2型糖尿病小鼠模型構(gòu)建的研究進(jìn)展

簡(jiǎn) 磊,符策崗,揭 勇

(1.三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院內(nèi)分泌科,中國湖北宜昌443000;2.上海市第六人民醫(yī)院-海口骨科與糖尿病醫(yī)院骨科,中國海南?？?70000;3.三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院,中國湖北宜昌443000)

糖尿病是影響人類健康的主要代謝性疾病之一。一項(xiàng)全球性研究表明,在20歲以上的成人中,身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)≥30 kg/m2的人數(shù)大約占35%。他們均被定為肥胖,這一類人群不僅容易患2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM),而且還高發(fā)不孕不育、高血壓以及骨骼方面疾病等[1]。在中國,隨著人口老齡化與生活方式的改變,糖尿病從一種少見病逐漸演變成一種流行病,在1980年到2013年期間,患病率從0.67%飆升至10.4%。根據(jù)病因?qū)W證據(jù),糖尿病可分為4大類,即1型糖尿病、2型糖尿病、特殊類型糖尿病和妊娠期糖尿病。臨床上絕大多數(shù)的糖尿病患者都屬于T2DM,此類疾病一旦確診,往往面臨余生幾十年的不斷用藥,折磨著全球10%的成年人(其中30%的人與遺傳有關(guān))[1]。T2DM的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,其顯著的病理生理學(xué)特征為:1)胰島素調(diào)控葡萄糖代謝的能力下降(胰島素抵抗);2)胰島β細(xì)胞功能缺陷所導(dǎo)致的胰島素分泌減少(或相對(duì)減少)。T2DM的治療一開始多依賴于口服藥物,口服藥的治療機(jī)制圍繞以下幾個(gè)方面:刺激胰腺分泌胰島素、增加胰島素的敏感性、減少胃腸道對(duì)糖分的吸收、抑制糖異生、抑制胰高血糖素分泌、抑制葡萄糖重吸收等等。遺憾的是,這些藥物最終都不能讓機(jī)體產(chǎn)生足夠的內(nèi)源性胰島素,反而隨著時(shí)間的推移,胰島細(xì)胞分泌胰島素的功能逐漸衰竭,從而不得不開始通過注射人工胰島素來補(bǔ)給身體的需求。T2DM病程長(zhǎng)、并發(fā)癥多和終身服藥給患者和患者家屬都帶來了巨大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量。因此,進(jìn)一步研究T2DM的病理機(jī)制以從源頭上降低發(fā)病率,或者研發(fā)新藥物以減少患者的用藥成本及用藥頻率,又或者發(fā)現(xiàn)新的治療方式以攻克此病變得刻不容緩。

就目前研究而言,T2DM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:1)涉及多基因性病變;2)在一定的環(huán)境下發(fā)病率將有所提高;3)涉及許多參與糖代謝調(diào)節(jié)的細(xì)胞、組織和器官(肌肉、肝臟、脂肪、胰腺等)。完全闡明T2DM的病因及發(fā)病機(jī)制是極具挑戰(zhàn)性的,這需要全面地了解基因和環(huán)境相互作用對(duì)細(xì)胞、組織和器官功能的影響。眾所周知,醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)不能開始于人體,早期應(yīng)在特定的動(dòng)物模型上開展,且這些動(dòng)物的基因需要與人類具備一定的相似性。被用于研究的動(dòng)物模型,承載著人們對(duì)攻克T2DM的所有設(shè)想,這些動(dòng)物模型不僅要能很好地模擬人類疾病,而且對(duì)藥物的反應(yīng)也需要與人類相似。小鼠因?yàn)槠浠蚝捅硇湍芎芎玫啬M人類疾病且實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較低而被廣泛使用,目前已開發(fā)出的2型糖尿病小鼠模型種類繁多,包括:自發(fā)突變性模型、熱量過量性模型、外科和化學(xué)誘導(dǎo)性模型、常用轉(zhuǎn)基因小鼠模型、專門用于研究環(huán)境對(duì)基因影響性的模型、CRISPRCas9構(gòu)建模型以及特定的糖尿病腎病模型。本文主要就2型糖尿病現(xiàn)有的小鼠模型及其構(gòu)建的方式給予簡(jiǎn)要的綜述。

