大腹園蛛主壺腹腺蛛絲蛋白末端結(jié)構(gòu)域的克隆表達(dá)

賈秋品,溫 睿,李 雪,孟 清

(東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所,中國(guó)上海210620)

蜘蛛絲是具有極佳材料學(xué)性能的天然高分子材料,其延展性和強(qiáng)度可與已知合成材料相媲美,并且具有非常好的生物相容性和生物可降解性,在紡織、軍事軍工及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值[1～6]。由于蜘蛛同類相食的天性,不能通過養(yǎng)殖來獲取大規(guī)模的蛛絲纖維,因此研究者轉(zhuǎn)向通過基因工程的方法來獲取人造蛛絲纖維[7]。自20世紀(jì)90年代以來,研究者對(duì)于蜘蛛絲的研究逐步深入并取得了一系列突破性的成果,比如:已成功獲取多條蜘蛛絲的全基因編碼序列;對(duì)蜘蛛成絲過程中的腺體環(huán)境變化進(jìn)行了表征;對(duì)蜘蛛絲成絲機(jī)理提出了假設(shè)模型等[8～11],為蛛絲的仿生應(yīng)用奠定了重要的理論基礎(chǔ)。但是,人們?cè)讷@取人造蛛絲纖維的過程中仍面臨幾個(gè)瓶頸問題:1)蛛絲蛋白編碼序列的高度重復(fù),造成全長(zhǎng)基因獲取困難[12～15],不能為蛛絲仿生提供足夠的基因原材料,也為后續(xù)異源表達(dá)帶來壓力;2)蜘蛛絲成絲機(jī)理尚不明晰,目前認(rèn)可的成絲模型有“小球模型”[9]和“液晶態(tài)模型”[16],但兩者均未能完整解析成絲過程。這些問題是蛛絲仿生必備的理論基礎(chǔ),均需要進(jìn)一步的深入探索。

主壺腹腺蛛絲(major ampullate silk)包括在圓網(wǎng)中起支撐作用的輻射狀絲和作為蜘蛛生命繩索的牽引絲(dragline silk)。其中,牽引絲強(qiáng)度可達(dá)4 GPa,延展性高達(dá)35%,是蜘蛛絲研究中的熱點(diǎn)[17]。主壺腹腺蛛絲的組成蛋白質(zhì)為主壺腹腺蛛絲蛋白(major ampullate spidroin,MaSp),包括兩個(gè)組分MaSp1和MaSp2[17]?，F(xiàn)有研究表明,MaSp1和MaSp2在主壺腹腺蛛絲中的組成比例由蜘蛛的營(yíng)養(yǎng)狀況決定,并調(diào)控蛛絲的性能[18]。MaSp蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量可達(dá)250～350 kD[19]。目前已獲得的MaSp全長(zhǎng)編碼基因有:黑寡婦蜘蛛(Latrodectus hesperus)的MaSp1和MaSp2[15](兩序列相似性為64%)、橫紋金蛛(Argiope bruennichi)的MaSp2[20]以及摩鹿加云斑蛛(Cyrtophora moluccensis)的 MaSp1s[21]。這些全長(zhǎng)編碼序列的獲得為探索新蛛絲蛋白種類的結(jié)構(gòu)和功能提供了新的方向。

完整的MaSp蛋白可劃分為3個(gè)部分:末端結(jié)構(gòu)域 N-terminal domain(NT)、C-terminal domain(CT))和中間高度重復(fù)區(qū)repetitive domain(RP)。RP對(duì)蛛絲的材料學(xué)性能起決定性作用[3],MaSp1的重復(fù)區(qū)序列中含有大量小重復(fù)單元(GA)n、(GGX)n、(GX)n及(A)n(X可以是A、L、Q等),而MaSp2的重復(fù)區(qū)因Pro的存在,使其除上述重復(fù)單元之外,還有(GPGXX)n重復(fù)單元[17]。在MaSp中大量(A)n所形成的β-折疊結(jié)構(gòu)賦予了主壺腹腺蛛絲極高的強(qiáng)度[22]。越來越多的研究結(jié)果顯示,NT和CT在蛛絲蛋白成絲過程中扮演著極其重要的角色,其結(jié)構(gòu)功能解析是闡述成絲機(jī)理的關(guān)鍵步驟。2010年,Nature發(fā)表的兩篇文章分別報(bào)道了NT和CT在成絲過程中的作用,一篇研究南非盜蛛(Euprosthenops australis)MaSp NT的3D結(jié)構(gòu)和功能,顯示NT以pH依賴的方式,通過三步二聚化機(jī)制,保證MaSp的快速成絲[23];另一篇聚焦十字園蛛(Araneus diadematus)MaSp CT的3D結(jié)構(gòu)和功能,研究表明CT以二聚體方式存在,調(diào)控MaSp的成絲品質(zhì)[24]。雖然不同蜘蛛種類的MaSp的NT和CT具有一定保守性,但仍存在一些差異,從而可能影響蛛絲纖維的性能,例如食用金絲蜘蛛(Nephila edulis)和E.australis的牽引絲相比,前者的彈性性能更好而后者具有更高強(qiáng)度[25～26]。因此,不同蜘蛛種屬的MaSp NT和CT的編碼基因獲取及結(jié)構(gòu)功能研究對(duì)生產(chǎn)獲得高性能人造蛛絲是十分重要的。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

