RLRs介導(dǎo)的抗鯉春病毒血癥病毒作用研究進(jìn)展

尚信池， 盧玉婷， 程 義， 代 靜， 李月紅

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 教育部動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118)

在哺乳動(dòng)物中，宿主細(xì)胞感染病毒會(huì)觸發(fā)先天性免疫應(yīng)答，其特征在于誘導(dǎo)干擾素(IFN)和下游IFN刺激基因(ISGs)參與免疫應(yīng)答[1]。一旦病毒克服了物理和化學(xué)障礙，它將被宿主細(xì)胞的模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別。在感染病毒期間，機(jī)體通過(guò)多種途徑對(duì)RLRs介導(dǎo)的天然免疫進(jìn)行復(fù)雜調(diào)控，產(chǎn)生一個(gè)病毒-RLRs-IFN互聯(lián)反饋回路，確保RLRs維持適當(dāng)?shù)目共《拘盘?hào)水平[2]。大量研究表明，RNA病毒感染通常被宿主細(xì)胞質(zhì)受體識(shí)別，即視黃酸誘導(dǎo)基因I樣受體(RLRs)，DNA受體識(shí)別DNA病毒感染，如細(xì)胞內(nèi)cGAS(環(huán)狀GMP-AMP合成酶)、DAI(IRF的DNA依賴性激活劑，也稱為ZBP-1)、IFI16(IFN-γ-誘導(dǎo)蛋白16)等[3]。在硬骨魚中，病毒感染會(huì)激活宿主天然免疫IFN抗病毒反應(yīng)信號(hào)通路[4]，其中RLRs信號(hào)通路起到重要作用，通路中涉及的關(guān)鍵信號(hào)分子，如RIG-I、MDA5、MAVS、MITA、TBK1和IRF3/7，已在許多魚類中得到鑒定[5]。病毒感染后，魚類的這些基因會(huì)顯著誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，并且過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致IFN和ISG的上調(diào)以及宿主抗病毒狀態(tài)的建立[6-11]。此外，研究表明魚類具有保守RLR途徑以引發(fā)IFN表達(dá)和抗病毒反應(yīng)。SVCV是一種負(fù)義單鏈RNA病毒，主要在鯉科魚類中引起急性出血和傳染性疾病，尤其是鯉[12-13]。由于其對(duì)魚類的巨大傷害，SVCV感染的斑馬魚模型已被用于研究魚類抗病毒免疫能力[14-15]，通過(guò)使用這種病原體模型，魚類干擾素受體已經(jīng)確定[16]。此外，通過(guò)研究感染SVCV的不同來(lái)源的魚類細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)魚類抗SVCV過(guò)程中IFN通常會(huì)被上調(diào)[17-19]。現(xiàn)已有研究證實(shí)，RLRs不僅可活化天然免疫抗病毒通路，還可增強(qiáng)適應(yīng)性免疫效應(yīng)，在控制病毒感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，現(xiàn)對(duì)RLRs信號(hào)通路及其抗病毒信號(hào)調(diào)節(jié)因子和抗SVCV免疫的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 RLRs家族

RLRs屬于DEx D/H box helicase家族，為胞質(zhì)PRRs[2]。RLRs家族包括維甲酸誘導(dǎo)型基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)及遺傳學(xué)和生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白2(LGP2)三個(gè)成員[20]，通?？勺R(shí)別胞質(zhì)內(nèi)病毒的RNA。

RLR通過(guò)中心DExD/H-box解旋酶結(jié)構(gòu)域識(shí)別病毒RNA，隨后通過(guò)N-末端募集結(jié)構(gòu)域(CARD)將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游分子。這種識(shí)別方式招募并激活下游銜接蛋白線粒體抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)(MAVS)，進(jìn)一步導(dǎo)致絲/蘇氨酸蛋白激酶(TANK-binding kinase 1，TBK-1)的激活?；罨腡BK1反過(guò)來(lái)磷酸化并激活I(lǐng)FN調(diào)節(jié)因子IRF3/7(interferon regulatory factor，IRF)以誘導(dǎo)I型IFN產(chǎn)生和IFN刺激的基因(ISG)的表達(dá)以建立宿主抗病毒狀態(tài)。IFN基因刺激物(STING，也稱為MITA)，可以激活TBK1-IRF3/7-IFN[3]。線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(MAVS)和MITA通過(guò)TBK1介導(dǎo)的磷酸化依賴性機(jī)制激活I(lǐng)RF3誘導(dǎo)Ⅰ型IFN及IFN刺激基因(ISG)的表達(dá)，誘發(fā)抗病毒天然免疫反應(yīng)[4]。