1 自發(fā)突變性小鼠模型

在通過調(diào)控條件或基因而獲得特異性T2DM動(dòng)物模型這一方式普及之前,大量的研究依賴于選擇性育種,即自發(fā)突變性動(dòng)物模型。盡管構(gòu)建動(dòng)物模型的方式和技術(shù)層出不窮,但許多自發(fā)突變性動(dòng)物模型至今仍在使用,主要原因在于它們具有良好的特異性,傾向于產(chǎn)生嚴(yán)重的可重復(fù)的糖代謝缺陷模型,更加符合生物學(xué)性狀,理論上也是很理想的動(dòng)物模型,可以更好地反映T2DM的復(fù)雜本質(zhì)。

db/db小鼠模型是一類常見的自發(fā)性糖尿病小鼠模型,其特性是,位于4號(hào)染色體上的瘦素蛋白受體(leptin receptor,Lepr)基因發(fā)生突變(Gly取代Thr),從而導(dǎo)致Lepr沉默和高瘦素血癥[2]。但是這類小鼠很大程度上都伴隨:1)高度不孕;2)不同性別小鼠脂肪組織中類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)存在差異,最終導(dǎo)致糖尿病嚴(yán)重性存在差異;3)基于代償系統(tǒng)而維持正常代謝的可能[3～4]。

TH(TallyHo/JngJ)小鼠是一種近代雜交的泰勒源性小鼠,它自發(fā)產(chǎn)生高血糖和高胰島素血癥,但無低血磷血癥,也無Lepr缺陷[5～6]。TH小鼠的這些遺傳特征都來源于19號(hào)染色體上的一個(gè)隱性遺傳基因Tannidd1(Tallyho相關(guān)非胰島素依賴型糖尿病)與一系列位于其他染色體上的Tallyho相關(guān)位點(diǎn)(包括 Tanidd2、Tanidd3、Tabw2 和 Tafat)之間的相互作用[5]。TH小鼠是典型的多基因病變性T2DM小鼠模型,伴隨中度肥胖并胰島素抵擋,表現(xiàn)為高血糖、高胰島素血癥、高脂血癥和胰島β細(xì)胞增多[5～6]。因此,TH小鼠與人類肥胖相關(guān)T2DM有許多相似之處,但是需要注意的是,只有雄性小鼠充分表現(xiàn)出高血糖及糖耐量受損,雌性小鼠并沒有這樣的表現(xiàn)。

KK/Ta小鼠也是一種良好的T2DM模型,來源于日本小鼠近親交配。雄性KK/Ta小鼠自發(fā)地表現(xiàn)出一些與T2DM相似的癥狀,比如:高血糖癥、糖耐量受損、胰島素血癥、輕度肥胖和微量白蛋白尿(糖尿病腎病表現(xiàn))等,但雌性在這方面的表現(xiàn)相對(duì)較輕[7]。由于KK/Ta小鼠的表型沒有顯著特征,因此有研究者將黃色肥胖基因(Ay等位基因)轉(zhuǎn)移到KK/Ta小鼠,制備出新型Kish-Ay小鼠。KK-Ay小鼠表現(xiàn)出明顯的肥胖和高血糖,而且糖化血紅蛋白和白蛋白尿也明顯升高[8]。KK-Ay小鼠品系自1969年被成功建立以來,就被廣泛用于T2DM 的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚8～13]。

1949年,Jackson等發(fā)現(xiàn)了ob/ob小鼠。ob/ob小鼠來源于家鼠(Mus musculus)的偶然突變,且這個(gè)突變最終轉(zhuǎn)移到近交C57BL/6J小鼠中。突變后的小鼠在2～14周齡內(nèi)迅速增長(zhǎng),體重比野生型(C57BL/6J)高3倍左右[14]。經(jīng)過克隆并測(cè)序,人們發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠6號(hào)染色體上的ob(瘦素基因)發(fā)生突變,使Arg的密碼子被一個(gè)終止密碼子取代,從而導(dǎo)致無法轉(zhuǎn)錄正常的功能蛋白質(zhì)[15]。因此,突變小鼠表現(xiàn)出低胰蛋白酶、食欲過盛、肥胖、胰島素抵抗、高胰島素血癥、14～16周后會(huì)消退的高血糖、高密度脂蛋白升高和傷口愈合延遲等癥狀[14]。ob/ob小鼠可能是極為罕見的單基因突變型T2DM模型,目前常用于瘦素相關(guān)的研究。

