膿毒性腦病的神經(jīng)化學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展

金 曄,趙博倫,韓曉菲,劉慶平,王 歡*

(1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遼寧省糖脂代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國遼寧大連116622;2.大連大學(xué)護(hù)理學(xué)院,中國遼寧大連106011)

神經(jīng)化學(xué)的研究闡明了神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用機(jī)制。這些研究包括對神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等構(gòu)成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)調(diào)質(zhì)的識(shí)別及測定?；谏窠?jīng)機(jī)制的神經(jīng)遞質(zhì)已經(jīng)被不斷發(fā)展的神經(jīng)化學(xué)技術(shù)所證明。目前,神經(jīng)化學(xué)研究中所運(yùn)用的技術(shù)包括:免疫組織化學(xué)、使用種屬特異抗體的免疫印跡以及放射性物質(zhì)的標(biāo)記等[1～2]。這些包括電生理學(xué)在內(nèi)的技術(shù)方法將是研究膿毒性腦病的病理生理學(xué)機(jī)制的有力工具。同時(shí),神經(jīng)化學(xué)技術(shù)可應(yīng)用于正常大腦中的突觸傳導(dǎo)、突觸的可塑性及神經(jīng)再生等生理功能檢測。另一方面,這些技術(shù)還可用于發(fā)現(xiàn)腦疾病的發(fā)病機(jī)制。本文將重點(diǎn)放在重癥監(jiān)護(hù)室中常遇到的膿毒性腦病的病理學(xué)研究上。

通常情況下,血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)是保護(hù)機(jī)體大腦免于有害物質(zhì)及外來損傷的防線。然而,膿毒癥可致血腦屏障受損(血腦屏障的通透性增強(qiáng))并使神經(jīng)遞質(zhì)的釋放失衡。此外,在膿毒癥過程中細(xì)胞凋亡信號(hào)通路被激活[3～4],從而使化學(xué)分子通過血腦屏障進(jìn)入大腦,導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞壞死并伴隨有大腦的局部缺血[5]及水腫[6]。這些病理改變最終導(dǎo)致大腦代謝失衡?，F(xiàn)就膿毒性腦病過程中神經(jīng)遞質(zhì)紊亂等神經(jīng)化學(xué)改變的病理機(jī)制、神經(jīng)調(diào)節(jié)的治療作用及量子點(diǎn)納米技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行簡要總結(jié)與討論,旨在進(jìn)一步聚焦膿毒性腦病發(fā)病環(huán)節(jié)的研究,不斷提高其認(rèn)識(shí)水平,為最終戰(zhàn)勝這一病癥提供新思路。

1 膿毒性腦病與神經(jīng)遞質(zhì)

膿毒性腦病是一種破壞性的綜合征,為膿毒癥所引起的全身性炎癥反應(yīng),在多器官功能障礙綜合征患者中出現(xiàn)。膿毒性腦病患者的癥狀表現(xiàn)為長期的認(rèn)知障礙,包括記憶力、注意力以及意識(shí)的改變。

