腸道微生物與自身免疫性肝病研究進(jìn)展與評價

池肇春

池肇春, 山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)科 山東省青島市 266011

核心提要：腸道微生物是微生物抗原和活化免疫細(xì)胞的儲存庫, 這些細(xì)胞參與了多種全身免疫介導(dǎo)的疾病的發(fā)病機(jī)制. 自身免疫性肝炎可能由腸道功能障礙、腸通透性增加以及微生物和自身抗原之間的分子模擬引起或維持. 多種藥物、分子、飲食和益生菌干預(yù)可以改變腸道微生物群并減弱免疫應(yīng)答. 腸道微生物在自身免疫性肝病(autoimmune liver disease, AILD)中的作用值得進(jìn)行深入的研究, 并且將尋求新的治療方法, 如抗生素、益生菌、糞便移植有望成為治療的新靶點(diǎn), 以改善AILD的預(yù)后.

0 引言

近年來, 研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有密切相關(guān), 它被視為人體又一“隱藏的器官”, 攜帶著人體“第二基因”, 研究發(fā)現(xiàn)遺傳、環(huán)境、飲食、腸道屏障功能的完整性等因素都會影響腸道微生物的結(jié)構(gòu),進(jìn)而引發(fā)疾病.

自身免疫性肝病(autoimmune liver disease, AILD)通常包括自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)、原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, BPC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)、IgG4相關(guān)性膽管炎和重疊綜合征, 是一組以免疫損傷為特征的慢性、進(jìn)展性、免疫介導(dǎo)的自身免疫性炎癥性肝疾病[1,2]. 近幾年的研究證明, 腸道微生物在AILD發(fā)病機(jī)制中的多個環(huán)節(jié)均參與作用, 引起了學(xué)者們廣泛的重視和關(guān)注, 成為最熱門的研究課題. 有關(guān)AILD的發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜, 尚未完全澄清. 涉及免疫、炎癥代謝異常、細(xì)胞因子、腸黏膜屏障破壞、和細(xì)菌生態(tài)失衡等眾多機(jī)制相關(guān), 目前認(rèn)為腸道微生物起到關(guān)鍵性作用.在腸道炎癥的情況下, 腸道屏障的損傷導(dǎo)致細(xì)菌易位,從而刺激遠(yuǎn)處器官的免疫反應(yīng). 或者, 免疫細(xì)胞異常失調(diào), 如觀察到的Th17極化. Th17細(xì)胞在腸道固有層最豐富, 它們分泌促炎細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F和IL-22, 以增強(qiáng)腸道屏障的完整性和抵抗病原體的能力[3-6].

腸源性細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)物從腸腔到肝臟、腸系膜淋巴結(jié)和其他腸外部位的遷移可能通過易位發(fā)生[7]. 易位意味著腸道通透性增加, 可能是因?yàn)槟c黏膜內(nèi)的緊密連接被削弱或腸屏障被細(xì)菌過度生長所致. 易位的細(xì)菌產(chǎn)物, 包括LPS和未甲基化的胞嘧啶-磷酸鹽-鳥嘌呤(cytosine-phosphate-guanine, CpG), 然后可以通過門靜脈輸送到肝臟并激活TLRs和NLRs[8-11].

腸道微生物群可通過飲食調(diào)整[11-13]、益生菌制劑[14-16]、補(bǔ)充維生素A和維甲酸[17,18]、抗生素[19]、腸道再定植[20-23]、降低腸道通透性的藥物來控制[24,25], 或通過阻斷TLR信號和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的分子干預(yù),刺激抗炎反應(yīng)的分子干預(yù)(多糖A), 以及短鏈脂肪酸調(diào)節(jié)影響基因表達(dá)的信號通路, 應(yīng)用保持屏障完整性的藥物等治療[4].

1 腸道微生物與肝自身免疫

由于70%的肝臟血液供應(yīng)來自門靜脈, 肝臟在生理上暴露于腸道來源的微生物成分和代謝物, 腸道微生物障礙不僅與肝臟疾病有關(guān), 而且與炎癥、纖維化或膽汁淤積狀態(tài)有關(guān)[26]. 這種腸-肝軸也與AILD有關(guān), 并且可用PSC和原發(fā)性膽管炎作為代表[5].

