白花蛇舌草提取物對(duì)卵巢癌模型大鼠的療效及對(duì)其血清性激素水平的影響*

常豐葛，張 珂，馬玉瑤，孫靈霞 ，葛倩倩

1.河南省許昌市人民醫(yī)院婦科(許昌 461000)；2.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(鄭州 450007)

卵巢癌位于婦科惡性腫瘤死亡率第1位，對(duì)女性的生命健康有著極大的威脅[1]。目前在卵巢癌的治療中，主要以手術(shù)治療和化療為主，但是隨著治療時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，更多的毒副作用也會(huì)慢慢顯現(xiàn)出來(lái)，機(jī)體產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題也日益突出。相關(guān)報(bào)道指出，中醫(yī)藥不僅能夠提高卵巢癌患者的免疫力，還能夠使患者放化療過(guò)后的毒副作用減輕，在延長(zhǎng)患者壽命、提高患者生活質(zhì)量上起著至關(guān)重要的作用[2-3]。白花蛇舌草屬于中藥范疇，具有消癰散結(jié)、清熱解毒和利濕通淋等功效，而且其化學(xué)成分中的黃酮類(lèi)物質(zhì)還能夠?qū)δ[瘤的發(fā)展產(chǎn)生抑制效果[4]。本文采用白花蛇舌草提取物對(duì)卵巢癌大鼠進(jìn)行干預(yù)，旨在探究白花蛇舌草提取物對(duì)卵巢癌的作用效果。

材料與方法

1 材 料

1.1 研究對(duì)象：選取30只由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物中心提供的健康SD大鼠，均為雌性，年齡3～6個(gè)月，平均(3.8±1.5)個(gè)月，體重200～250g，平均(220±7.9)g。所有大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，放置在室溫(22.3±1.7)℃，相對(duì)濕度30%～35%的環(huán)境中，每天光照12 h，喂飲大鼠純凈水。飼養(yǎng)時(shí)間為1周。本文研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要藥物與試劑：白花蛇舌草提取物(購(gòu)于西安明澤生物科技有限公司)；NUTU-19卵巢癌細(xì)胞(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗大鼠p38抗體(天根生化科技有限公司)；小鼠抗大鼠NF-kBp65抗體(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀及其配套試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ELISA試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司)染色劑、PBS緩沖液(均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司)。

2 研究方法

2.1 模型建造及分組處理：將30只大鼠隨機(jī)分為模型組、實(shí)驗(yàn)組和空白組，每組各10只。空白組大鼠建模期間不做任何處理；另外兩組的20只大鼠均向其右腋下注射N(xiāo)UTU-19卵巢癌細(xì)胞0.5 ml，規(guī)格為2×102細(xì)胞/ml，且注射卵巢癌細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增殖能力最強(qiáng)的細(xì)胞，癌細(xì)胞濃度越高，建模成功率就越高。因?yàn)榘┘?xì)胞與大鼠機(jī)體癌細(xì)胞相互接觸聚集形成細(xì)胞團(tuán)，當(dāng)細(xì)胞團(tuán)濃度達(dá)到1×106細(xì)胞/ml時(shí)便為造模成功。當(dāng)模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠體重減輕、毛發(fā)干枯、活動(dòng)能力下降，并且當(dāng)右下腋窩處腫瘤大小成長(zhǎng)到0.4×0.4 cm2時(shí)，建模完成。實(shí)驗(yàn)組大鼠在建模成功后對(duì)其注射白花蛇舌草提取物，1次1 ml/kg，1次/d，連續(xù)注射14 d；模型組和空白組大鼠在每天同一時(shí)間均給予等體積的生理鹽水，連續(xù)注射14 d，14 d后對(duì)三組大鼠情況進(jìn)行觀察。

2.2 樣本采集：將三組大鼠采用端頭法處死，取其卵巢組織和卵巢癌組織，為了防止細(xì)胞自溶，放入濃度為10%的福爾馬林中固定處理24 h，使組織細(xì)胞中的蛋白凝固變性。將固定好的卵巢組織和卵巢癌組織用不同梯度的酒精進(jìn)行脫水處理，去除組織塊中的水分，然后再將組織放入二甲苯中進(jìn)行透明處理。將透明處理過(guò)的組織放入融化的石蠟中浸蠟，然后將已經(jīng)浸透好石蠟的組織塊夾取放入包埋盒中，使其冷卻凝固。將包埋好的組織蠟塊放到切片機(jī)上固定，之后進(jìn)行切片，厚度為5～8 μm，放入40℃的水中展開(kāi)，然后貼在載玻片上，最后用烘烤箱以60℃的溫度烘烤1 h。