動(dòng)物在應(yīng)對(duì)病毒感染時(shí)，入侵的病毒被RIG-I或者M(jìn)DA5識(shí)別，再通過(guò)MAVS傳遞信息，隨后TBK-1磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3和IRF5，最終激活I(lǐng)FN-Ⅰ的表達(dá)，調(diào)節(jié)天然免疫或者再激活下游細(xì)胞因子，發(fā)揮抗病毒作用[21]。LGP2則作為正調(diào)控因子參與RLR抗病毒信號(hào)通路。Zou等[22]研究魚類RIG-I發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SVCV的感染復(fù)數(shù)(MOI)分別為0.1和1，轉(zhuǎn)染的RIG-Ib過(guò)表達(dá)時(shí)，鯉上皮瘤(EPC)細(xì)胞上清液病毒滴度分別為1.88×104pfu/mL和2.23×103pfu/mL，與對(duì)照相比降低了70倍和1 082倍，并且RIG-Ib重組質(zhì)粒(10 ng)EPC細(xì)胞中表達(dá)，導(dǎo)致I型IFN啟動(dòng)子活性顯著增加。這些證據(jù)說(shuō)明外源RIG-Ib能夠強(qiáng)烈的誘導(dǎo)IFN-Ⅰ產(chǎn)生，以抵抗SVCV的感染。研究發(fā)現(xiàn)[23-24]，青魚(black crop，bc)感染SVCV后，多個(gè)器官bcLGP2 mRNA表達(dá)上調(diào)，而MDA5只在肌肉和腎中表達(dá)量較高。體外實(shí)驗(yàn)q-PCR結(jié)果顯示低劑量SVCV處理青魚鰭條組織(MPF)細(xì)胞，可上調(diào)其bcLGP2和bcMDA5的轉(zhuǎn)錄。并且相比對(duì)照組，轉(zhuǎn)染bcMDA5質(zhì)粒的EPC細(xì)胞可以減弱SVCV感染造成的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，細(xì)胞上清液中的病毒滴度也顯著降低。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)將表達(dá)bcMDA5和LGP2兩種重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)EPC細(xì)胞，青魚干擾素(eIFN)表達(dá)量比單獨(dú)轉(zhuǎn)染兩種表達(dá)質(zhì)粒時(shí)顯著提高。以上結(jié)果說(shuō)明LGP2和MDA5是細(xì)胞重要的抗病毒因子，LGP2與MDA5可共同識(shí)別SVCV的RNA，提高eIFN的表達(dá)，且LGP2增強(qiáng)MDA5介導(dǎo)抗病毒作用[25]。

2 RLRs抗病毒信號(hào)調(diào)控因子與IFN-I的產(chǎn)生

RIG-I，MDA-5和LGP2都識(shí)別核糖核酸。RIG-I做為病毒RNA胞質(zhì)傳感器的作用就是感知RNA病毒的感染。RIG-I主要識(shí)別5′端三磷酸化的單鏈RNA(ssRNA)和短雙鏈RNA(dsRNA)模擬物如poly Ⅰ：C、poly Ⅰ：U等，而MDA5主要識(shí)別長(zhǎng)dsRNA和包含ssRNA及dsRNA在內(nèi)的RNA結(jié)構(gòu)域。雖然能識(shí)別不同類型的病毒，但都需要適配子MAVS介導(dǎo)的固有免疫防御，并且需要共同合作來(lái)增強(qiáng)對(duì)正負(fù)鏈RNA病毒感染的有效應(yīng)答。并且RIG-I和MDA-5還能通過(guò)MAVS誘導(dǎo)TRIM和TRAFs等適配子和細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)[26]。誘導(dǎo)干擾素和促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而啟動(dòng)先天免疫應(yīng)答并且調(diào)節(jié)隨后的獲得性免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體抵抗病毒的能力。下面對(duì)幾種調(diào)控因子在抗SVCV時(shí)產(chǎn)生的作用做一詳細(xì)的綜述。

