傷寒桿菌[16]的基因組編輯、變異鏈球菌[17]和肺炎鏈球菌[18]的無(wú)標(biāo)記基因缺失、T嗜熱桿菌[19]基因無(wú)標(biāo)記斷裂新系統(tǒng)開(kāi)發(fā)和絲狀真菌的標(biāo)志物回收[20]，以及定向克隆真菌基因組DNA大基因簇，解決額外克隆缺失片段和多次PCR易發(fā)生突變的問(wèn)題[21]。

4 基因敲入技術(shù)

基因敲入技術(shù)(Gene knock-in)也是微生物基因功能研究的一種有效手段，它利用基因同源重組的原理，將外源有功能基因(基因組內(nèi)原先不存在或已經(jīng)失活的基因)轉(zhuǎn)入細(xì)胞基因組中的特定位點(diǎn)后，與基因組中的同源序列進(jìn)行重組，插入到基因組中，并在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)的技術(shù)。通過(guò)長(zhǎng)同源臂和微同源序列兩種途徑介導(dǎo)的同源修復(fù)可實(shí)現(xiàn)精的確靶向敲入，非同源末端連接途徑可介導(dǎo)非精確的靶向敲入。同時(shí)，基因敲入有兩種方式，一種是原位敲入，即在原基因敲除的位點(diǎn)插入新基因，它是基因敲除的逆過(guò)程；另一種是定點(diǎn)敲入，即無(wú)論敲除基因的位點(diǎn)在哪里，敲入的基因是在特定啟動(dòng)子下，以轉(zhuǎn)移載體的形式轉(zhuǎn)座進(jìn)去，插入的位點(diǎn)是固定的。目前，基因敲入技術(shù)已成功應(yīng)用于果蠅炭疽菌核熒光標(biāo)記菌株的構(gòu)建[22]、假單胞菌尿黑素降解基因的克隆[23]、龜裂鏈霉菌合成土霉素初級(jí)代謝路徑的調(diào)控[24]等，但因該技術(shù)靶點(diǎn)的切割效率普遍不高，敲入的分子機(jī)制尚不完全了解，使該技術(shù)的進(jìn)一步推廣受到了限制。

5 基因沉默技術(shù)

基因沉默(Gene silencing)是指由外源基因?qū)胍鸬纳矬w內(nèi)特定基因不表達(dá)或抑制表達(dá)的現(xiàn)象。通過(guò)觀(guān)察、比較基因沉默前后生物表型的變化，可以確定目標(biāo)基因的功能。目前，最常用的基因沉默技術(shù)有RNA干擾和反義寡核苷酸技術(shù)。

5.1 RNA干擾

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平上啟動(dòng)的序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象[25]，該現(xiàn)象最初于1998年由Guo等[26]在研究線(xiàn)蟲(chóng)Caenorhabditiselegans時(shí)發(fā)現(xiàn)。RNAi的作用過(guò)程分為起始階段和效應(yīng)階段等。在起始階段，dsRNA在核酸內(nèi)切酶Dicer酶和RNAase Ⅲ的作用下被切割為長(zhǎng)度21～23 bp的siRNA(small interference RNA)[27]；在效應(yīng)階段，siRNA分子、核酸酶和螺旋酶等結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC以消耗ATP的方式催化雙鏈siRNA解旋，同時(shí)RISC內(nèi)部的單鏈siRNA以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別并切割互補(bǔ)的靶RNA，并用RNA酶將切割的靶DNA降解，從而使目的基因表達(dá)沉默[28]。RNAi普遍存在于真核生物中，可用于研究單個(gè)基因、基因家族和整個(gè)基因組基因的表達(dá)，與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比較，具有操作簡(jiǎn)單、周期短、特異性強(qiáng)、投入少和穿透性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于一些特定的細(xì)胞類(lèi)型(如神經(jīng)元)和低水平表達(dá)的基因，RNAi技術(shù)的作用并不明顯。目前，RNAi技術(shù)主要應(yīng)用于篩選藥物靶向基因、確定基因功能和基因治療等方面，在微生物方面主要應(yīng)用于真菌[29](如擔(dān)子菌)以及作為抑制病毒增值的理想工具[30]，如艾滋病病毒和乙型肝炎病毒等。

5.2 反義寡核苷酸技術(shù)