腸道微生物在肝臟自身免疫中的參與模式, 根據(jù)腸肝軸、細(xì)菌易位、腸道啟動淋巴細(xì)胞向肝臟遷移、膽汁酸和核受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等參與了PBC和PSC的發(fā)病機(jī)制.

1.1 肝臟的細(xì)菌易位與免疫激活 腸道黏膜免疫系統(tǒng), 特別是腸系膜淋巴結(jié), 將共生微生物區(qū)隔開. 除了系膜淋巴結(jié)外, 肝臟還充當(dāng)?shù)诙婪谰€, 以消除來自腸道的細(xì)菌[27]. 值得注意的是, 這種功能在慢性肝病中似乎受到損害, 但是Kupffer細(xì)胞在肝病過程中如何不能清除腸道微生物其機(jī)制仍然是未知的. 在這方面, 肝臟不僅是接受者, 而且是具有Kupffer細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和膽道上皮細(xì)胞(BEC)的腸源性藥物的一個過濾器.

盡管微生物群與免疫疾病有多種聯(lián)系, 但它們在自身免疫中的作用卻鮮為人知. 研究發(fā)現(xiàn), 腸道致病菌, 雞腸球菌, 轉(zhuǎn)移到肝臟和其他系統(tǒng)組織, 易于導(dǎo)致自身免疫的遺傳背景下觸發(fā)自身免疫應(yīng)答. 在該模型中, 抗生素治療可預(yù)防死亡, 抑制組織中雞大腸桿菌的生長, 并消除致病性自身抗體和T細(xì)胞. 肝細(xì)胞-雞膽汁共培養(yǎng)誘導(dǎo)自身免疫促進(jìn)因子. 單克隆和自身免疫傾向小鼠的病原體易位誘導(dǎo)自身抗體并導(dǎo)致死亡, 這個現(xiàn)象可以通過針對病原體的肌肉內(nèi)注射疫苗來預(yù)防. 從自身免疫患者的肝活檢中回收了雞大腸桿菌特異性DNA, 并且與人肝細(xì)胞共培養(yǎng)復(fù)制了鼠的模型, 因此, 在易感的人中明顯出現(xiàn)類似的過程. 這些發(fā)現(xiàn)表明, 腸道病原菌可以在遺傳易感宿主中易位和促進(jìn)自身免疫發(fā)生[28].

模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR), 它們能夠檢測微生物相關(guān)分子模式(MAMP), 例如細(xì)菌L, 肽聚糖, 鞭毛蛋白和細(xì)菌DNA, 以及其他配體. 這些MAMP引發(fā)的過度免疫應(yīng)答被認(rèn)為可導(dǎo)致肝損傷和纖維化發(fā)生. 最近的研究描述了控制微生物移位的腸血管屏障(GVB), 研究發(fā)現(xiàn)其在不明原因的腹腔疾病患者中受損.出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶升高[29]由于這些變化, 細(xì)菌易位可能導(dǎo)致腸外炎癥, 其中肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞是最脆弱的細(xì)胞類型, 容易受到炎癥的攻擊.

