天然產(chǎn)物中五元雜環(huán)生物合成過(guò)程的研究進(jìn)展

張怡軒， 侯少陽(yáng)， 章朦玥， 吳瑩瑩

(沈陽(yáng)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

五元雜環(huán)是一類含有除碳以外雜原子的五元環(huán)有機(jī)化合物。五元雜環(huán)分為含有一個(gè)雜原子的雜環(huán)和含有兩個(gè)雜原子的雜環(huán)，含有一個(gè)雜原子的五元雜環(huán)有呋喃、噻吩、吡咯，含有兩個(gè)雜原子的五元雜環(huán)有吡唑、咪唑、惡唑、異惡唑和噻唑[1]。五元雜環(huán)廣泛存在于肽類[2-4]、生物堿類[5]及核苷類似物[6]等多種活性天然產(chǎn)物中。由于五元雜環(huán)化合物與核苷酸結(jié)構(gòu)類似，具有形成氫鍵的特性，含有五元雜環(huán)的天然產(chǎn)物通常具有較好的生物活性，在抗菌[7]、抗炎[8]、抗病毒[9-10]、抗瘧[11]、預(yù)防癌癥[12]及免疫抑制[13]等方面均有深入研究。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)菌和真菌等微生物中五元雜環(huán)的前體可以是天然氨基酸[14-15]、乙酸[13]和乙酰輔酶A[16]等多種形式。早在1960年，Moyed等[17]提出了產(chǎn)氣桿菌(Bacillusaerogenes)中組氨酸咪唑環(huán)的生物合成機(jī)制，是首個(gè)提出的五元雜環(huán)生物合成的成環(huán)機(jī)制；1970年，O′Donovan和Forde提出了南非醉茄(WithaniasomniferaDunal) 中以二氨基丁酸為底物的吡唑環(huán)成環(huán)機(jī)制[15]；1996年，Kawamura等[18]提出了小四孢菌(MicrotetrasporaspiralisMI178-34F18)中以L-脯氨酸為底物的吡咯環(huán)成環(huán)機(jī)制，是首個(gè)提出的以氨基酸為底物生物合成五元雜環(huán)的成環(huán)機(jī)制；隨后，Thomas等[19]于2002年詳細(xì)闡述了霍亂弧菌(Vibriocholerae)中以L-脯氨酸為底物，經(jīng)NRPS合成途徑合成吡咯環(huán)；2001年，噻吩的生物合成過(guò)程經(jīng)Margl等在孔雀草(Frenchmarigold)中推測(cè)得到[16]；惡唑和噻唑在生物合成中的成環(huán)過(guò)程也相繼被發(fā)現(xiàn)[12,20-22]。隨著酶學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的飛速發(fā)展，使得與五元環(huán)成環(huán)相關(guān)酶的特性和結(jié)構(gòu)得到逐步解析[23-30]，我們也能更加直觀地認(rèn)識(shí)五元環(huán)的成環(huán)過(guò)程。但是，部分五元環(huán)成環(huán)機(jī)制仍沒(méi)有被完全闡明，如NRPS生物合成途徑中惡唑和吡喃環(huán)的合成。五元雜環(huán)環(huán)化酶的底物通常分子量較小，在進(jìn)行酶學(xué)特性實(shí)驗(yàn)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析時(shí)較為困難，因此對(duì)應(yīng)酶學(xué)研究仍停留在假設(shè)階段[31-33]。本文將從吡咯、惡唑和噻唑三種五元雜環(huán)入手，分別綜述其在生物體內(nèi)合成途徑中的環(huán)化機(jī)制。

1 吡咯環(huán)的生物合成

吡咯環(huán)的生物合成底物可以為天然氨基酸、丙酮酸或乙酸等，成環(huán)方式多種多樣，可直接由天然環(huán)脫氫氧化，也可以由小分子底物經(jīng)過(guò)酶催化環(huán)化甚至可由底物經(jīng)分子重排成環(huán)。