反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide，ASON)技術(shù)是指長(zhǎng)度為19～23個(gè)堿基修飾的RNA寡核苷酸與靶mRNA雜交形成雙鏈的過(guò)程，該雙鏈分子能夠阻止靶mRNA正常工作翻譯蛋白質(zhì)[31]。反義寡核苷酸引發(fā)基因沉默的機(jī)制可能是與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合后以位阻效應(yīng)抑制靶基因的翻譯，或者是與雙鏈DNA結(jié)合形成三股螺旋而抑制轉(zhuǎn)錄，也不排除通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶進(jìn)入RNA干擾途徑而降解靶mRNA[32]。1978年，反義寡核苷酸技術(shù)成功應(yīng)用于抑制Rous肉瘤病毒的產(chǎn)生[33]。目前，反義寡核苷酸作為一種新的工具已廣泛應(yīng)用于微生物進(jìn)化機(jī)制的研究，作為一種新型藥物用于病毒感染等疾病的治療[34]等。

6 基因編輯技術(shù)

基因編輯是指通過(guò)核酸酶對(duì)靶基因進(jìn)行定點(diǎn)改造，實(shí)現(xiàn)特定DNA的定點(diǎn)敲除、敲入以及突變等，最終下調(diào)或上調(diào)基因的表達(dá)，使細(xì)胞獲得新表型的一種新型技術(shù)[35]。近年來(lái)，基于多種高效靶向核酸酶的發(fā)現(xiàn)，發(fā)展了許多高效的靶向基因編輯技術(shù)，如鋅指核酸酶技術(shù)(Zinc fingernuclease，ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(Transcription activator-like effector nuclease，TALENs)和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR associated proteins，Cas)系統(tǒng)等。

6.1 ZFNs技術(shù)

鋅指核酸酶是能夠在復(fù)雜基因組中切割預(yù)先設(shè)定的靶DNA的人工合成酶，最早由Kim等[36]在1996年合成。ZFNs由特異性的鋅指蛋白DNA結(jié)合域和非特異性的核酸內(nèi)切酶Fok I結(jié)構(gòu)域組成。鋅指蛋白DNA結(jié)合域能夠識(shí)別特定的DNA序列，通常由3到4個(gè)專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的Cys2-His2鋅指結(jié)構(gòu)域(Zinc finger domain，ZFD)串聯(lián)重復(fù)組成，每個(gè)ZFD識(shí)別靶DNA的3個(gè)連續(xù)的核苷酸堿基。由于Fok I核酸酶只有在二聚體狀態(tài)下才有內(nèi)切酶活性，2個(gè)ZFN亞基必須以正確的方向和間距結(jié)合DNA。2個(gè)Fok I二聚體化后，在靶位點(diǎn)切割DNA并激活細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)，通過(guò)精確同源重組和易出錯(cuò)的非同源末端連接修復(fù)斷裂的雙鏈。ZFNs在基因修飾時(shí)有特異性強(qiáng)和高效性等特點(diǎn)，但是由于氨基酸殘基和目標(biāo)序列堿基對(duì)之間復(fù)雜的相互作用，使多鋅指模塊的設(shè)計(jì)具有一定的挑戰(zhàn)性[37]，同時(shí)ZFNs技術(shù)還存在著敲除率低、脫靶率高和細(xì)胞毒性大等問(wèn)題。ZFNs技術(shù)針對(duì)抗生素抗性細(xì)菌(ARB)[38]可敲除細(xì)菌內(nèi)源性的抗性基因，從而緩解細(xì)菌的耐藥性。同時(shí)，ZFNs還可以在潛在感染和感染的細(xì)胞模型中介導(dǎo)整合完整的前病毒基因組切除[39]，這表明ZFNs技術(shù)具有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的活性。