“漏腸”假說已經(jīng)在NAFLD以及PBC和PSC中得到了證實(shí). 例如, 由于門脈循環(huán)中的TLR4和TLR9激動劑, 當(dāng)缺乏NLRP6和NLRP3炎癥小體時可加重肝臟脂肪變性發(fā)生[30]. 敲除小鼠CX3CR1會增加門脈血清中的內(nèi)毒素, 并促進(jìn)脂肪性肝炎發(fā)展. 在PBC患者中顯示膽管受損, 在正常小鼠中慢性細(xì)菌暴露后可導(dǎo)致自身抗原產(chǎn)生和隨后的類似于PBC的膽管炎發(fā)生[31]. 此外, PSC患者中檢測到的核周抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody, p-ANCA)可能以β-微管蛋白5同種型(Beta tubulin 5 isotype, TBB-5)為自身抗原. 它是基因一種進(jìn)化的細(xì)菌蛋白, 而FtsZ(真核細(xì)胞骨架蛋白中的微管蛋白)可引起對腸道微生物的免疫交叉反應(yīng)[32]. 在人類中, 損害腸道微生物免疫應(yīng)答的遺傳多態(tài)性可能部分會導(dǎo)致肝臟疾病的發(fā)生. 事實(shí)上, 全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWASs)已經(jīng)建立了PSC與IBD幾個遺傳易感位點(diǎn), 包括募集結(jié)構(gòu)域蛋白9(caspase recruitment domaincontaining protein 9, CARD-9), 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2(fucoyl transferase FUT-2)和巨噬細(xì)胞刺激蛋白1(macrophage stimulating protein 1, MST-1), 這些基因所編碼的蛋白質(zhì)密切參與了先天免疫和適應(yīng)性免疫[33-36]如腸上皮細(xì)胞FUT-2的巖藻糖基化, 它還保持宿主-微生物群落共生.CARD9是一種配體蛋白, 它介導(dǎo)模式識別信號, 激活促炎和抗炎細(xì)胞因子, 調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞凋亡. PSC患者在膽汁和結(jié)腸微生物以不同的模式進(jìn)行FUT-2變異, 更重要的是, 顯示膽道感染和顯性狹窄的發(fā)生率增加[37].CAD9是NOD2與TLR信號通路的一個重要的下游傳遞者, 與IL-22的產(chǎn)生和腸道完整性相關(guān).

1.2 黏膜淋巴細(xì)胞向肝臟的遷移 與“腸漏”假說平行的是, 已經(jīng)提出了“腸淋巴細(xì)胞歸巢”假說來解釋與PSC和PBC相關(guān)的腸-肝軸. 黏膜淋巴細(xì)胞表達(dá)整合素α4β7和趨化因子受體CCR9, 分別與內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子MAdCAM-1(黏膜黏連細(xì)胞黏附分子-1)和趨化因子配體CCL25結(jié)合. 然而, 在炎癥性肝病, 包括PSC, 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到MAdCAM-1和CCL25的異常表達(dá)[38]導(dǎo)致腸道啟動的T細(xì)胞被異常募集到肝臟, 并可能在識別時觸發(fā)自身免疫反應(yīng)[39]實(shí)際上, 在卵白蛋白誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中, 由卵白蛋白引發(fā)的GALT中的T細(xì)胞在識別膽管細(xì)胞上的相同抗原, 即卵白蛋白時, 遷移到肝臟并引起膽管炎. 他明確了微生物群在IBD發(fā)病機(jī)制中的作用, 認(rèn)為黏膜T細(xì)胞被共生微生物群異常激活, 進(jìn)一步遷移到肝臟并與肝臟中存在的抗原發(fā)生交叉反應(yīng). 根據(jù)這一假設(shè), 最近對TCRβ鏈的測序研究表明, PSC-IBD患者的腸浸潤和肝浸潤T細(xì)胞是克隆相關(guān)的, 并且可能識別相同的抗原[40]. 由于在慢性肝病, 特別是PBC和PSC中經(jīng)常觀察到的血清IgA水平升高, 這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步突出了腸-肝軸在這些疾病中的潛在參與作用.

然而, 肝內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)腸特異性分子的機(jī)制仍不清楚, 盡管有人推測肝血管黏附蛋白(VAP)-1在PSC中的上調(diào)是肝臟MAdCAM-1異常表達(dá)的原因[41]. 來源于腸道細(xì)菌和飲食的半胱胺和其他胺類可以通過門靜脈進(jìn)入肝臟, 并作為VAP-1的底物, VAP-1是一種有效的氨基氧化酶, 導(dǎo)致產(chǎn)生分解代謝物, 在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致產(chǎn)生分解代謝物[42].