1.1 靈菌素中吡咯環(huán)生物合成過(guò)程

靈菌素(prodigiosins)是一種紅色的天然產(chǎn)物，可由多種革蘭陽(yáng)性菌或革蘭陰性菌產(chǎn)生[4,34-37]，因其分子結(jié)構(gòu)中有3個(gè)吡咯環(huán)，所以又名三聚吡咯。靈菌素的生物合成過(guò)程在γ-變形桿菌Serratiamarcescens中首次被發(fā)現(xiàn)[38]，隨后在假交替單胞菌Pseudoalteromonasrubra中解析[39]。靈菌素由脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸和幾個(gè)二碳單位合成，靈菌素生物合成基因簇由兩個(gè)酶催化途徑組成的單向多順?lè)醋咏M成[40]，兩個(gè)酶分別催化合成2-甲基-3-n-戊烷基-吡咯(MAP)和4-甲氧基-2,2′-吡咯-5-甲醛(MBC)。如圖1所示，MAP生物合成途徑由pigB、pigD和pigE構(gòu)成。首先，PigD在輔酶硫胺素焦磷酸(TPP)存在下催化丙酮酸形成辛烯酸，PigE催化其環(huán)化形成2-甲基-3-n-戊烷基-二氫吡咯(H2MAP)，PigB催化H2MAP氧化形成MAP；MBC生物合成途徑共包含7個(gè)基因(pigA、pigF～J、pigL和pigM)，4′-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PigL)將PigG的?；d脂蛋白(PCP)結(jié)構(gòu)域由apo狀態(tài)活化到holo狀態(tài)；PigI在ATP的作用下催化L-脯氨酸的L-脯氨酰基團(tuán)轉(zhuǎn)移形成L-脯氨酰-S-PCP中間體，PigA將中間體氧化，形成吡咯基-2-羧基-S-PCP，由此第一個(gè)吡咯環(huán)形成；PigH的ACP結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化為丙二酰輔酶A提供結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合的丙二酰輔酶A隨后進(jìn)行脫羧與連接在PigJ上的吡咯-2-羧基硫代酯發(fā)生縮合，在PigH上形成吡咯-β-酮硫代酯，PigH能催化絲氨酸和吡咯-β-酮硫代酯縮合形成4-羥基-2,2′-吡咯-5-甲醇[40-41]，經(jīng)過(guò)PigM、PigF和PigN催化氧化及甲基轉(zhuǎn)移，最終形成MBC；PigC利用MAP和MBC在ATP的參與下將兩個(gè)分子縮合形成靈菌素。

由上述可知，靈菌素中一個(gè)吡咯環(huán)由乙酸和乙酸銨等二碳單位經(jīng)NRPS合成酶催化合成；另一個(gè)吡咯環(huán)由絲氨酸和脯氨酸經(jīng)PKS合成途徑共同環(huán)化而成；第三個(gè)吡咯環(huán)由脯氨酸經(jīng)黃素依賴的脫氫酶氧化而來(lái)[36]?？偟膩?lái)說(shuō)，靈菌素中吡咯環(huán)成環(huán)機(jī)制極具代表性，由NRPS-PKS雜合系統(tǒng)表達(dá)而來(lái)，涉及的酶反應(yīng)較多，為五元環(huán)成環(huán)機(jī)制研究提供新視野。

圖1 靈菌素生物的生物合成過(guò)程[36]

1.2 吡咯尼林中吡咯環(huán)的生物合成

吡咯尼林(Pyrrolnitrin，PRN)，3-氯-4-(2-硝基-3-氯苯基)吡咯，是一種含有兩個(gè)氯原子和一個(gè)硝基的苯基吡咯衍生物[42]。早在1964年，Arima等[43]就從假單胞菌(Pseudomonasspp.)中分離得到PRN類化合物；1966年，Lively等[44]研究表明，在假單胞菌(PseudomonasaureofaciensATCC 15926)中，PRN生物合成前體為L(zhǎng)-色氨酸；隨后Hammil等[45]的研究則表明含有D-色氨酸的培養(yǎng)基可使假單胞菌(Pseudomonasaureofaciens)的PRN高產(chǎn)。以色氨酸為底物經(jīng)分子重排即得到吡咯尼林的吡咯環(huán)，具體生物合成途徑如圖2所示。首先色氨酸在黃素依賴的色氨酸-7-鹵代酶(PrnA)的催化下生成7-氯-色氨酸，7-氯-色氨酸在單氯代氨基吡咯尼林合成酶(PrnB)催化下得到單氯代氨基吡咯尼林，由此，吡咯尼林中吡咯環(huán)形成。隨后，黃素依賴的PrnC催化單氯代氨基吡咯尼林發(fā)生鹵代反應(yīng)，即在吡咯環(huán)上發(fā)生氯代，形成氨基吡咯尼林，最終在氨基吡咯尼林氧化酶(PrnD)作用下氨基被氧化為硝基，吡咯尼林最終合成。在吡咯尼林合成過(guò)程中，由天然氨基酸作為直接底物，吡咯環(huán)成環(huán)時(shí)不涉及其他小分子加入，僅僅依靠分子內(nèi)重排形成吡咯環(huán)。