6.2 TALENs技術(shù)

TALENs是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)改造的新技術(shù)，它是由植物病原菌黃單胞菌分泌的一種類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子(Transcription activator-like effectors，TALEs)和Fok I核酸內(nèi)切酶組合而成的融合蛋白[40]，其中TALEs特異性結(jié)合宿主細(xì)胞基因機(jī)制是由Moscou[41]和Boch[42]所揭示。TALENs由高度保守的N端、C端和中間部分的重復(fù)區(qū)構(gòu)成，其中中間部位的重復(fù)區(qū)由13～29重復(fù)氨基酸單元組成，每個(gè)重復(fù)的氨基酸單元由34個(gè)序列幾乎一致的氨基酸串聯(lián)排列構(gòu)成，其中第12、13號(hào)位點(diǎn)的氨基酸(合稱(chēng)為RVD)高度可變，是特異性識(shí)別核苷酸的關(guān)鍵部件。TALENs通過(guò)N端的核定位信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞，并特異性地識(shí)別靶位點(diǎn)之后，F(xiàn)ok I切割靶基因的DNA雙鏈，使雙鏈斷裂，隨后啟動(dòng)兩種修復(fù)機(jī)制。重復(fù)單元與核苷酸堿基一對(duì)一的識(shí)別模式使TALENs技術(shù)具有靶向效率更高[43]的優(yōu)勢(shì)，但該技術(shù)依然存在著載體構(gòu)建較繁瑣、編輯效率不高和難以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行編輯等問(wèn)題。目前，TALENs技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于獲得高產(chǎn)的釀酒酵母[44]、稻瘟病菌的基因編輯[45]以及對(duì)CCR5進(jìn)行特異性編輯從而抵抗HIV-1的感染[46]。

6.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古生菌在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的RNA指導(dǎo)的降解入侵病毒或噬菌體DNA的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)最初由Ishino等[47]在大腸埃希菌K12中發(fā)現(xiàn)。CRISPR/Cas系統(tǒng)由Cas核酸酶和2個(gè)獨(dú)立的RNA組分，即crRNA和tracrRNA組成。入侵的噬菌體基因組中的原型間隔序列(protospacer)可以被Cas蛋白復(fù)合物靶向裂解為間隔序列(spacers)，接下來(lái)spacers被整合到宿主基因組CRISPR位點(diǎn)的5′端，隨后這些短的摻入的spacers被轉(zhuǎn)錄成crRNA和一個(gè)互補(bǔ)的tracrRNA并形成雙鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)核酸酶Cas在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。Protospacer的5′或3′端延伸的幾個(gè)堿基序列很保守，所以被稱(chēng)為PAM(protospacer adjacent motifs)。PAM序列在Cas蛋白復(fù)合物識(shí)別和選擇protospacer的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，只有帶有正確PAM序列的protospacer才能被整合到CRISPR陣列中[48]。CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為I型、II型和Ⅲ型，與其他需要多個(gè)Cas蛋白的系統(tǒng)相比，II型CRISPR/Cas系統(tǒng)只需要一個(gè)Cas9蛋白便能參與crRNA的成熟和裂解入侵的噬菌體DNA或外源質(zhì)粒[49]。crRNA和tracrRNA可嵌合形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA (single guide RNA)，在sgRNA的作用下，目的基因被Cas蛋白切割，從而造成DNA雙鏈斷裂，引發(fā)DNA修復(fù)機(jī)制，誘導(dǎo)基因的插入或缺失。CRISPR/Cas系統(tǒng)sgRNA設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單[50]，編輯效率高，可避免甲基化影響，同時(shí)也存在著脫靶效應(yīng)[51]和編輯效率存在差異等問(wèn)題。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已成功應(yīng)用于肺炎鏈球菌、大腸埃希菌基因組編輯[52]、釀酒酵母的高效定點(diǎn)突變和等位基因替換[53]、大病毒基因組編輯[54]、植物病毒干擾[55]以及地衣芽胞桿菌的工程改造[56]。

7 展 望

微生物基因功能的研究是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要內(nèi)容，其研究方法多樣，研究技術(shù)各有優(yōu)劣。目前來(lái)看，特異性不高、重組效率低、存在脫靶效應(yīng)、分子機(jī)制尚不完全明確和通用性低等是制約微生物基因功能研究技術(shù)發(fā)展的主要瓶頸。要解決這些問(wèn)題，需要多領(lǐng)域的研究者從不同的角度共同努力，在改進(jìn)和優(yōu)化現(xiàn)有研究技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)展出更為高效、精確和普適的基因組編輯工具。當(dāng)這些問(wèn)題得到徹底解決，人們操作微生物基因組的能力將會(huì)極大提高，不僅能更為深入地推進(jìn)微生物的致病機(jī)制、重要代謝及其調(diào)控機(jī)制等領(lǐng)域基礎(chǔ)理論研究的發(fā)展，還能在此基礎(chǔ)上發(fā)展出與生產(chǎn)、生活密切相關(guān)的基因工程產(chǎn)品，全面促進(jìn)微生物工業(yè)時(shí)代的到來(lái)。