目前,許多研究小組針對膿毒性腦病的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,試圖找出有效的靶點(diǎn)[7～13]。Tracey 等[7～8,13]在 2013 年重新將膿毒癥定義為由感染引起并伴隨器官功能障礙的全身性反應(yīng),并在后續(xù)研究中證明PINK1-PARK2介導(dǎo)的神經(jīng)免疫學(xué)通路受損可導(dǎo)致膿毒癥性死亡,而神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫代謝紊亂可致細(xì)胞功能受損,提示這些相關(guān)發(fā)病機(jī)制可能是未來治療策略的關(guān)鍵[13]。Immura 等[9～10]證明組蛋白乙酰化可以調(diào)控 NR2B(N-methyl-D-aspartate 2B subunit)及白介素1受體(interleukin-1 receptor,IL-1R)的表達(dá),并減輕炎癥引起的感覺神經(jīng)元功能障礙。另外,Immura團(tuán)隊(duì)將高熒光量子點(diǎn)對小鼠尾靜脈進(jìn)行注射,并通過近紅外熒光成像技術(shù)觀察到了膿毒癥小鼠腦靜脈血栓的形成,此項(xiàng)技術(shù)可實(shí)時(shí)有效檢測小鼠腦血管的病理狀態(tài)。姚詠明等[12]發(fā)現(xiàn)在膿毒癥發(fā)病過程中,細(xì)胞因子和乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)之間的相互作用可導(dǎo)致神經(jīng)元丟失及膽堿能信號(hào)異常,因此在膿毒癥治療中應(yīng)特別重視免疫系統(tǒng)與外周器官的相互作用;同時(shí),他強(qiáng)調(diào)進(jìn)一步了解膿毒性腦病的病因,將有助于今后制定新的治療方案。Nau等[11]討論了診斷膿毒癥性相關(guān)腦病的技術(shù)檢查與生物標(biāo)志物的選擇,以及當(dāng)前所用實(shí)驗(yàn)方法及臨床的治療方案,提出了可用于今后診斷的新成像技術(shù):1)正電子放射計(jì)算機(jī)掃描技術(shù),該技術(shù)可觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫細(xì)胞的活化;2)氧化鐵納米顆粒結(jié)合磁共振,該技術(shù)可追蹤入腦的免疫細(xì)胞;3)T2弛豫法和Annexin V法,前者可測腦內(nèi)鐵含量,后者可評估細(xì)胞凋亡。這些研究工作都將為今后膿毒癥的基礎(chǔ)研究與臨床工作指明方向并提供新思路。膿毒性腦病的典型特征是:全身的化學(xué)物質(zhì)可通過失去保護(hù)能力的血腦屏障進(jìn)入大腦的神經(jīng)元中。實(shí)際上,研究者們在患膿毒性腦病的小鼠大腦中發(fā)現(xiàn),血腦屏障的基本結(jié)構(gòu)緊密連接(tight junction,TJ)顯著減少[14～15]。這可能導(dǎo)致膿毒性腦病患者出現(xiàn)水腫的癥狀[16～17]。

另外,有研究報(bào)告提出在膿毒性腦病中可能存在神經(jīng)遞質(zhì)的失衡[1,5]。膿毒性腦病狀態(tài)下的γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)、多巴胺及乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)異常的原因可能是膿毒性腦病患者血漿中氨基酸濃度的異常增高[18]。有研究顯示,這種血漿中氨基酸濃度的異常與膿毒性腦病的發(fā)病密切相關(guān)[19]。例如:谷氨酸、天冬氨酸和色氨酸等氨基酸是神經(jīng)遞質(zhì)或是合成神經(jīng)遞質(zhì)的原料,而在膿毒性腦病患者中人們發(fā)現(xiàn)這些氨基酸水平存在異常[18]。此外,通過研究膿毒性腦病的動(dòng)物模型,證實(shí)這些氨基酸代謝紊亂影響了大腦中的神經(jīng)遞質(zhì)。在大鼠盲腸結(jié)扎和穿刺的膿毒癥模型中人們發(fā)現(xiàn),腦中大多數(shù)所需的氨基酸水平增高,大腦色氨酸水平的升高可能導(dǎo)致血清素代謝增強(qiáng),而注射富含支鏈氨基酸藥物可恢復(fù)大腦氨基酸水平及正常神經(jīng)遞質(zhì)特征,提示這些腦神經(jīng)遞質(zhì)代謝的異常可能與膿毒性腦病的發(fā)生有關(guān)[20]。此外,在膿毒性腦病大鼠模型中,人們發(fā)現(xiàn)單胺神經(jīng)遞質(zhì)異常與谷氨酸傳導(dǎo)功能障礙導(dǎo)致突觸可塑性受到干擾[21]。綜合上述分析,引起膿毒性腦病的重要原因可能是神經(jīng)遞質(zhì)失衡引起興奮性毒性,從而使突觸后神經(jīng)元過度興奮并死亡,最終導(dǎo)致腦功能障礙。

2 膿毒癥中大腦的突觸傳遞機(jī)制

2.1 大腦中突觸傳遞的一般機(jī)制

神經(jīng)元細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)最基本的構(gòu)成單位,當(dāng)來自體內(nèi)外的信號(hào)刺激神經(jīng)元興奮,產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng),神經(jīng)遞質(zhì)就會(huì)從神經(jīng)元突觸前膜釋放出來,突觸后膜接受神經(jīng)遞質(zhì)受體與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合后,使突觸后細(xì)胞興奮,此后這些信息在大腦中進(jìn)行傳遞(化學(xué)突觸傳遞)。谷氨酸、乙酰膽堿及多巴胺等主要神經(jīng)遞質(zhì)對于維持突觸傳遞和突觸可塑性的正常功能是必需的,而這些神經(jīng)遞質(zhì)的異常將會(huì)阻礙突觸功能。