圖2 吡咯尼林的生物合成途徑[46-47]

2 噻唑環(huán)的生物合成

噻唑環(huán)在天然產(chǎn)物中廣泛存在[4,12,21,25,48-49]，現(xiàn)在已知的噻唑環(huán)化合物一般經(jīng)過(guò)NRPS-PKS途徑合成，合成底物一般為天然氨基酸和小分子碳單位。隨著近年來(lái)酶學(xué)研究的快速發(fā)展，對(duì)噻唑合成酶的異源表達(dá)、分離純化和特性的表征有了更深入的研究[50-51]。

2.1 埃博霉素中噻唑環(huán)的生物合成

埃博霉素(Epothilone)是一種具有抗腫瘤活性的內(nèi)酯類化合物，由堆囊菌屬(Sorangium)菌株產(chǎn)生[48]。埃博霉素類天然產(chǎn)物有A、B、C和D四種類似物，因D具有良好的抗腫瘤活性而備受關(guān)注[52-53]，圖3(a)即為埃博霉素D的結(jié)構(gòu)。堆囊菌Sorangiumcellulosum中埃博霉素生物合成基因簇如圖3(b)所示，epoA、epoB和epoC先后參與噻唑環(huán)的形成，圖3(a)中化合物結(jié)構(gòu)中標(biāo)記的顏色對(duì)應(yīng)圖3(b)中基因簇的顏色，可以看出epoB直接參與噻唑環(huán)的環(huán)化；圖3(c)描述了由丙二酰輔酶A合成噻唑環(huán)的具體過(guò)程，EpoA是epothilone生物合成的起始模塊，首先裝載丙二酰輔酶A，經(jīng)過(guò)KSy結(jié)構(gòu)域脫羧形成乙酰-S-EpoA，EpoB的Cy結(jié)構(gòu)域具有雙功能催化活性，首先催化乙?；D(zhuǎn)移形成C-N鍵，接著在Cy結(jié)構(gòu)域催化下形成噻唑烷基硫代酯中間體，EpoB的Ox結(jié)構(gòu)域是黃素依賴的氧化酶，將噻唑烷氧化形成異芳基即噻唑環(huán)，接著傳遞給EpoC進(jìn)行epothilone的后續(xù)合成。

Epothilone中噻唑環(huán)的合成底物為丙二酰輔酶A和半胱氨酸，經(jīng)過(guò)EpoB的催化環(huán)化及氧化得到完整噻唑環(huán)。該合成過(guò)程的中間產(chǎn)物經(jīng)過(guò)Chen等[25]利用HPLC和質(zhì)譜等分析手段逐一分析，詳細(xì)展示了epothilone中噻唑環(huán)的合成機(jī)制及相關(guān)酶的催化過(guò)程，為epothilone中噻唑環(huán)的形成提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.2 硫胺素中噻唑環(huán)的合成過(guò)程

硫胺素(維生素B1，vitamin B1)對(duì)于大多數(shù)微生物是必需的，在碳水化合物和氨基酸代謝中起著重要作用[54]。硫胺素在生物合成過(guò)程中分為噻唑和嘧啶兩個(gè)獨(dú)立過(guò)程，噻唑和嘧啶經(jīng)過(guò)縮合形成硫胺素[55-56]。無(wú)論是真核生物還是原核生物均能合成硫胺素，現(xiàn)有文獻(xiàn)常在細(xì)菌中討論硫胺素嘧啶基的生物合成，在酵母等真核生物中討論硫胺素噻唑環(huán)的合成[57]。噻唑環(huán)形成的分子機(jī)制在多種真核生物中得到深入解析，不同生物體內(nèi)含有多種噻唑合成酶，比如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的THI4p[58-59]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)中的THI1[60-61]、米曲霉(Aspergillusoryzae)中的ThiA[62]。如圖4(a)所示即為釀酒酵母中THI4p催化噻唑環(huán)合成的過(guò)程，噻唑環(huán)合成底物為NAD+、甘氨酸和半胱氨酸，THI4p催化NAD+和甘氨酸在單次成環(huán)反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為ADT，THI4p的Cys205為噻唑環(huán)提供硫原子。