本研究使用的大腹園蛛基因從蜘蛛體內(nèi)提取,蜘蛛采于上海東華大學(xué)松江校區(qū)園內(nèi),-80℃凍存蛛體?；蚪MDNA提取試劑、質(zhì)粒DNA提取試劑、PCR產(chǎn)物回收試劑、膠回收試劑、SDS-PAGE電泳試劑、DNA電泳試劑均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;Q5超保真DNA聚合酶購(gòu)于美國(guó)NEB公司;酶切和連接反應(yīng)相關(guān)試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))公司;Taq DNA聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;Ni-NTA親和純化柱填料購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司;DNA引物合成和基因測(cè)序均在上海睿迪生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2 克隆構(gòu)建

1.2.1 大腹圓蛛基因組DNA的提取

取凍存蜘蛛的胸部組織搗碎,參照改良的CTAB法[27]提取基因組DNA,將提取的核酸凍存以待PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2 A.v.NTMa1基因序列的獲取

通過對(duì)NCBI基因庫中的部分已知NT的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì),找到其中一段含有11個(gè)氨基酸的保守序列(MAFASSXAEIA,其中X為V或M),取其中7個(gè)氨基酸(FASSVAE)對(duì)應(yīng)的DNA序列設(shè)計(jì)5′方向引物 P5(引物序列見表1);根據(jù)NCBI已知MaSp的重復(fù)區(qū) RP序列(GenBank:JN857964.2)設(shè)計(jì)3′方向引物 P3。以提取的大腹圓蛛基因組為模板,P5和P3為引物,通過PCR反應(yīng)得到產(chǎn)物DNA1,回收并進(jìn)行基因測(cè)序,此段基因序列中含有部分NT和部分RP編碼基因序列。根據(jù)DNA1,設(shè)計(jì)3′方向的兩個(gè)同向引物R1(靠近N端末尾)和 R2(在P5和R1之間)。以基因組DNA為模板,R1為單引物,進(jìn)行PCR反應(yīng),得到包含全部NT編碼序列的單鏈ssDNA2,隨后回收產(chǎn)物并將其作為模板重新PCR,以獲得足夠的DNA產(chǎn)物;將ssDNA2進(jìn)行末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶處理,以dCTP為原料進(jìn)行polyC加尾處理,得到ssDNA2-CCCCCCC-3′;設(shè)計(jì)末端含polyG和其余隨機(jī)堿基序列(來自其他物種,不與蛛絲基因序列互補(bǔ))的5′方向引物 AL,以ssDNA2-CCCCCCC-3′為模板,以AL和R2為引物,進(jìn)行錨定PCR反應(yīng),得到DNA3,回收并進(jìn)行基因測(cè)序,此段基因序列中含有引物R2之前的NT編碼基因剩余DNA序列。將DNA1和DNA3基因序列進(jìn)行拼接,通過識(shí)別啟動(dòng)子密碼和開放閱讀框(open reading frame,ORF)的上游特征序列得到大腹圓蛛MaSp1 NT的完整基因序列A.v.NTMa1。

根據(jù)拼接得到的A.v.NTMa1基因序列設(shè)計(jì)5′和3′端引物PN5和PN3,以基因組DNA為模板,通過PCR反應(yīng)得到不含信號(hào)肽的A.v.NTMa1DNA片段,回收產(chǎn)物并進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切,得到含有兩個(gè)黏性末端的NT-bh基因片段。