2 熱量過量性小鼠模型

高脂飲食(high-fat diet,HFD)小鼠是目前最受歡迎的T2DM動(dòng)物模型之一,主要原因在于其很容易構(gòu)建。此模型建立在HFD喂食的基礎(chǔ)上,通常是使用含有5%～60%脂肪(豬油)的食物持續(xù)喂食小鼠1～20周,喂食長(zhǎng)短取決于研究所需模型病變的嚴(yán)重程度[16]。一般情況下,在60%的HFD喂食1周后,小鼠表現(xiàn)出葡萄糖耐量受損和胰島素分泌增加[1],2～4周后體重明顯增加,8～12周時(shí)口服/靜脈/腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和葡萄糖刺激胰島素釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將出現(xiàn)明顯變化,體重將在16～20周達(dá)到最大,最終體重通常比野生型重20%～30%[1,16]。這類小鼠模型通常表現(xiàn)為肥胖(包括脂肪細(xì)胞增生和腸系膜脂肪沉積)、高血壓、高血糖和高胰島素血癥(空腹胰島素水平升高和胰島素抵抗)。因?yàn)镠FD小鼠能很好地模擬人類T2DM的進(jìn)展,并表現(xiàn)出胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞增多及β細(xì)胞功能破壞等特征,從而被人們所青睞。

值得注意的是,不同小鼠如C57BL/6J、129×1、DBA/2和FVB/N對(duì)HFD喂養(yǎng)的反應(yīng)存在差異[17]。而且,即使是同種小鼠(如C57BL/6J),其對(duì)HFD喂養(yǎng)的反應(yīng)(“低”和“高”)也存在一定異質(zhì)性,在表型上也有一定差異[18],這就意味著應(yīng)該密切監(jiān)測(cè)食物攝入量和體重的變化。除此之外,性別差異也是存在的,比如:C57BL/6雌性小鼠普遍對(duì)葡萄糖耐受性低、全身炎癥反應(yīng)和胰島素水平偏向正常且胰島肥大[19]。

3 外科和化學(xué)誘導(dǎo)性小鼠模型

此類模型主要通過外科或化學(xué)方式(包括細(xì)胞特異性毒素)去除涉及能量平衡調(diào)節(jié)的系統(tǒng),從而誘導(dǎo)肥胖小鼠模型。本文集中討論物理和/或化學(xué)方式在脂肪組織和胰腺方向的研究。

人類功能性棕色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)存在于頸部鎖骨上,由于其活性與肥胖和代謝綜合征指數(shù)呈負(fù)相關(guān),因此BAT常用于與人類肥胖和糖代謝紊亂相關(guān)模型的建立[20]。研究發(fā)現(xiàn),通過誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞特異性表達(dá)白喉毒素消除小鼠的BAT,可引起肥胖和食欲過旺,表現(xiàn)為缺乏解偶聯(lián)蛋白-1(uncoupling proteins,UCP-1)驅(qū)動(dòng)的熱能耗散[21]。此外,切除BAT被證實(shí)可用于構(gòu)建胰島素抵抗和T2DM小鼠模型[21],此類模型具有以下特征:食欲旺盛、高胰島素血癥和能量消耗增加[22]。