圖3 埃博霉素生物合成簡(jiǎn)介

細(xì)菌生長(zhǎng)同樣需要硫胺素，多數(shù)細(xì)菌也可獨(dú)立合成硫胺素中的噻唑環(huán)[55]。細(xì)菌中與硫胺素噻唑環(huán)合成有關(guān)酶的晶體結(jié)構(gòu)如圖4(b)所示，即ThiG和ThiS復(fù)合體。通過(guò)該晶體結(jié)構(gòu)能更好地闡述細(xì)菌體內(nèi)硫胺素噻唑環(huán)的合成，ThiG-ThiS復(fù)合體結(jié)構(gòu)是點(diǎn)對(duì)稱的8聚體結(jié)構(gòu)，ThiG和ThiS在空間上較為接近使其能進(jìn)行如圖4 (c)所示反應(yīng)，ThiG通過(guò)裝載Deoxy-D-xylulose-5-phosphate，ThiS提供噻唑環(huán)的硫原子，經(jīng)過(guò)脫水環(huán)化反應(yīng)最終形成不帶芳香性的五元環(huán)。隨后，TenI催化脫氫形成具有芳香性的噻唑環(huán)，至此細(xì)菌中噻唑環(huán)合成。

硫胺素中噻唑環(huán)生物合成的原料為天然氨基酸和小分子碳單位，但不涉及NRPS或PKS合成過(guò)程，通常由噻唑合成酶直接環(huán)化脫水合成[58-59]。硫胺素中噻唑環(huán)的合成機(jī)制探討的較為清楚，如圖4(b)所示，噻唑環(huán)合成相關(guān)酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定，可以更加直觀地認(rèn)識(shí)噻唑環(huán)的環(huán)化過(guò)程。

圖4 噻唑環(huán)生物合成簡(jiǎn)介

3 惡唑環(huán)的環(huán)化過(guò)程

和噻唑環(huán)類似，惡唑環(huán)也廣泛存在于天然產(chǎn)物中[63]。惡唑環(huán)通常被認(rèn)為由氨基酸作為底物直接合成(圖5)[20,64]。已有文獻(xiàn)報(bào)道了某些天然產(chǎn)物中的惡唑環(huán)是氨基酸來(lái)源的，如microncin[22,65]。但是仍有很多天然產(chǎn)物惡唑環(huán)的合成機(jī)制不清、前體不明，如oxazolomycin[31]、ulapulalides[66]等，這些化合物的惡唑環(huán)明顯位于聚酮衍生的碳鏈內(nèi)部，因此其惡唑環(huán)可能不是由氨基酸作為前體直接合成。

3.1 Microncin中惡唑環(huán)的生物合成

Microncin是一類原核核糖體和翻譯后修飾肽(prokaryotic ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptides，RiPPs)，其惡唑環(huán)直接來(lái)源于半胱氨酸和絲氨酸殘基[22]。如圖5所示，microncin中惡唑環(huán)或噻唑環(huán)由B、C、D三蛋白復(fù)合體識(shí)別前導(dǎo)肽催化合成五元雜環(huán)。合成過(guò)程總體分為兩步，首先蛋白C和D利用一分子ATP催化直鏈肽段環(huán)化，形成不具有芳香性的五元雜環(huán)；然后FMN依賴的蛋白B催化不具有芳香性的五元雜環(huán)脫水最終形成具有芳香性的五元雜環(huán)。圖5(c)所示為蛋白D催化環(huán)化形成五元雜環(huán)的具體過(guò)程，即蛋白D利用ATP磷酸化肽段殘基中的羰基氧磷酸化，使其脫水并完成環(huán)化反應(yīng)。圖5(d)中列舉了其他含有惡唑環(huán)的RiPPs，可以看出由直鏈多肽合成五元雜環(huán)，每個(gè)生物合成基因簇中的生物合成酶較為類似，均含有一個(gè)前體肽解碼酶和惡唑環(huán)合成酶(環(huán)化脫水酶和脫氫酶)直接由直鏈氨基酸殘基經(jīng)過(guò)環(huán)化脫水和氧化脫氫得到芳香惡唑環(huán)。