2.1 MAVS

線粒體抗病毒蛋白(MAVS)作為一些信號(hào)通路的調(diào)控樞紐，具有招募調(diào)控下游細(xì)胞因子抗病毒的作用。Zhou等[27]研究發(fā)現(xiàn)，bcMAVS在青魚組織內(nèi)廣泛表達(dá)，青魚感染SVCV后，脾中bcMAVS表達(dá)下降，肌肉和肝部表達(dá)上調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)中外源bcMAVS在EPC細(xì)胞中表達(dá)，以劑量依賴性方式誘導(dǎo)斑馬魚IFN啟動(dòng)子活性。Xiao等[28]研究發(fā)現(xiàn)，MAVS的跨膜結(jié)構(gòu)(TM)和N-末端半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域(CARD)對(duì)其抗病毒和誘導(dǎo)IFN表達(dá)至關(guān)重要。在免疫熒光顯微鏡下觀察到，感染SVCV后只有具有CARD和TM結(jié)構(gòu)域的bcMAVS才能在EPC細(xì)胞線粒體中形成聚集體。熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定顯示bcMAVS在EPC細(xì)胞中表達(dá)，以劑量依賴性方式誘導(dǎo)斑馬魚IFN啟動(dòng)子活化并且呈正相關(guān)，而缺少CARD和TM結(jié)構(gòu)域的bcMAVS對(duì)IFN的活化幾乎沒有影響。表達(dá)HA-bcMAVS重組質(zhì)粒的EPC細(xì)胞，通過(guò)與對(duì)照組比較SVCV滴度和細(xì)胞病變效應(yīng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)EPC細(xì)胞抗病毒能力提高。以上數(shù)據(jù)顯示，MAVS的TM和CARD結(jié)構(gòu)域?qū)ζ湔心枷掠渭?xì)胞因子和自身聚集以發(fā)揮抗病毒作用至關(guān)重要，MAVS廣泛存在于魚體內(nèi)，當(dāng)病毒入侵時(shí)，通過(guò)招募其他細(xì)胞因子誘導(dǎo)IFN-I表達(dá)，發(fā)揮抗病毒作用。Gong等[1]研究表明，MAVS和MITA的顯性失活突變體MAVS-ΔTM與MITA-CT的過(guò)表達(dá)削弱了SVCV對(duì)魚類IFN啟動(dòng)子的激活。MAVS-ΔTM和MITA-CT的明顯阻斷作用可能是通過(guò)SVCV調(diào)節(jié)IRF3和雙鏈RNA依賴的蛋白質(zhì)激酶(PKR)的表達(dá)，因?yàn)镸AVS-ΔTM表現(xiàn)出比MITA-CT更好的抑制作用。結(jié)果表明，魚類MAVS和MITA都是SVCV觸發(fā)的IFN表達(dá)所必需的。這些結(jié)果共同闡明了RLR介導(dǎo)的IFN信號(hào)傳導(dǎo)的保守性，這有助于魚類對(duì)RNA病毒感染做出反應(yīng)。

2.2 STING

STING作為一種 IFN 刺激因子被發(fā)現(xiàn)，并在大量組織多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，提示其在免疫調(diào)節(jié)方面可能具有十分重要的功能[29]。Lu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，感染SVCV青魚的bcSTING 在魚體腎臟表達(dá)上升，在肝、皮膚、心臟、脾中表達(dá)下降。體外實(shí)驗(yàn)中，使用SVCV(MOI=0.1)處理青魚(Mylopharyngodonpiceus)尾鰭細(xì)胞可以誘導(dǎo)bcSTING mRNA大量表達(dá)。在熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中，HA-bcSTING呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的IFN誘導(dǎo)活性，bcSTING-HA卻沒有該能力。但兩者分別轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞表達(dá)后進(jìn)行SVCV感染，都能減輕EPC細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)，顯著降低細(xì)胞上清液的病毒滴度，使EPC細(xì)胞具有抗病毒能力。這些數(shù)據(jù)可推測(cè)，bcSTING對(duì)病毒核酸有一定的識(shí)別能力，其C端結(jié)構(gòu)對(duì)誘導(dǎo)IFN活性至關(guān)重要。外源性bcSTING顯著提高了EPC細(xì)胞對(duì)SVCV抗病毒能力，表明bcSTING在青魚抗病毒先天免疫應(yīng)答中起重要作用。