胰腺是通過β、α和δ細(xì)胞分泌胰島素、胰高血糖素和生長(zhǎng)抑素發(fā)揮調(diào)節(jié)能量平衡的作用。其中胰腺β細(xì)胞一直是研究的熱點(diǎn),β細(xì)胞功能喪失與T2DM的發(fā)生和發(fā)展(在糖尿病小鼠研究的條件下)密切相關(guān)[23]。在Banting和Best首次發(fā)現(xiàn)β細(xì)胞分泌胰島素后的幾十年里,針對(duì)β細(xì)胞功能的研究層出不窮。Lenzen[24]研究發(fā)現(xiàn),四氧嘧啶和鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)能促進(jìn)β細(xì)胞壞死,并誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生。近期有研究顯示,四氧嘧啶和STZ通過破壞β細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glucose transporter 2,GLUT2)來影響糖代謝。而且人們還發(fā)現(xiàn),GLUT2不僅存在于胰腺內(nèi),在腎臟和肝臟中也有表達(dá),因此四氧嘧啶和STZ也會(huì)在肝腎中發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[25]。四氧嘧啶是葡萄糖激酶(glucokinase,GK)的抑制劑,誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧,從而導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙和死亡[24]。STZ的甲基亞硝基脲部分是其發(fā)揮毒性作用的關(guān)鍵,可以影響蛋白質(zhì)修飾、基因組和破壞線粒體DNA,并最終導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙和死亡[24]。β細(xì)胞的功能被四氧嘧啶和STZ破壞后,將引起葡萄糖代謝的紊亂。值得一提的是,STZ比四氧嘧啶更適用于嚙齒動(dòng)物的糖尿病模型構(gòu)建,主要原因在于它是一種相對(duì)穩(wěn)定的化學(xué)物質(zhì),可確保小鼠模型的穩(wěn)定構(gòu)建。

相關(guān)追蹤研究分析發(fā)現(xiàn),胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞與BAT類似,也能被細(xì)胞特異性表達(dá)的白喉毒素所破壞[26]。此外,也有研究嘗試通過外科手術(shù)方法在胰島區(qū)注入腺體相關(guān)病毒(adeno-associated viruses,AAVs),以破壞胰島功能而達(dá)到構(gòu)建T2DM小鼠模型的目的。但此法對(duì)造模者技術(shù)的要求十分苛刻,否則很容易誤將AAVs注射到腸系膜動(dòng)脈或胰管內(nèi)[27]。

4 轉(zhuǎn)基因小鼠模型

β細(xì)胞的代償性增多是T2DM的特點(diǎn)之一,其另一特點(diǎn)是肌肉、肝臟和脂肪組織對(duì)胰島素抵抗,這兩者之間具有密切的內(nèi)在聯(lián)系。在T2DM早期,為了在功能上補(bǔ)償胰島素抵抗,機(jī)體β細(xì)胞出現(xiàn)代償性的增多[23,28]。隨著病情的發(fā)展,β細(xì)胞出現(xiàn)衰竭,隨即血糖水平升高,除此之外,α細(xì)胞持續(xù)分泌糖原(分解糖原/胰高血糖素分泌)也進(jìn)一步加劇了血糖的失調(diào)[29]。目前對(duì)生長(zhǎng)抑素分泌細(xì)胞δ細(xì)胞知之甚少,有研究推斷它們可能以旁分泌方式抑制胰島素和胰高血糖素釋放[30]。在糖尿病發(fā)生發(fā)展的過程中,胰島素抵抗、α和β細(xì)胞相互作用的機(jī)制目前尚不完全了解,這也是治療該疾病的主要障礙?，F(xiàn)階段,臨床上針對(duì)糖尿病的治療如果想有所突破,最大的障礙在于攻克β細(xì)胞分泌胰島素或β細(xì)胞再生的難題。其中,可用于研究胰島細(xì)胞功能的T2DM小鼠模型是關(guān)鍵部分。