1.3 腸道微生物、膽汁酸和核受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 除了與免疫系統(tǒng)直接相互作用外, 微生物與膽汁酸(BA)之間的關(guān)系也是腸-肝相互作用的代表[43]. 膽汁酸主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生, 然后由腸腔內(nèi)的細(xì)菌代謝成次級膽汁酸. 早期的研究已經(jīng)報道, GF小鼠的BA組成不同于常規(guī)飼養(yǎng)的(CON-R)對應(yīng)物. Sayin等[44]通過顯示CONV-R小鼠表現(xiàn)出?；?β-麩鼠膽酸(TβMCA)比例降低以及BA池的顯著縮小, 提供了對該領(lǐng)域的見解. 更重要的是, 氰尿酸三聚氰胺(cyanurate melamine, MCA)是強(qiáng)有力的法尼索X受體(farnese X receptor, FXR)拮抗劑, 腸道微生物可通過減輕回腸FXR抑制來調(diào)節(jié)肝臟中BA的合成. 具體地說,腸內(nèi)的FXR激活誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長因子15(fibroblast growth factor 15, FGF15)表達(dá), 然后到達(dá)肝臟并阻斷7-α-羥化酶(7-α-hydroxylase, CYP7A1), 這是BA合成中的限速酶. 通過抗生素或抗氧化劑的微生物重組增加Tβ-MCA, 抑制腸FXR信號[45,46]. 相反, BA通過直接激活或間接激活固有免疫系統(tǒng), 進(jìn)而通過FXR和G-PR(G蛋白受體偶聯(lián)膽汁酸受體TGR5.)進(jìn)一步影響宿主生理[48]. 確實(shí), 宿主膽汁酸的動態(tài)導(dǎo)致腸道微生物群的變化[49]. 應(yīng)用FXR激動劑膽甾酸對肝硬化大鼠部分地阻止腸屏障功能障礙和減輕腸道炎癥, 通過使用GF和FXR-/-小鼠,減少了細(xì)菌易位. 最近的一項(xiàng)研究表明, 由微生物引起的飲食誘導(dǎo)的肥胖和肝臟脂肪變性取決于其對BA譜和FXR信號的調(diào)節(jié)[50]. 總之, 證明腸道微生物群、膽汁酸和核受體信號傳導(dǎo)通路的作用可影響宿主的代謝和肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制.

2 腸道微生物群與AILD

一些測序研究報告了PSC和PBC中腸道微生物群落的改變, 盡管特別是在屬和種水平上存在差異, 但仍能說明腸道微生物在AILD上的作用. 有報告在UDCA使用之前對PBC群組的糞便微生物進(jìn)行16s核糖體RNA(rRNA)測序, 以避免膽汁酸的混淆效應(yīng). 此外, 還對37例PBC患者在UDCA治療6 mo前后進(jìn)行了前瞻性研究[51]. UDCA對PBC中的腸道微生物群與健康對照組相比, 結(jié)果顯示體內(nèi)微生物多樣性顯著降低, 提出可治療腸道菌群失調(diào). 這一發(fā)現(xiàn)與先前研究不一致, 這可能是由于UDCA治療的影響有關(guān)[52]. 由12個屬定義的PBC的微生物特征可以用來準(zhǔn)確區(qū)分驗(yàn)證隊(duì)列中的PBC和對照(AUC為0.84-0.86). 腸桿菌科中增加的一個未知屬顯示出與PBC的關(guān)聯(lián)最強(qiáng), 其次是假單胞菌、微囊藻和梭菌, 而在PBC隊(duì)列中振蕩菌和沙特氏菌減少. 值得注意的是, 在這PBC相關(guān)細(xì)菌屬中, 在UDCA治療6 mo后,細(xì)菌豐度被逆轉(zhuǎn)[51], 與治療反應(yīng)平行, 因此表明腸道微生物群可能是PBC治療的潛在目標(biāo).