2.3 TRAF6

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAFs)家族是一類胞內(nèi)接頭蛋白，能直接或間接與Toll樣受體接合，也能激活NF-κB信號(hào)通路，在天然免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Jiang等[31]發(fā)現(xiàn)，bcTRAF6 mRNA在青魚組織內(nèi)廣泛表達(dá)，感染SVCV青魚的不同組織bcTRAF6 mRNA表達(dá)均上調(diào)，其中鰓、皮膚、肝臟顯著上調(diào)。MPF細(xì)胞感染SVCV后bcTRAF6 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，表達(dá)量最高為5.2倍(MOI=0.1，72 h point)。結(jié)晶紫染色法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染并表達(dá)bcTRAF6的EPC細(xì)胞，在感染SVCV后，CPE和細(xì)胞上清病毒滴度跟對(duì)照組相似。同樣在熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EPC細(xì)胞轉(zhuǎn)染并過(guò)表達(dá)bcTRAF6，對(duì)斑馬魚 IFN3和青魚IFN沒有影響，而外源bcTRAF6在青魚腎(Mylopharyngodonpiceuskidney，MPK)細(xì)胞中以劑量依賴的方式觸發(fā)NF-κB的轉(zhuǎn)錄。因此他們嘗試將bcMAVS和bcTRAF6重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染或單獨(dú)轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)的bcTRAF6蛋白消失，在線粒體處與bcMAVS疊加在一起。使用熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定證實(shí)了外源bcTRAF6可以通過(guò)其他途徑介導(dǎo)MAVS來(lái)調(diào)節(jié)eIFN的表達(dá)。

2.4 TRAF2

TRAF2作為TRAF家族成員，參與NF-kB通路。Chen等[32]研究發(fā)現(xiàn)，bcTRAF2 mRNA在青魚組織內(nèi)廣泛分布，感染SVCV后，魚體心臟和鰓bcTRAF2 mRNA表達(dá)量下降，其他組織表達(dá)上調(diào)。使用不同濃度SVCV(MOI=0.01、0.1、1)處理MPF細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在48 h時(shí)，bcTRAF2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高，分別達(dá)到2.77、4.53、4.12倍。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明bcTRAF2過(guò)表達(dá)呈劑量依賴方式誘導(dǎo)NF-kB的轉(zhuǎn)錄，對(duì)斑馬魚IFN I的誘導(dǎo)幾乎沒有作用?？瞻咴囼?yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)bcMAVS和bcTRAF2的EPC細(xì)胞培養(yǎng)液中的病毒滴度，低于表達(dá)bcMAVS的EPC細(xì)胞，并且隨著bcTRAF2劑量增加，SVCV滴度降低。以上數(shù)據(jù)證明單獨(dú)的外源bcTRAF6或bcTRAF2都不能激活Toll樣受體信號(hào)通路，更不能誘導(dǎo)IFN的表達(dá)以此提高EPC細(xì)胞的抗病毒能力，但都能激活NF-κB的轉(zhuǎn)錄，通過(guò)MAVS和NF-kB信號(hào)通路調(diào)節(jié)魚類天然免疫發(fā)揮抗病毒的功能。

2.5 TRIM47

TRIM(The tripartite motif)家族的成員扮演著許多重要的角色，涉及許多細(xì)胞過(guò)程，如發(fā)育過(guò)程、腫瘤抑制、細(xì)胞周期調(diào)控和病毒反應(yīng)[33]。TRIM 蛋白家族還調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路[34]。Wang等[35]證明了鯉TRIM47在抗病毒過(guò)程以及對(duì)IFN-I信號(hào)通路的調(diào)控起著重要的作用。qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明，TRIM47在斑馬魚組織中廣泛存在，在腦部、肝和腎中高度表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)感染SVCV的鯉所有組織SVCV-G基因結(jié)果呈陽(yáng)性，其中鰓、腎、脾和肝中TRIM47 mRNA水平呈下降趨勢(shì)，第7天恢復(fù)到正常水平。此外感染SVCV(MOI=0.1)胖頭魚(FHM)細(xì)胞內(nèi)的TRIM47 mRNA顯著下降，表達(dá)TRIM47重組質(zhì)粒的FHM細(xì)胞感染SVCV后，發(fā)現(xiàn)SVCV-G基因轉(zhuǎn)錄水平明顯低于對(duì)照組，IFN-I表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果可推斷在正常情況下TRIM47在組織細(xì)胞內(nèi)廣泛存在并維持一定的水平，當(dāng)?shù)挚筍VCV病毒感染時(shí)，降低自身轉(zhuǎn)錄水平，以調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子，引起IFN-I的上調(diào)，激活魚類天然免疫過(guò)程。

圖1 RLR 介導(dǎo)的信號(hào)通路及其調(diào)節(jié)作用[36]