2.3 染色處理：對(duì)三組大鼠切片樣本進(jìn)行HE染色處理，使用二甲苯進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理兩次，每次5 min，然后在梯度酒精下水花處理3 min，自來(lái)水沖洗1次；使用蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗1次；使用濃度為1%的鹽酸酒精分化處理30 s，在0.2%氨水中反藍(lán)處理2 min，自來(lái)水沖洗1次；在濃度0.5%伊紅染色10 min，自來(lái)水沖洗1次；使用乙醇梯度進(jìn)行脫水處理，最后用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片，使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖像分析。

2.4 腫瘤相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定:對(duì)大鼠腫瘤重量平均值、腹水量平均值、腫瘤體積以及抑瘤率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。抑瘤率的計(jì)算在大鼠腫瘤剝離稱(chēng)重后，采用抑瘤率計(jì)算公式對(duì)其進(jìn)行計(jì)算。抑瘤率的計(jì)算公式為抑瘤率=(模型組腫瘤重量-實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量)/模型組腫瘤重量×100%。

2.5 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雌二醇(Estradiol，E2)、孕酮(Progesterone ，P)和促黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)：待測(cè)標(biāo)本加入化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，與催化劑發(fā)生催化反應(yīng)，與氧化劑發(fā)生氧化反應(yīng)，形成處于激發(fā)狀態(tài)的之間體，當(dāng)中間體達(dá)到穩(wěn)定時(shí)，會(huì)發(fā)射出光子，嚴(yán)格按照化學(xué)發(fā)光分析儀操作步驟，利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x測(cè)量光子數(shù)值，對(duì)比分析E2、P和LH水平。

2.6 Western blot檢測(cè)p38、NF-κBp65蛋白相對(duì)表達(dá)：將采集到的標(biāo)本，使用PBS緩沖液清洗3遍以上，分離緩沖液，加入IP細(xì)胞裂解液，進(jìn)行裂解35 min，提取總蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，通過(guò)10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V,電泳10 min，結(jié)束之后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結(jié)合，加入TBST稀釋按1:1000稀釋一抗Tubulin(內(nèi)參照)，在4℃的環(huán)境下孵育過(guò)夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，與二抗結(jié)合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液反復(fù)清洗。最后加入顯影劑將其僅在底物溶液中進(jìn)行顯色，嚴(yán)格按照顯影定影試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用目的蛋白條帶分析灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值=目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF-α)和白介素-2(Interleukin-2，IL-2)水平：將待測(cè)的標(biāo)本和酶標(biāo)物嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟與和固相載體產(chǎn)生反應(yīng)作用，將固相載體反應(yīng)的復(fù)合物經(jīng)過(guò)洗滌與其他物質(zhì)分離，加入酶反應(yīng)底物，經(jīng)過(guò)酶的催化作用形成有色物質(zhì)，根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行定性或定量分析TNF-α和IL-2的水平。

結(jié) 果

1 三組大鼠病理組織學(xué)觀察 如圖1所示，為三組大鼠經(jīng)HE染色后顯微鏡下病理組織圖像。圖像中可見(jiàn)模型組大鼠腫瘤細(xì)胞呈實(shí)片狀排列，細(xì)胞核異型性較大，間質(zhì)可見(jiàn)腫瘤性纖維組織增生，病理核分裂相易見(jiàn)，局部呈現(xiàn)片狀壞死，能夠見(jiàn)到瘤巨細(xì)胞，在其周?chē)梢?jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)組大鼠病理圖像中纖維間質(zhì)減少，且纖維間質(zhì)內(nèi)能夠見(jiàn)到出血狀況，局部可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞核碎屑，片狀腫瘤性壞死，能夠看到巨噬細(xì)胞。由此可以看出白花蛇舌草提取物對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。