4.1 β細(xì)胞特異性靶向糖尿病小鼠模型

早期人們通過大鼠胰島素啟動(dòng)子Cre(rat insulin-2 promoter-Cre,Rip-Cre),也被稱為Ins2基因,調(diào)節(jié)大鼠胰腺β細(xì)胞對(duì)胰島素的分泌,從而調(diào)節(jié)葡萄糖代謝[31～32]。根據(jù)所使用的Rip-Cre轉(zhuǎn)基因技術(shù)的精確性,β細(xì)胞的重組效率可達(dá)80%～98%。但在研究過程中人們發(fā)現(xiàn),除了胰腺以外,腦組織中也會(huì)發(fā)生重組(如下丘腦),這對(duì)實(shí)驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生額外的影響[31～32]。有意思的是,胰腺和十二指腸源性胰島素啟動(dòng)子1(Pdx1)在與β細(xì)胞重組時(shí),不會(huì)與大腦細(xì)胞產(chǎn)生額外的重組,這似乎更具有優(yōu)勢(shì)[31～32]。遺憾的是,無論是 Rip-Cre還是 Pdx1-Cre技術(shù),在用于那些主要表達(dá)Ins1而不是Ins2的動(dòng)物時(shí)受到了限制。Ins1 CreERT(MIP-CreERT)也是人們研究的熱點(diǎn)之一,在Ins1 CreERT轉(zhuǎn)基因動(dòng)物大腦內(nèi)也未檢測(cè)到額外的重組[32]。有研究報(bào)道,Ins1-Cre轉(zhuǎn)入C57BL/6J小鼠后,能促進(jìn)催乳素受體自分泌,并刺激β細(xì)胞增殖[33]。需要注意的是,在選擇Ins1-Cre用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí),必須確保該動(dòng)物具有內(nèi)源性Ins1基因,因?yàn)镮ns1-Cre的表達(dá)依賴于內(nèi)源性Ins1基因的Cre起始密碼子[34]。此外,還應(yīng)當(dāng)注意,在此法的刺激下胰島素表達(dá)增多,但當(dāng)胰島素處于高濃度時(shí),又會(huì)反射性地引起β細(xì)胞發(fā)育不全[1]?？偟膩碇v,目前一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是通過相對(duì)較新的方式構(gòu)建的,仍然需要更深入研究以排除其他干擾存在的可能。

4.2 α細(xì)胞特異性靶向糖尿病小鼠模型

與上述不同,針對(duì)α細(xì)胞的胰高血糖素啟動(dòng)子(glucagon promoter-driven Cre,Glu-Cre)早在10年前就已經(jīng)開始用于構(gòu)建T2DM小鼠模型,其機(jī)制是通過將含有胰高血糖素(glucagon,Gcg)啟動(dòng)子的短(1.6 kb)啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)入C57BL/6J小鼠從而提高胰高血糖素表達(dá)[1]。雖然研究的早期重組效率很高,但是隨著時(shí)間的推移,重組率從開始的100%下降到40%,這可能與實(shí)驗(yàn)者、實(shí)驗(yàn)對(duì)象以及檢測(cè)的手段都有關(guān)系[35]。人們?cè)贑57BL/6J小鼠模型中發(fā)現(xiàn),通過iCre上調(diào)胰高血糖素基因(glucagon-iCre,Glu-iCre)表達(dá)時(shí),不僅α細(xì)胞中Cre的表達(dá)增高,而且70%的腸內(nèi)分泌性L細(xì)胞的表達(dá)也增高,以此上調(diào)血糖水平[36～37]。近期有研究使用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù),在不破壞胰高血糖素表達(dá)的前提下,將CreER插入到內(nèi)源性Gcg基因中,以此方式構(gòu)建的小鼠模型所產(chǎn)生的胰高血糖素CreER顯示是正常表型,且在成年C57BL/6J小鼠α細(xì)胞(～95%)中顯示出良好的重組效率,但是僅在33%的L細(xì)胞中檢測(cè)到Cre的表達(dá)[35],因此該法與Glu-iCre動(dòng)物模型相比還是略顯不足[36]。

4.3 其他特異性靶向糖尿病小鼠模型

構(gòu)建轉(zhuǎn)基因T2DM小鼠模型,除了針對(duì)分泌激素的細(xì)胞本身外,還有激素的受體和激素在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑等靶向。胰島素發(fā)揮作用必須依賴于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助,其中GLUT2存在于肝、腎、β細(xì)胞和小腸,而GLUT4存在于肌肉、脂肪和心肌細(xì)胞。人們通過Cre/loxP DNA結(jié)合技術(shù)降低GLUT4的分泌或敲除GLUT2基因都可顯著地引起胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生[38～39]。此外,胰島素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)蛋白調(diào)節(jié)胰島素的自我平衡、細(xì)胞的成長(zhǎng)和存活,通過選擇性敲除IRS基因也能引起小鼠胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生[40]。Abel等[38]證實(shí)這一類動(dòng)物模型對(duì)于開展正常胰島功能下的胰島素抵抗和胰島素受體相關(guān)的研究有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),但需要注意的是,此法所構(gòu)建動(dòng)物模型的病情嚴(yán)重程度常偏低。