2.2 膿毒癥對突觸受體及其調(diào)節(jié)機(jī)制的影響

膿毒癥患者中的突觸傳遞似乎受到影響[7,22]。雖然到目前為止,人們還沒有找到膿毒癥是導(dǎo)致突觸傳遞異常的直接證據(jù),但是膿毒癥誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子改變了突觸功能。例如:白細(xì)胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)在膿毒癥后濃度升高,從而阻礙神經(jīng)遞質(zhì)受體的表達(dá),包括天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體[10,21]和 α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑-丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionate,AMPA)受體[23]。相反,IL-1β可增強(qiáng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體的表達(dá),如GABA受體[24]。此外,一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的濃度在膿毒癥發(fā)生后也會(huì)升高[25]?？梢?這些神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)及其受體對突觸傳遞和可塑性是至關(guān)重要的。膿毒癥病理過程中的下游物質(zhì),如IL-1等細(xì)胞因子,可能與突觸傳遞及其可塑性的失衡相關(guān)。有研究報(bào)道,加入IL-1受體阻斷劑來抑制IL-1β可使膿毒癥的小鼠有效地恢復(fù)長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)誘導(dǎo)并改善腦功能[14]。此外,研究人員發(fā)現(xiàn),通過IL-1受體拮抗劑(IL-1RI antagonist,IL-1ra)可以抑制IL-1誘導(dǎo)GABA激活內(nèi)向電流(GABA-elicited inward chloride currents,IGABA)的增強(qiáng)延遲。這些結(jié)果顯示在膿毒性腦病發(fā)病過程中IL-1可能改變中樞GABA氨基丁酸能的突觸強(qiáng)度,從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[24]。

Imamura等[14]使用膿毒癥小鼠模型來驗(yàn)證IL-1與突觸功能障礙的關(guān)系。研究通過“盲腸結(jié)扎和穿刺法(cecal ligation and puncture,CLP)”與假手術(shù)組對照來確定差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)盲腸結(jié)扎和穿刺操作所引起的膿毒癥導(dǎo)致血腦屏障被破壞,海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞上的IL-1β表達(dá)增高,同時(shí)神經(jīng)元中的IL-1β受體表達(dá)也相應(yīng)增高;但是,長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)不能在患有膿毒癥的小鼠中被誘導(dǎo);而在使用IL-1β受體拮抗劑進(jìn)行預(yù)處理后,在膿毒癥的小鼠中可以成功誘導(dǎo)出LTP。上述研究表明,膿毒癥發(fā)生后腦內(nèi)IL-1增加并導(dǎo)致突觸的可塑性受損。

雖然目前有關(guān)膿毒癥過程中突觸傳遞及炎癥因子上升的研究已經(jīng)取得了一定成果,但還有一些關(guān)鍵問題沒有解決,主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn):1)對于突觸功能而言,類似于IL-1β的其他細(xì)胞因子如高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1,HMGB1)[26]和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)[27～28]等在大腦中表達(dá)豐富且起著調(diào)節(jié)因子的作用,其中HMGB1在斑馬魚的正常腦發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,TNF在膿毒性腦病及帕金森綜合征等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中過度表達(dá),能否通過改善這些因子的過度分泌或加以消除達(dá)到治療膿毒性腦病的目的尚且不知;2)Imamura等[14]發(fā)現(xiàn)CLP誘導(dǎo)膿毒癥后IL-1β水平上升且海馬區(qū)功能受損,但在其他腦區(qū)IL-1β的表達(dá)及作用尚不清楚。此外,陸續(xù)有脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及CLP模型大腦皮層以及膿毒癥患者血清及腦脊液中相關(guān)因子變化的報(bào)道[15,29～30],然而其他腦區(qū)的相關(guān)數(shù)據(jù)卻少之又少。目前,除海馬區(qū)及大腦皮層外,在膿毒癥模型中其他腦區(qū)病理變化及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。膿毒癥對海馬以外的其他腦區(qū)的影響如何尚不清楚。