2 三組大鼠腫瘤常規(guī)指標(biāo)比較 如表1所示，實(shí)驗(yàn)組大鼠的腫瘤重量平均值、腹水量平均值以及腫瘤體積均顯著低于模型組大鼠(P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)組大鼠的抑瘤率明顯高于模型組大鼠，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

組 別n腫瘤重量平均值(mg)腹水量平均值(V/ml)腫瘤體積(mm3)抑瘤率(%)空白組10—12.42±0.22——模型組1016.43±0.9282.30±4.1015.36±3.6423.92±2.78實(shí)驗(yàn)組109.32±0.8730.25±2.0810.86±2.5143.27±3.63t/F值26.6453.704.8320.07P值<0.05<0.05<0.05<0.05

3 三組大鼠性激素水平比較 如表2所示，實(shí)驗(yàn)組大鼠性激素E2、P表達(dá)水平明顯低于模型組大鼠，LH表達(dá)水平明顯高于模型組大鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4 各指標(biāo)變化 通過(guò)對(duì)納入動(dòng)物的造模、用藥等處理，我們對(duì)各組大鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的觀察。通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，中藥白花蛇舌草的提取物通過(guò)下調(diào)p38、NF-kBp65使炎癥指標(biāo)TNF-α和IL-2水平下降，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增長(zhǎng)。正如表3所示，實(shí)驗(yàn)組大鼠p38、NF-kBp65相對(duì)蛋白表達(dá)量比模型組均顯著降低，組內(nèi)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠TNF-α和IL-2水平比模型組大鼠也明顯下調(diào)，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。上述指標(biāo)的變化說(shuō)明白花蛇舌草提取物通過(guò)調(diào)控p38/NF-kBp65通路使炎癥指標(biāo)降低，從而抑制了實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤的發(fā)展，由此可見(jiàn)白花蛇草對(duì)腫瘤的作用機(jī)理具有一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

表2 三組大鼠性激素E2、P和LH水平比較

表3 三組大鼠p38、NF-kBp65相對(duì)表達(dá)及TNF-α和IL-2水平比較

討 論

卵巢癌屬于中醫(yī)的“腸蕈”、“癥瘕”、“積聚”等范疇，瘕者，聚散無(wú)常，瘕聚成形，推之可移，痛無(wú)定處；癥者，固定不移，有形可征，痛有定處。瘕屬氣病，癥屬血病，中醫(yī)藥古籍當(dāng)中對(duì)卵巢癌的發(fā)病機(jī)制探究也非常常見(jiàn)[5-6]。相關(guān)古籍指出，卵巢癌的發(fā)生可能是由于風(fēng)寒濕熱之邪內(nèi)侵、機(jī)體正氣不足導(dǎo)致，或者是因?yàn)榉渴隆⑶橹疽蛩厮鶄?，?dǎo)致飲食失宜，最終造成肺腑功能失常[7]。日而久之，病人正氣持續(xù)削弱，氣血痰濕相互影響，至單純的血瘀、氣滯或痰濕。在卵巢癌的臨床治療中，中醫(yī)以攻毒、祛邪、扶正培本為主，明辨虛實(shí)也是治療該病最重要的原則，在疾病初發(fā)時(shí)期，宜攻宜破；當(dāng)病人久病不愈或者術(shù)后時(shí)期，則以補(bǔ)益氣血為主，使機(jī)體正氣得到恢復(fù)，如若正氣已復(fù)仍有血塊未除，則需反復(fù)攻破[8-9]。

白花蛇舌草屬于傳統(tǒng)中藥范疇，是治療癌癥最常用的藥物之一[10]。白花蛇舌草主要生長(zhǎng)在我國(guó)南方各省潮濕的草地上、田邊以及河溝旁，是茜草科耳草屬1年生草本植物，中醫(yī)認(rèn)為白花蛇舌草性寒，味微苦、甘，歸大腸、胃、肝經(jīng)，具有消癰散結(jié)、清熱解毒和利濕通淋等功效。已有實(shí)驗(yàn)和研究表明白花蛇舌草能夠在不同組織起源的腫瘤治療中發(fā)揮其有效性[11]。通過(guò)對(duì)白花蛇舌草的生物活性和化學(xué)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)白花蛇草中主要包括蒽醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、香豆精類(lèi)、多糖類(lèi)以及生物堿類(lèi)等[12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)指出白花蛇舌草能夠抗菌抗炎、抗化學(xué)誘變、抗氧化和抗腫瘤等，而白花蛇舌草中抗腫瘤的主要有效成分是生物黃酮，能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞的凋亡和DNA合成起抑制作用[13]。白花蛇舌草提取物是一種由白花蛇舌草中的活性成分制成的滅菌水溶液，每毫升的白花蛇舌草提取物中就會(huì)含總黃酮25 mg，已有研究證明，白花蛇舌草注射液能對(duì)原發(fā)性肝癌、食道癌以及生殖系統(tǒng)腫瘤產(chǎn)生治療效果[14]。