由于IBD在PSC病例中高達(dá)60%-80%, 腸-肝軸與PSC的發(fā)病機(jī)制有關(guān). 已發(fā)表的樣本大小從11到85名患者的研究證實(shí)了PSC中獨(dú)特的微生物分布[53]一般來說, PSC中的腸道微生物群與健康對照有顯著的偏離,其特點(diǎn)在不同的研究中, 已經(jīng)觀察到了腸球菌、微囊藻等特異性細(xì)菌的豐度變化, 其中一些可以作為PSC的生物標(biāo)志物. 其中4項(xiàng)研究分析了黏膜活檢[54-66], 而其他研究則集中在糞便微生物群上. Hov等[53]人的研究是對糞便腸道微生物群在PSC中的評估, 結(jié)果在PSC中鑒定出差異較小的微生物群, Veillonella是PSC相關(guān)屬. 然而, 根據(jù)Sabino等[59]的研究, 當(dāng)排除肝硬化患者時, PSC中Veillonella屬的差異并不顯著. 此外, Sabino等鑒定了PSC中富集的三個菌屬, 即腸球菌屬、梭菌屬和乳桿菌屬.

腸道微生物群對于腸道免疫應(yīng)答的發(fā)展是必不可少的, 而腸道免疫應(yīng)答又維持微生物群的耐受性[60,61]. 與野生型小鼠相比, 無菌小鼠腸道固有層CD4+T淋巴細(xì)胞較少, 發(fā)育不良的Peyer’s斑塊較少, IgA產(chǎn)生較少[62,63]. 通過引入脆桿菌, 糾正了這些免疫缺陷. 定植還可以誘導(dǎo)IL-10分泌的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生, 可能是由于細(xì)菌分泌多糖A和直接激活Foxp3+Treg上的TLR2[64]. FOXP3(forkhead box P3), 也稱為蛇毒精(scurfin), 是轉(zhuǎn)錄因子forkhead/winged-helix(叉頭樣/翼狀螺旋)家族的成員. 是一種參與免疫系統(tǒng)應(yīng)答的蛋白質(zhì). FOXP3主要表達(dá)在CD4+CD25+Tregs,是CD4+CD25+Tregs發(fā)育和功能的決定因素, FOXP3是調(diào)節(jié)途徑的主要調(diào)節(jié)因子, 可使免疫反應(yīng)降低. 在自身免疫性疾病中, 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性的缺乏可允許其他自身免疫細(xì)胞攻擊身體自身組織[9,10]. 盡管尚未建立精確的控制機(jī)制, FOX是脊椎動物轉(zhuǎn)錄因子的總稱, 推測在轉(zhuǎn)錄過程中通過類似的DNA結(jié)合作用發(fā)揮控制作用. 在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞模型系統(tǒng)中, FOXP3轉(zhuǎn)錄因子占據(jù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能相關(guān)基因的啟動子, 在T細(xì)胞受體的刺激下可抑制關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄. 梭菌屬的引入也可引起類似的變化[23]. 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染鼠, FOXP3使傳統(tǒng)的CD4+T細(xì)胞獲得調(diào)節(jié)表型能夠抑制體外和體內(nèi)的免疫反應(yīng), 提示異位FOXP3表達(dá)使T細(xì)胞呈現(xiàn)調(diào)節(jié)表型, 可用于過繼細(xì)胞免疫治療[65]. 證據(jù)表明, 腸道微生物可通過激活Toll樣受體(TLR[66,67]和促進(jìn)肝臟內(nèi)炎癥小體的形成[30,68]影響全身免疫應(yīng)答. TLR受體為表達(dá)在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞表面, 可識別多種類型的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)的生物分子, 這類模式識別受體可與病原體PAMPs結(jié)合, 并啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo), 導(dǎo)致效應(yīng)分子表達(dá)和分泌的受體. TLR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可導(dǎo)致固有免疫細(xì)胞活化, 產(chǎn)生兩方面效應(yīng), 其一, 表達(dá)和分泌多種稱之為促固有免疫細(xì)胞(proinflammatory cytokine), 如腫瘤壞死因子(tumor necrosis facter, TNF-α), 白細(xì)胞介素(IL)-12,IL-6等. 這些細(xì)胞因子可誘導(dǎo)炎癥發(fā)生, 促進(jìn)抗原提呈,促進(jìn)T輔助細(xì)胞(T helper cell, Th)發(fā)生Th1或Th2的格局變化; 其二, 可誘導(dǎo)共刺激分子(co-stimulatory molecule)表達(dá), 啟動特異性免疫應(yīng)答產(chǎn)生. 由抗生素、遺傳因素或疾病(生物障礙)引起的腸道微生物組成的改變可通過克服或回避對共生細(xì)菌的正常耐受性反應(yīng)來維持或增強(qiáng)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[69,70]. 細(xì)菌成分可充當(dāng)抗原,刺激全身免疫應(yīng)答[66,67,71]或腸內(nèi)原代免疫細(xì)胞, 隨后進(jìn)入外周淋巴組織[72]. 微生物和宿主衍生的抗原之間的分子模擬以及抗原致敏的淋巴細(xì)胞靶向可能隨后啟動或加強(qiáng)遺傳易感個體的自身反應(yīng)[73].