5 用于研究環(huán)境對(duì)基因影響性的T2DM小鼠模型

T2DM這類復(fù)雜的代謝性疾病通常是由基因-環(huán)境(gene-by-environment,GxE)相互作用引起的。雖然使用全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)和基因工程小鼠模型可以鑒定代謝疾病發(fā)展的遺傳危險(xiǎn)因素,但由于無法控制環(huán)境因素(至少在人類研究中),以及近交系小鼠的單一遺傳背景等因素,GxE難以被完全闡明。在小鼠模型構(gòu)建上,研究者常常通過重組近交系遺傳參考群體(genetic reference population,GRP),也就是常用的近親交配的手段,達(dá)到有效減少模型之間差異的目的[41]。當(dāng)研究某個(gè)基因時(shí),首先將單個(gè)染色體從供體轉(zhuǎn)入宿主(如C57BL/6J小鼠)內(nèi),這類實(shí)驗(yàn)宿主之間的差異性必須縮小,且宿主的生活環(huán)境必須精心的控制(包括飲食、溫度和光照等),這樣的條件下才有利于鑒定GxE。此外,GRP為人們提供了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái),以理解基因組的某些區(qū)域如何影響表型,如何與環(huán)境相互作用,甚至可以通過與親本序列數(shù)據(jù)反向GWAS比較來確定與人類代謝疾病有關(guān)的潛在基因[42]。例如:140種BXD-GRP代謝特征(葡萄糖耐受性、身體成分、血壓等)的臨床表型被證明具有高度可調(diào)節(jié)性和遺傳性,并且可以與已知的基因變體相關(guān)聯(lián),為構(gòu)建穩(wěn)定T2DM模型打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[42]。

6 CRISPR-Cas9:T2DM模型的未來

近年來CRISPR-Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)了針對(duì)單個(gè)核苷酸的編輯(在內(nèi)源基因組中),并且已被運(yùn)用到那些能被人類GWAS所識(shí)別的基因中,甚至可以用于構(gòu)建突變性小鼠模型。人們?cè)诜逝只騀TO的研究中發(fā)現(xiàn),rs1421085中T變C的單核苷酸變化可以將BAT轉(zhuǎn)換為白色脂肪組織,從而減少線粒體產(chǎn)熱并增加脂質(zhì)儲(chǔ)存,其效果類似于破壞BAT[43]。雖然嚙齒類動(dòng)物可以通過此方法構(gòu)建模型,特別是在遺傳型難以控制的組織(例如胰腺)中,但應(yīng)該注意的是,那些被GWAS識(shí)別的人類基因組序列并不是全部都存在于小鼠中,這限制了該技術(shù)的使用范圍[44]。此外,雖然CRISPR-Cas9可用于沉默Cre[35],但同源重組發(fā)生率不高。因此在構(gòu)建小鼠模型方面,對(duì)比傳統(tǒng)的方法其優(yōu)勢(shì)并不明顯。但是就前景而言,CRISPR-Cas9技術(shù)如果用于靈長(zhǎng)類動(dòng)物,對(duì)比其他方式其模擬性更強(qiáng),當(dāng)然這也需要在進(jìn)一步提高重組率的前提下才能實(shí)現(xiàn)。