1.2.3 A.v.CTMa1基因序列的獲取

依據(jù)NCBI上發(fā)表的大腹圓蛛MaSp1的CT序列(GenBank:AEV46833.2)設(shè)計(jì) 5′和 3′端引物PC5和PC3,通過PCR反應(yīng)得到含有完整A.v.CTMa1基因的DNA片段,回收產(chǎn)物并進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切,得到含有兩個(gè)黏性末端的CT-bh基因片段(引物序列參見表1)。

“懷舊”，一方面是兩岸聽眾的審美特征，而另一方面也反映出當(dāng)代華語流行樂壇存在的問題。如當(dāng)前各個(gè)經(jīng)紀(jì)公司在籌劃歌手個(gè)人演唱會(huì)時(shí)，都在打“懷舊”牌，列出該歌手多年來唱過的經(jīng)典曲目以增加演唱會(huì)的市場(chǎng)號(hào)召力，讓歌迷到現(xiàn)場(chǎng)“見證青春歲月”。[29]這一方面證明了這些流行歌手的影響力，另一個(gè)方面也顯示了整個(gè)流行樂壇一定程度上的青黃不接。[29]

1.2.4 A.v.NTMa1和A.v.CTMa1的表達(dá)克隆構(gòu)建

對(duì)改造后的pET-32a質(zhì)粒(Novagen)進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切,回收載體大片段,并與NT-bh和CT-bh分別在T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接反應(yīng),得到含有完整A.v.NTMa1和A.v.CTMa1基因序列的重組克隆質(zhì)粒,通過酶切和基因測(cè)序驗(yàn)證基因序列正確。

1.3 序列比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuc-core/)搜索已發(fā)布的不同蜘蛛種類的NT氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析;通過PSIPRED網(wǎng)站(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)對(duì)已獲得的A.v.NTMa1和A.v.CTMa1蛋白序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 重組蛋白的表達(dá)與純化

將含有正確基因序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21(DE3)表達(dá)宿主菌株(北京天根生化科技有限公司)。30℃200 r/min條件下,在含有70 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中將大腸桿菌培養(yǎng)至OD600為0.8～1.0,加入終濃度為0.3 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG),在20℃180 r/min條件下過夜培養(yǎng)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。4℃條件下6 000 r/min離心20 min收集菌體,20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)重懸,隨后使用高壓細(xì)胞破碎儀JN-3000(廣州聚能納米生物科技股份有限公司)破碎,將裂解物離心(6 000 r/min,20 min,4℃),收集上清。含有目的蛋白的上清液通過Ni-NTA柱(Qiagen公司,德國(guó))進(jìn)行親和層析純化。將蛋白質(zhì)溶液裝入鎳柱內(nèi),低溫孵育1 h后穿柱,使用3倍柱體積的洗滌緩沖液(含10 mmol/L咪唑的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液,pH 8.0)洗柱兩次,適量洗脫緩沖液(含300 mmol/L咪唑的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液,pH 8.0)洗脫柱上蛋白質(zhì),4℃過夜透析(20 mmol/L Tris-HCl緩沖液,pH 8.0),得到純化后的重組蛋白。

1.5 圓二色譜分析

將目的蛋白稀釋到pH 7.5的20 mmol/L磷酸緩沖液中,至終濃度為0.5 mg/mL左右。在25℃室溫條件下,通過CD光譜儀(Applied Photophysics Ltd.,英國(guó)),收集掃描波長(zhǎng)190～260 nm的光譜信號(hào)。具體參數(shù)設(shè)置:光程0.1 cm,掃描步長(zhǎng)0.5 nm,響應(yīng)時(shí)間1 s,帶寬1 nm。CD光譜取3次掃描的平均值。

2 結(jié)果

2.1 A.v.NTMa1和A.v.CTMa1序列獲取及序列分析

通過錨定和常規(guī)PCR的方法,依次得到DNA1、ssDNA2、DNA3(圖 1A),最后將 DNA1 和DNA3進(jìn)行拼接得到包含完整NT和部分重復(fù)區(qū)RP編碼基因序列在內(nèi)的片段。通過設(shè)計(jì)兩對(duì)特定上下游引物,并分別通過常規(guī)PCR擴(kuò)增的方法得到兩端含有BamHⅠ、HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)的A.v.NTMa1(圖 1A-d)和 A.v.CTMa1(圖 1B)片段,以用于后續(xù)表達(dá)克隆的構(gòu)建。