3 神經(jīng)調(diào)節(jié)在膿毒癥治療中的作用及機(jī)制

研究者發(fā)現(xiàn)在注射LPS大鼠的模型中,交感神經(jīng)及迷走神經(jīng)失衡,而刺激迷走神經(jīng)對膿毒癥后交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)的再平衡和抗炎發(fā)揮積極作用[31]。此外,研究結(jié)果顯示刺激迷走神經(jīng)或給與乙酰膽堿受體激動(dòng)劑可抑制感染及促炎因子產(chǎn)生,從而使膿毒癥癥狀得到緩解[32～34]。迷走神經(jīng)將副交感神經(jīng)元給出的信號(hào)投射到除腎上腺以外的所有器官,并控制乙酰膽堿能的突觸傳遞。Wang等[35]證明了乙酰膽堿能受體對于通過刺激迷走神經(jīng)抑制巨噬細(xì)胞TNF的合成,并減弱全身炎癥反應(yīng)至關(guān)重要。迷走神經(jīng)興奮可抑制膿毒癥引起的肺[36]、腸[37]、脾[34]等器官的損傷。此外,迷走神經(jīng)興奮也可抑制巨噬細(xì)胞中HMGB1的過度釋放[38]。當(dāng)內(nèi)毒素誘導(dǎo)膿毒癥時(shí),感染部位通過核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的活化來促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放。該信號(hào)傳導(dǎo)途徑通過細(xì)胞因子風(fēng)暴加速細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而加速細(xì)胞死亡[39]。當(dāng)腦干迷走神經(jīng)受到刺激時(shí),可通過激活乙酰膽堿受體從而激活膽堿能抗炎通路,并抑制脾臟中的先天免疫反應(yīng)。乙酰膽堿受體通過激活Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)途徑促使細(xì)胞因子釋放,從而抑制NF-κB的活化。另外,相關(guān)研究用高頻電壓脈沖對迷走神經(jīng)進(jìn)行點(diǎn)刺激,發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠模型中的生理參數(shù)及腦組織的炎癥反應(yīng)發(fā)生改變,進(jìn)一步證實(shí)迷走神經(jīng)—膽堿能抗炎通路可能通過下調(diào)炎性介質(zhì)表達(dá),對大腦損害的相關(guān)機(jī)制起保護(hù)作用,延緩病情發(fā)展,從而改善腦功能[40]。膿毒癥導(dǎo)致的膽堿能神經(jīng)功能障礙可能參與了膿毒性腦病的發(fā)病過程,但乙酰膽堿的合成及其受體的變化尚不明確。因此,刺激迷走神經(jīng)對于膿毒性腦病及其相關(guān)炎癥的臨床治療可能具有很高的潛力(圖1)。

4 神經(jīng)遞質(zhì)研究方法的展望

已有研究表明,功能性核磁共振成像(functional magnetic resonance imaging,fMRI)等無創(chuàng)性方法可以被用于檢測活體組織(嚙齒動(dòng)物及人類等)的腦功能障礙。在膿毒癥的小鼠模型中,人們使用高分辨率的fMRI可觀察到海馬區(qū)及大腦皮層等受損區(qū)域發(fā)生的血管源性水腫[41]。然而,當(dāng)fMRI檢測到血流發(fā)生改變時(shí),會(huì)將這一現(xiàn)象視為腦功能的改變,這在腦神經(jīng)科學(xué)研究中是存在一定局限性的。為了加強(qiáng)這些薄弱的環(huán)節(jié),出現(xiàn)了一種新的納米技術(shù)——單分子量子點(diǎn)成像,該技術(shù)可為腦病的研究提供更精確的、特異性更強(qiáng)的臨床診斷及病理組織標(biāo)本檢測。

量子點(diǎn)(quantum dots,QDs)是一種納米尺寸的溶液半導(dǎo)體納米晶體(直徑2～10 nm)。半導(dǎo)體量子點(diǎn)是一種熒光量子點(diǎn),是在收到光激發(fā)或加上電壓后產(chǎn)生強(qiáng)熒光發(fā)射的納米材料。使用QDs的免疫組織化學(xué)具有寬激發(fā)光譜、窄發(fā)射熒光光譜、高強(qiáng)度、長壽命和抗光漂白等特點(diǎn)[42]。雖然正常的QDs是親水性的,但可以將其親水性特質(zhì)進(jìn)行改變以適用于活體研究。Jin等[43]研究出了由谷胱甘肽包被的水溶性的QDs,并且成功在小鼠淋巴結(jié)中檢測到QDs的信號(hào)。此外,QDs還可用于追蹤大腦中信號(hào)分子的表達(dá),相關(guān)研究在腦中檢測到經(jīng)腹腔注射的QDs[44～45]。因此,QDs是一種有潛力的、可以用來跟蹤與膿毒癥相關(guān)的分子的納米材料。