3 干擾素誘導(dǎo)的魚類Mx蛋白

抗黏液病毒基因蛋白(Mx)是IFN誘導(dǎo)蛋白家族成員之一，當(dāng)病毒入侵機(jī)體和細(xì)胞時(shí)，刺激干擾素表達(dá)，干擾素進(jìn)一步誘導(dǎo)Mx蛋白和其他蛋白表達(dá)，一起構(gòu)成細(xì)胞的抗病毒狀態(tài)，起到抑制病毒作用。B?rre等[39]通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育對(duì)大西洋鮭基因組進(jìn)行分析，定位于3條染色體的9個(gè)Mx基因。重組IFN刺激細(xì)胞系表達(dá)Mx基因，顯示染色體12中的Mx基因?qū)型IFN的反應(yīng)比對(duì)II型IFN(IFNγ)的反應(yīng)更強(qiáng)，而染色體25中的Mx基因?qū)FNγ的反應(yīng)比對(duì)I型IFN的反應(yīng)更強(qiáng)。Mx蛋白嚴(yán)格依賴于IFN-I表達(dá)，通過(guò)中樞連接結(jié)構(gòu)域(CID)和C端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域結(jié)合病毒核衣殼樣結(jié)構(gòu)，發(fā)揮抗病毒功能[40]。該分子抗病毒功能首先由Jean Lindenmann在研究小鼠對(duì)流感病毒的先天免疫中發(fā)現(xiàn)[41-42]，Xiao等[43]進(jìn)一步研究魚類Mx的功能，克隆和表達(dá)青魚Mx1(bcMx1)基因，發(fā)現(xiàn)bcMx1同樣具有抗病毒的能力。使用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)青魚組織中鰓中Mx1 mRNA含量遠(yuǎn)高于其他組織，感染SVCV后，鰓中bcMx mRNA下降。MPF細(xì)胞感染不同濃度SVCV后，q-RT-PCR檢測(cè)，除了2 h(MOI=0.01)外Mx mRNA水平降低，其他組都表達(dá)上調(diào)，最高為133倍(72 h，MOI=0.01)。轉(zhuǎn)染表達(dá)bcMx1的質(zhì)粒EPC細(xì)胞顯示出抗SVCV活性，CPE程度和細(xì)胞上清病毒滴度降低。綜上，魚類Mx蛋白具有抗病毒的能力，當(dāng)SVCV入侵時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)IFN-I表達(dá)上調(diào)，激活Mx基因的表達(dá)，參與抗病毒免疫過(guò)程。

4 展 望

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，人們對(duì)養(yǎng)殖過(guò)程出現(xiàn)的疾病的防治越來(lái)越重視，SVCV作為魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的病原體，研究宿主對(duì)SVCV的防御機(jī)制勢(shì)在必行。RLRs信號(hào)通路作為天然免疫應(yīng)答中的重要組成部分，在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡，激活天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。天然免疫作為機(jī)體防御的最重要屏障，其研究已取得諸多進(jìn)展。隨著對(duì)天然免疫信號(hào)通路的深入研究，天然免疫應(yīng)答對(duì)于入侵宿主病毒的抗病毒應(yīng)答也有了突破性進(jìn)展尤其在抑制病毒方面。從2004年RLRs被發(fā)現(xiàn)可以識(shí)別胞質(zhì)內(nèi)病毒RNA，RLRs的分子結(jié)構(gòu)及調(diào)控機(jī)制就受到了廣泛地研究。SVCV作為典型的RNA病毒，其感染有可能引發(fā)魚類IFN抗病毒反應(yīng)；然而，SVCV感染激活哪種信號(hào)傳導(dǎo)途徑以啟動(dòng)IFN應(yīng)答仍有待研究。

近些年研究發(fā)現(xiàn)NLRs和RLRs在抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)之間也有一些特殊的聯(lián)系，NLRs也同樣參加I型IFN調(diào)控，與MAVS作用活化IRF3，誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，增強(qiáng)宿主抗病毒狀態(tài)，但是怎樣作用于MAVS還需進(jìn)一步研究。現(xiàn)階段對(duì)于SVCV抗病毒免疫應(yīng)答的報(bào)道還相對(duì)較少，所以研究SVCV的抗病毒天然免疫應(yīng)答可以為SVCV的防治、SVCV疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。除此之外，研究領(lǐng)域還可以擴(kuò)展到SVCV基因調(diào)控，免疫逃避機(jī)制等，為SVCV的預(yù)防和控制提供新的策略。