在A.v.NTMa1基因的獲取過程中,以基因組為模板和特異性下游引物進(jìn)行單引物擴(kuò)增獲取的目標(biāo)基因ssDNA2的量非常低,因此以該擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行兩輪常規(guī)PCR(圖1A-b),以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的富集。此外,根據(jù)拼接后序列設(shè)計(jì)特異性引物,進(jìn)行基因組PCR驗(yàn)證,保證了該拼接編碼序列的準(zhǔn)確性,翻譯后氨基酸序列如圖2所示。分析該序列的重復(fù)區(qū)RP序列可見,其中基本不含有GPGXX模塊,因此初步確定該序列屬于A.v.MaSp1。

為進(jìn)一步確定上述MaSp1序列的可靠性,將A.v.NTMa1(圖3中第一條序列)與已發(fā)表的13條MaSp NT的氨基酸序列(表2)進(jìn)行序列比對(duì)分析。結(jié)果表明:不同蜘蛛種屬間,MaSp NT序列相似性可達(dá)50%以上,具有較高的保守性;MaSp1 NT之間的保守性可達(dá)60%。同時(shí),對(duì)上述序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)A.v.NTMa1與其他已報(bào)道的MaSp NT具有較近的親緣關(guān)系(圖4)。由此可見,本次獲取的A.v.NTMa1編碼基因具有很高可靠性,適用于后續(xù)的研究。利用SignalP 4.1對(duì)A.v.NTMa1序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)該序列中存在信號(hào)肽序列(MTWTARLALSLLAVICS),因此在后續(xù)的克隆階段,將信號(hào)肽去除,得到A.v.NTMa1的氨基酸序列(圖2紅色序列)以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A.v.CTMa1基因翻譯后得到的氨基酸序列為GGQGAASSAAAASAAASRLSSPSAASRVSSAVSSLVSSGGPSSPAALSSTISNVVSQISASNPGLSGCDVLVQALLEIVSALVHILGSANIGQVNSSAAGQSASLVGQSVYQALS。

2.2 A.v.NTMa1和A.v.CTMa1的表達(dá)純化

分別將正確的A.v.NTMa1和A.v.CTMa1基因序列插入到pET-M質(zhì)粒載體中,該載體是改造過的pET-32a系列載體(含有用于后續(xù)親和純化的6×His標(biāo)簽)。隨后,在大腸桿菌中分別對(duì)兩種蛋白質(zhì)進(jìn)行外源表達(dá),利用鎳柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和純化,結(jié)果如圖5所示。其中CT為A.v.CTMa1蛋白(11.8 kD),NT為A.v.NTMa1蛋白(15.2 kD)。兩個(gè)重組蛋白的純度均遠(yuǎn)高于90%,產(chǎn)量分別為80 mg/L和60 mg/L。

圖1 A.v.NTMa1和A.v.CTMa1基因序列的PCR擴(kuò)增(A)A.v.NTMa1的PCR擴(kuò)增結(jié)果。DNA1:多條帶,其中包含部分NT和部分RP的編碼基因序列。泳道1～3:以基因組為模板的PCR產(chǎn)物。ssDNA2:1～3產(chǎn)物回收后重新擴(kuò)增的結(jié)果,單鏈DNA含有全部NT編碼基因序列。DNA3:含有部分NT編碼基因序列,530 bp。NT:A.v.NTMa1基因,425 bp;(B)A.v.CTMa1的PCR擴(kuò)增結(jié)果(CT:366 bp)。泳道M均為DNA ladder。Fig.1 The PCR amplification of A.v.NTMa1and A.v.CTMa1gene sequences(A)The PCR amplification of A.v.NTMa1.DNA1:The DNA sequences of the bands contain partial NT and a part of RP.Lanes 1～3:PCR products from genomic DNA.ssDNA2:The results re-amplified from the original lanes 1/2/3 products,whose singlestrained DNA contains the whole NT gene sequence.DNA3:The 530 bp-band has a part of NT gene sequence.NT:The 425 bpband A.v.NTMa1;(B)The PCR amplification of A.v.CTMa1(CT:366 bp).All the M lanes represent DNA ladder.