腸道微生物群與肝臟之間的相互作用是多方面的, 腸道微生物失調(diào)可以產(chǎn)生微生物相關(guān)的分子模式(MAMPs), 激活腸中的Toll樣受體(Trl). 活化的TLR可以刺激巨噬細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子, 核因子-κB(NF-κB), 并產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子. 它們還可以增加抗原呈遞細(xì)胞(APC)上主要組織相容性復(fù)合物的表達(dá), 并使CD4淋巴細(xì)胞對細(xì)菌配體敏感. 活化的淋巴細(xì)胞可以增殖為T輔助細(xì)胞Th1、Th2和Th17細(xì)胞. 這種異常微生物還可產(chǎn)生短鏈脂肪酸、內(nèi)毒素、脂多糖(LPS)和可作為抗原配體的細(xì)菌成分. 腸黏膜內(nèi)的緊密連接可能隨著微生物障礙而減弱, 并允許淋巴細(xì)胞、細(xì)菌配體和內(nèi)毒素的細(xì)胞旁易位. 這些腸源性元素可以進(jìn)入門靜脈并被輸送到肝臟. 肝內(nèi)的細(xì)菌配體可激活肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和竇狀上皮細(xì)胞中的TLR, 并產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子和活性氧(ROS), 其可產(chǎn)生激活TLR的損傷相關(guān)分子模式(DAMPs). 肝臟TLR也有助于CD4淋巴細(xì)胞對細(xì)菌配體和類似細(xì)菌配體的自身抗原(分子模擬)的增敏作用. 同時, 細(xì)菌配體和腸源性內(nèi)毒素可激活肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞中炎性小體的非肥胖型糖尿病樣受體(NLR). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1的釋放可產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)1β和IL-18, 促進(jìn)組織損傷和免疫應(yīng)答.凈效應(yīng)是增加肝臟炎癥和肝損傷, 并引起自身免疫和肝纖維化[4,73,74].

3 微生物來源的全身免疫應(yīng)答的機(jī)制

3.1 TLRs的激活 如前所述TLRs是腸內(nèi)識別微生物相關(guān)分子模式、病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式的關(guān)鍵受體[67,74,75](表1). 它們有助于產(chǎn)生對病原體和細(xì)胞信號的先天免疫應(yīng)答, 并且它們可以形成T輔助(Th)淋巴細(xì)胞的亞群, 這些T輔助(Th)淋巴細(xì)胞識別微生物成分并具有與宿主抗原交叉反應(yīng)的潛力[60,76,77]. 在人類中已經(jīng)描述了10種TLR, 并且每種TLR優(yōu)先對在沒有感染的情況下可能是病毒和細(xì)菌蛋白或內(nèi)源性配體的特定配體作出反應(yīng)[75]. 除了TLR3之外, 所有受刺激的TLR都激活依賴于髓系分化因子88(MyD88)的信號傳導(dǎo)途徑[10,78,79]. 通過MyD88通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)又激活核因子-κB(NF-κB), 并促進(jìn)促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的轉(zhuǎn)錄[10,79,80].