7 糖尿病腎病模型

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)在糖尿病合并癥中的發(fā)病率居首位,也是糖尿病患者最重要的致死病因之一。DN的發(fā)生與多種因素的綜合作用有關(guān),主要包括:血糖控制不佳、生化改變、遺傳因素、攝入過量的蛋白質(zhì)、高血壓、生長(zhǎng)激素和胰高糖素分泌過多、脂肪代謝異常、血小板功能亢進(jìn)、腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常、結(jié)構(gòu)異常及吸煙等等。糖尿病患者一旦發(fā)生腎臟損害,并出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿,則腎功能很可能持續(xù)性減退直至終末期腎功能衰竭,至今尚無有效措施阻止其發(fā)生與發(fā)展。DN治療上一直沒有突破性的進(jìn)展,其中的障礙之一就是缺乏良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[45]。良好的DN動(dòng)物模型不僅需要滿足糖尿病模型的標(biāo)準(zhǔn),還要具備高蛋白尿、腎小球硬化和高血壓等特征。

降低糖尿病小鼠模型中的內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),能有效增強(qiáng)腎損傷,并顯著地引起高血壓和內(nèi)皮功能障礙。人們?cè)谔悄虿∧Ｐ蚫b/db C57BL/KsJ的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種具有eNOS完全遺傳缺陷的小鼠系,這種新型eNOS-/-db/db C57BL/KsJ小鼠模型表現(xiàn)出的高血壓、尿白蛋白較對(duì)照組高30倍以上,同時(shí)呈現(xiàn)廣泛的腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張和結(jié)節(jié)、腎小球膜炎、腎小球基膜增厚、小動(dòng)脈透明變性和腎小管間質(zhì)纖維化等與人類DN相仿的癥狀[46～47]。值得一提的是,eNOS-/-db/db小鼠模型在26周齡時(shí)腎小球?yàn)V過率降低50%,并且隨著蛋白尿的減少開始對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme,ACE)類藥物耐藥,具備與人類DN相仿的特征性表現(xiàn)[48]。

BTBR ob/ob小鼠是另一種DN小鼠模型,由具有胰島素抵抗的黑色/棕色短尾(BTBR)小鼠品系與ob/ob瘦素突變小鼠雜交得來,表現(xiàn)出明顯的高血糖癥、尿白蛋白增加、廣泛的腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張、局灶性結(jié)節(jié)性腎小球硬化、輕度腎小球基膜增厚和小動(dòng)脈透明變性等與人類嚴(yán)重DN相關(guān)的癥狀[49～51]。但是,人們?cè)谑褂肂TBR ob/ob模型時(shí)卻發(fā)現(xiàn),蛋白尿和腎臟損傷并沒有與上述研究介紹的一樣那么顯著,這可能是環(huán)境因素對(duì)這些小鼠模型的DN表型產(chǎn)生了影響[52～53]。除了上述兩種DN小鼠模型外,還有ob/ob FVB/NJ和ob/ob C57BL/KsJ等模型,但相比之下還是eNOS-/-db/db C57BL/KsJ和BTBR ob/ob小鼠模型與人類DN 更相仿[47]。

表1 目前可用的T2DM小鼠模型及其優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and disadvantages of currently available T2DM mouse models

8 小結(jié)

小鼠模型在T2DM的研究中具有極其重要的意義。文中關(guān)于目前可用的主要T2DM小鼠模型的總結(jié)見表1。從表中可知,沒有完美的動(dòng)物模型存在,且實(shí)驗(yàn)本身進(jìn)一步的驗(yàn)證總是依靠其他實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?例如細(xì)胞系、人體組織、臨床數(shù)據(jù)等)來補(bǔ)充和確定。此外,從小鼠實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)也需要仔細(xì)考慮控制因素的問題。例如:飼喂HFD的動(dòng)物應(yīng)始終與飼喂標(biāo)準(zhǔn)食物的試驗(yàn)組進(jìn)行平行評(píng)估,以避免數(shù)據(jù)因反應(yīng)的異質(zhì)性而混淆。當(dāng)然,即使假設(shè)所有的動(dòng)物模型都不存在差異,其所生存的環(huán)境因素(光、溫度、噪音)的細(xì)微變化也會(huì)對(duì)代謝參數(shù)產(chǎn)生較大的影響。因此,在構(gòu)建糖尿病小鼠模型的時(shí)候,還應(yīng)該致力于更好地保持動(dòng)物模型生存環(huán)境的一致性。