3.2 Oxazolomycins中惡唑環(huán)的合成過(guò)程

Oxazolomycins(OZMs)類化合物可由多種放線菌產(chǎn)生，近年來(lái)化合物的種類不斷增多，并且表現(xiàn)出重要的抗菌、抗腫瘤和抗艾滋病病毒(HIV)活性[33,67-69]。Oxazolomycin A屬于聚酮類化合物，由PKS-NRPS雜合基因簇合成，包含一個(gè)惡唑環(huán)，現(xiàn)已從多株鏈霉菌中分離得到[31-33,69]。如圖6列舉的OZMs類化合物生物合成的部分基因簇，雖然這類化合物的生物合成基因簇是已知的，但惡唑環(huán)的合成機(jī)制始終沒(méi)有得到解析。2015年，Zhou等提出了兩種由CongE催化的環(huán)化脫水形成惡唑環(huán)過(guò)程，圖6(e)機(jī)制(1)中CongE通過(guò)ATP中焦磷酸鹽的轉(zhuǎn)移，來(lái)激活酰胺基氧磷酸化促進(jìn)惡唑環(huán)的形成，該機(jī)制已被報(bào)道有助于惡唑環(huán)的形成[32]；機(jī)制(2)中，ATP通過(guò)激活另一個(gè)酮基完成惡唑環(huán)的合成。與microncin中蛋白B、C和D的催化機(jī)制不同，CongE中沒(méi)有氧化還原中心，無(wú)法進(jìn)行與microncin中蛋白B相似的氧化反應(yīng)，因此圖6(e)的反應(yīng)機(jī)制存在一定缺陷。本課題組通過(guò)對(duì)oxazolomycins類化合物基因簇的進(jìn)化分析，進(jìn)行惡唑合成相關(guān)酶的異源表達(dá)、純化及體外反應(yīng)工作，提出了新的OZMs類化合物中惡唑環(huán)化機(jī)制(待發(fā)表)。

圖5 RiPPs中噻唑環(huán)生物合成簡(jiǎn)介

圖6 Oxazolomycins類化合物中惡唑環(huán)生物合成基因簇及成環(huán)機(jī)制簡(jiǎn)介

4 展 望

來(lái)自分子遺傳學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域的研究者使天然產(chǎn)物中五元雜環(huán)的生物合成過(guò)程和機(jī)制逐步清晰，五元雜環(huán)可由單酶催化，也可由多酶協(xié)作催化合成。這不僅可以解答重要的基礎(chǔ)研究問(wèn)題，更重要的是研究者可利用現(xiàn)有的五元雜環(huán)成環(huán)機(jī)制推測(cè)未知化合物的成環(huán)過(guò)程，為新化合物生物合成基因簇的表征和合成機(jī)制的推導(dǎo)提供思路。

就目前的研究成果看，多數(shù)五元雜環(huán)的合成過(guò)程研究?jī)H停留在基因?qū)用?。由于五元雜環(huán)分子量較小，給結(jié)構(gòu)生物學(xué)和酶催化機(jī)制研究帶來(lái)了困難。隨著組合生物合成的發(fā)展，如何選擇合適的酶反應(yīng)底物以更加合理地進(jìn)行五元雜環(huán)環(huán)化酶反應(yīng)中間體的捕獲，給五元雜環(huán)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提出了新的要求。此外，五元雜環(huán)在發(fā)揮生物功能時(shí)，通常嵌入到DNA中使DNA損傷，在含有五元雜環(huán)的天然化合物合成過(guò)程中，如何保衛(wèi)自身細(xì)胞免受五元雜環(huán)化合物的損害還有待進(jìn)一步研究。由此，五元雜環(huán)是某些天然產(chǎn)物具有良好生物活性的前提，含有五元雜環(huán)的化合物通常具有良好的抗菌、抗腫瘤和抗病毒等活性，可將五元雜環(huán)合成酶作為化合物合成模塊，應(yīng)用到組合生物合成中，為新化合物的發(fā)現(xiàn)及定向合成新化合物提供模塊支持。