卵巢所產(chǎn)生的甾體類(lèi)激素以及之間的協(xié)調(diào)關(guān)系能夠?qū)ε陨诚到y(tǒng)腫瘤發(fā)生及病變產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，臨床中一些卵巢癌患者常常伴有內(nèi)分泌失調(diào)的癥狀，所以很多研究認(rèn)為導(dǎo)致內(nèi)分泌異常的原因是由于卵巢腫瘤對(duì)細(xì)胞的合成以及激素轉(zhuǎn)換產(chǎn)生較大的抑制作用，間接性地增強(qiáng)了卵巢腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)分泌功能[15-16]。而且機(jī)體卵巢組織在發(fā)生腫瘤病變會(huì)使性激素分泌異常，再加上復(fù)雜的胚胎組織學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生具有多樣性，同時(shí)還會(huì)分泌出其它的激素[17-18]。在本文研究中，對(duì)卵巢癌模型大鼠組織中的性激素指標(biāo)E2、P和LH進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，卵巢癌模型大鼠在患病后體內(nèi)的E2、P和LH表達(dá)水平發(fā)生異常變化，E2、P水平相比正常大鼠明顯升高，LH表達(dá)水平明顯下降，說(shuō)明卵巢發(fā)生病變后使患病機(jī)體的內(nèi)分泌功能紊亂，導(dǎo)致性激素水平的異常表達(dá)。而在對(duì)卵巢癌大鼠使用白花蛇舌草提取物進(jìn)行干預(yù)后，患病大鼠體內(nèi)的性激素水平明顯改善，說(shuō)明白花蛇舌草提取物能夠改善卵巢癌大鼠因惡性病變導(dǎo)致的內(nèi)分泌功能紊亂狀態(tài)，調(diào)節(jié)體內(nèi)的激素分泌水平，控制腫瘤的繼續(xù)惡化發(fā)展。

癌癥常被認(rèn)為是慢性炎癥誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)，而且卵巢癌還具有慢性炎癥疾病的相似特征。有相關(guān)研究指出，TNF-α和IL-2在卵巢癌患病機(jī)體中均呈高表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤血管的形成，對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生作用。卵巢癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的、多個(gè)相關(guān)基因共同參與的過(guò)程[19]。p38/NF-kBp65信號(hào)通路能夠在腫瘤的形成中起到關(guān)鍵作用，p38/NF-kBp65信號(hào)通路中具有能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞代謝、增殖、凋亡以及細(xì)胞周期進(jìn)程的p38、NF-kBp65兩種核心蛋白，能夠?qū)?xì)胞核生長(zhǎng)周期進(jìn)行調(diào)控，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)[20]。NF-kB還能夠通過(guò)調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子、黏附因子以及趨化因子的表達(dá)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21-23]。我們?cè)谠O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中，使用Western-blot法對(duì)不同干預(yù)下卵巢癌大鼠p38、NF-kBp65的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法對(duì)TNF-α和IL-2水平進(jìn)行檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草提取物干預(yù)后的卵巢癌大鼠p38、NF-kBp65表達(dá)下調(diào)，TNF-α和IL-2水平也隨之下降，說(shuō)明白花蛇舌草提取物能夠調(diào)控p38/NF-kBp65信號(hào)通路，降低炎癥指標(biāo)的水平，從而對(duì)大鼠卵巢癌的發(fā)展產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，白花蛇舌草提取物能夠改善卵巢癌大鼠的性激素水平，通過(guò)對(duì)p38/NF-kBp65信號(hào)通路來(lái)使機(jī)體內(nèi)的炎癥指標(biāo)下降，從而抑制腫瘤的發(fā)展，為臨床中卵巢癌的治療和預(yù)后提供理論依據(jù)。