圖2 大腹園蛛MaSp1的部分氨基酸序列氨基酸總長(zhǎng)為584 aa。BN:14 aa,為N端之前的序列;NT:151 aa,為A.v.NTMa1序列(紅色),下劃線部分為信號(hào)肽(17 aa);RP:419 aa,為部分重復(fù)區(qū)序列。Fig.2 The partial amino acid sequence of the A.v.MaSp1The overall A.v.MaSp1 is 584 amino acids.BN:The first 14 aa in N-terminal domain;NT:151 aa including the 134 aa A.v.NTMa1(in red)and the 17 aa signal peptide(in indigo blue and underlined);RP:Partial repetitive domain(419 aa).

圖3 不同蜘蛛種屬M(fèi)aSp NT氨基酸序列的比對(duì)分析Fig.3 The sequence alignment of MaSp NT from different spider species

表2 已報(bào)道的MaSp NT序列Table 2 The reported MaSp NT sequences

圖4 不同種屬蜘蛛MaSp NT的種系發(fā)生樹Fig.4 The phylogenetic tree of MaSp NT from different spider species

2.3 A.v.MaSp1 NT和CT的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及CD色譜分析

利用PSIPRED網(wǎng)站對(duì)A.v.NTMa1和A.v.CTMa1的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示兩者均以α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)為主要構(gòu)象,可形成5個(gè)α-螺旋(圖6),這與已發(fā)表的MaSp NT和CT的結(jié)構(gòu)是一致的。利用CD光譜對(duì)兩者的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果如圖7所示,在25℃、pH 7.5條件下,A.v.NTMa1和A.v.CTMa1的CD曲線均在208 nm和222 nm附近有兩個(gè)負(fù)峰,表明兩者的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成均以α-螺旋為主要構(gòu)象,與PSIPRED網(wǎng)站的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符合。

圖5 純化的大腹園蛛MaSp1重組NT和CT蛋白的SDS-PAGE圖譜M:蛋白質(zhì)marker;NT:純化后的A.v.NTMa1蛋白;CT:純化后的A.v.CTMa1蛋白。Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified target proteinsM:Protein marker;NT:Purified A.v.NTMa1;CT:Purified A.v.CTMa1.

3 討論

圖6 A.v.NTMa1和A.v.CTMa1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 The secondary structure prediction of A.v.NTMa1and A.v.CTMa1

圖7 A.v.NTMa1和A.v.CTMa1的CD 圖譜Fig.7 The CD spectra of A.v.NTMa1and A.v.CTMa1

蛛絲蛋白的NT和CT結(jié)構(gòu)域在其成絲過程中扮演著重要的角色,對(duì)兩者結(jié)構(gòu)和功能的探索是闡述成絲機(jī)理的先決條件。目前僅有E.australis和絡(luò)新婦蛛(Nephila clavipes)MaSp NT的高級(jí)結(jié)構(gòu)被報(bào)道[23,26],相關(guān)結(jié)果表明MaSp NT單體的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含5個(gè)α-螺旋,且蛛絲蛋白在腺體內(nèi)以單體可溶狀態(tài)高濃度儲(chǔ)存。而對(duì)蜘蛛絲成絲過程的研究顯示,隨著pH逐漸降低和其他理化條件的改變,蛛絲蛋白的單體以同向平行的方式形成二聚體,并經(jīng)由保守氨基酸發(fā)生“三步”質(zhì)子化,最終形成穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu),幫助蛛絲蛋白快速成絲[28～29]。對(duì)于 MaSp CT,目前有 A.diadematus的MaSp1 CT被報(bào)道,研究表明MaSp1 CT依賴疏水作用力形成二聚體,以反向平行方式存在,調(diào)控MaSp的成絲過程,使絲纖維具有更為規(guī)則的結(jié)構(gòu)[24]。而對(duì)于A.v.NTMa1和A.v.CTMa1結(jié)構(gòu)與功能方面的研究卻非常少,這限制了人們對(duì)大腹園蛛MaSp成絲機(jī)理的探索和仿生應(yīng)用。