近紅外光是介于可見區(qū)和中紅外區(qū)之間的電磁波,其波長為800～2 500 nm。由于近紅外范圍內(nèi)的光線可以穿過顱骨到達(dá)大腦表面,并與腦電圖記錄的人快速事件相關(guān)反應(yīng)相吻合[46],因此,近紅外光譜成像技術(shù)(near-infrared spectroscopy,NIRS)已被用于追蹤腦血流動(dòng)力學(xué)[47]及人腦活動(dòng)[48]的研究。目前,QDs生物熒光探針已經(jīng)成功用來標(biāo)記生物體系的不同成分,如組織、細(xì)胞、生物大分子以及動(dòng)物活體成像等[49～50]。此外,QDs還可應(yīng)用于分子病理水平的神經(jīng)外科手術(shù)[51]和腦瘤手術(shù)[52]。應(yīng)用QD1100結(jié)合近紅外熒光成像技術(shù)可檢測出膿毒癥小鼠腦血管中血栓的形成[9]。因此,如果用QDs標(biāo)記的腦組織成功發(fā)射出近紅外區(qū)域的光,則可以在未來的研究中更加高效地追蹤膿毒性腦病相關(guān)的分子。另外,可利用QDs標(biāo)記膿毒癥大腦中的神經(jīng)遞質(zhì),研究神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的信息傳遞機(jī)制及調(diào)節(jié)神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)過程。但是隨著研究的不斷深入與擴(kuò)展,QDs的毒性問題逐漸顯露出來,將來能否用于人體研究仍然是一直爭論的問題。盡管如此,量子點(diǎn)知識(shí)的積累對以后低毒性、無鎘量子點(diǎn)的新材料合成及其應(yīng)用的發(fā)展可能會(huì)提供很多思路[53～57]。

圖1 迷走神經(jīng)刺激膽堿能抗炎通路在膿毒癥中的抗炎癥損傷作用及其機(jī)制Fig.1 The effect and mechanism of vagus nerve stimulation prevents sepsis-induced inflammation and injury via cholinergic anti-inflammatory pathway

5 小結(jié)

膿毒性腦病與多種炎癥因子受體、白介素家族、Toll樣受體、腫瘤壞死因子及高遷移率族蛋白等化學(xué)物質(zhì)有關(guān)。由于這些炎癥因子可在全身引起炎癥反應(yīng),并在破壞血腦屏障后影響腦的功能,因此會(huì)引起血管源性水腫、突觸傳遞及突觸可塑性異常等神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的病癥。雖然膿毒癥的分子機(jī)制已經(jīng)漸漸被人們了解,但臨床上的膿毒性腦病患者的治療還僅局限于對癥治療。這可能是由于目前還不能在空間和時(shí)間上精確反映膿毒癥發(fā)病過程中各器官功能分子水平。綜上所述,在未來的膿毒性腦病治療中,可能出現(xiàn)以下兩種可能:第一,提供一種具有無毒、高穩(wěn)定性的既可作為磁共振成像的造影劑又可用于熒光標(biāo)記檢測的量子點(diǎn)材料。比如:采用結(jié)合有優(yōu)良的近紅外熒光和磁共振成像技術(shù)的超小型QDs,對細(xì)胞及分子進(jìn)行高分辨率雙模式有效標(biāo)記,可實(shí)現(xiàn)高靈敏性的活體實(shí)時(shí)成像,從而追蹤到膿毒癥動(dòng)物模型體內(nèi)相關(guān)細(xì)胞及分子的動(dòng)態(tài)行為[9,58];第二,為了緩解癥狀,可采用無創(chuàng)的方法刺激迷走神經(jīng)。由于刺激迷走神經(jīng)可以激活乙酰膽堿受體,從而降低炎癥因子的過量釋放,因此可以此來抑制膿毒癥引起的細(xì)胞凋亡及組織壞死。總的來講,運(yùn)用神經(jīng)化學(xué)機(jī)制來研究膿毒性腦病的病理生理,有助于從本質(zhì)上掌握其病理機(jī)制。