為解決這一問題,我們通過設(shè)計(jì)特定引物,使用錨定PCR和常規(guī)PCR反應(yīng)的方法成功獲取了大腹園蛛MaSp1的A.v.NTMa1和A.v.CTMa1的完整編碼基因。其中,在利用錨定PCR方法獲取A.v.NTMa1完整編碼基因時(shí),為了確認(rèn)A.v.NTMa1的準(zhǔn)確性,我們進(jìn)行了基因組PCR驗(yàn)證,保證了后續(xù)蛋白質(zhì)表達(dá)和結(jié)構(gòu)表征的準(zhǔn)確性;同時(shí),利用序列比對(duì)分析和進(jìn)化樹分析,確定了A.v.NTMa1基因序列的可靠性。A.v.NTMa1和A.v.CTMa1的CD圖譜表明,其二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α-螺旋為主,與已發(fā)表的MaSp的NT和CT的二級(jí)結(jié)構(gòu)保持一致。此外,在不同 pH(7.5、6.5、5.5)條件下,A.v.NTMa1和A.v.CTMa1的CD曲線并沒有檢測(cè)到明顯變化(圖片未展示),但是其高級(jí)結(jié)構(gòu)很可能發(fā)生改變,需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。本文對(duì)A.v.NTMa1和A.v.CTMa1的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步的探索,分析了其二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組分,可為后續(xù)A.v.NTMa1和A.v.CTMa1的結(jié)構(gòu)和功能探索提供一定的數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

通過序列比對(duì)分析可知,A.v.NTMa1與其他MaSp NT具有保守性,同樣包含一個(gè)W殘基,因此可通過檢測(cè)W熒光變化[30]分析A.v.NTMa1的二聚化機(jī)制,這是后續(xù)探索A.v.NTMa1結(jié)構(gòu)功能的有效途徑。然而與其他已知MaSp NT序列不同的是,A.v.NTMa1僅含有一個(gè)Cys殘基,由此Cys巰基形成的分子間二硫鍵對(duì)于A.v.NTMa1的二聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定或在成絲過程中可能具有一定的影響,需要進(jìn)一步研究。另外,若該二硫鍵僅用于輔助二聚化結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,則可將該Cys進(jìn)行熒光分子標(biāo)記,該Cys位于A.v.NTMa1的H2螺旋中,而H2屬于NT二聚體結(jié)構(gòu)的相互作用界面,因此可通過檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化,分析不同條件下A.v.NTMa1的二聚體結(jié)構(gòu)變化,探索A.v.NTMa1的二聚化機(jī)制或在成絲過程中所扮演的角色[29]。總的來說,A.v.NTMa1的二聚化機(jī)制需要更加深入的探索,以幫助闡述MaSp1的成絲機(jī)理。

已有文獻(xiàn)報(bào)道蛛絲蛋白的CT具有較高的序列保守性,即同源性高[31]。但研究顯示,不同種類蜘蛛的同種蛛絲蛋白的CT,雖具有較高的保守性和相似的3D結(jié)構(gòu),其功能卻有所區(qū)別。例如:金圓網(wǎng)蛛(Nephila antipodiana)的葡萄狀腺蛛絲蛋白(aciniform spidroin,AcSp)的CT對(duì)其重復(fù)區(qū)RP在成絲過程中的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變無明顯影響;而三帶金蛛(Argiope trifasciata)的AcSp CT則在成絲過程中對(duì)重復(fù)區(qū)RP的β-折疊的形成起到晶核作用,并可提高絲纖維的機(jī)械性能[32～33]。所以,對(duì) A.v.CTMa1的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行探索仍是必需的,也利于系統(tǒng)研究A.v.MaSp的成絲機(jī)理。另外,有研究表明,N.clavipes的MaSp具有熱敏感性,在低溫2℃或高溫65℃下可形成凝膠,并具有一定的可逆性[34]。據(jù)此,我們可以在后續(xù)的研究中對(duì)A.v.CTMa1的熱穩(wěn)定性和形成凝膠特性進(jìn)行探索,以拓寬其應(yīng)用。

綜上所述,本文通過錨定PCR成功獲取了大腹園蛛MaSp1 NT的編碼基因,為研究MaSp提供了基因素材,并成功進(jìn)行了外源表達(dá)純化,表達(dá)量可達(dá)60 mg/L;同時(shí)克隆表達(dá)了大腹園蛛的MaSp1 CT,其表達(dá)量可達(dá)80 mg/L。A.v.NTMa1和A.v.CTMa1的CD圖譜顯示,兩者的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主要組分。上述研究結(jié)果為大腹園蛛MaSp1 NT和CT的結(jié)構(gòu)及功能研究提供了基因素材和一定數(shù)據(jù)支持,也為大腹園蛛MaSp1的成絲機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。