TLR也能影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答[60]. 樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)的TLRs可上調(diào)MHCⅡ類分子并增強(qiáng)CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞的抗原呈遞[81](表1). TLR還可以增加抗原呈遞細(xì)胞中共刺激分子CD80、CD86和CD40的表達(dá), 從而有利于T淋巴細(xì)胞活化和分化[60,81]Kupffer細(xì)胞表達(dá)除TLR5外的所有TLR, 它們是肝內(nèi)對TLR配體應(yīng)答的原代細(xì)胞[82]通過Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和活性氧可促進(jìn)肝臟炎癥和先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[60,83]. 肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞(Biliary epithelial cells, BEC)、肝星狀細(xì)胞(HSC)和竇狀上皮細(xì)胞也表達(dá)TLRs, 但只有HSCs通過TLR9表達(dá)TLR1[67].

細(xì)胞因子譜形成構(gòu)成免疫介導(dǎo)的應(yīng)答的T淋巴細(xì)胞亞群, 并且它受到微環(huán)境中配體激活的特定TLR的影響(表1). TLR4和TLR9的激活促進(jìn)IL-12的釋放, 并有利于促炎癥的1型細(xì)胞因子途徑[84]TLR4還誘導(dǎo)IL-23的分泌, 促進(jìn)促炎性Th17淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增和存活[85]. 相反,TLR2的激活有利于IL-10和IL-13的產(chǎn)生, 從而促進(jìn)抗炎2型細(xì)胞因子應(yīng)答[86].

革蘭陰性細(xì)菌的LPS是激活TLR4的主要配體[10,86]細(xì)菌和病毒基因組中未甲基化的CpG序列激活TLR9(表1).革蘭陰性細(xì)菌的LPS是激活TLR的主要配體[79], TLR2、TLR5、TLR7和TLR8由CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá), 激活這些TLR的配體(病毒蛋白)、鞭毛蛋白和單鏈核糖核酸可以直接激活記憶淋巴細(xì)胞并刺激其增殖. 天然存在的Tregs表達(dá)TLR2、TLR5和TLR8, 它們也可以被病毒和細(xì)菌成分直接激活[87]. TLRs還可以通過識別誘導(dǎo)IL-6分泌的微生物產(chǎn)物來阻斷Tregs的抑制作用. 病原體特異性適應(yīng)性免疫應(yīng)答是有利的, 可以加強(qiáng)防御機(jī)制. 因此,微生物元素可通過TLR調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答, 并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子譜或直接通過影響免疫細(xì)胞增殖間接的影響免疫穩(wěn)態(tài).

TLR4是HSCs增加細(xì)胞外基質(zhì)的一個重要信號通路. HSCs中活化的TLR4介導(dǎo)趨化因子和黏附分子的產(chǎn)生, 炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞對肝臟的化學(xué)吸引刺激纖維化過程[88]. TLR4信號通路還通過下調(diào)TGF-β受體的內(nèi)源性抑制劑的產(chǎn)生來促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的激活.此外, TLR4信號還可下調(diào)抑制膠原轉(zhuǎn)錄的microRNA分子[89]. TLR4基因的多態(tài)性可能影響TLR4對LPS的應(yīng)答. 因此, LPS誘導(dǎo)的激活NF-κB的信號通路可能被破壞, 并且促炎細(xì)胞因子TNF-α和干擾素-β的產(chǎn)生可能減少[90]. 以這種方式, 遺傳變異可能影響TLR4對微生物配體的反應(yīng)和進(jìn)行性肝纖維化的傾向.

TLR4信號通路涉及MyD88和NF-κB在肝病進(jìn)展中的作用[91,92]. 腸源性內(nèi)毒素的濃度在肝纖維化動物模型以及在肝硬化患者的循環(huán)系統(tǒng)和門靜脈中增加. TLR信號通路尚未在自身免疫性肝炎中得到評價.

3.2 炎性小體刺激 炎性小體是蛋白質(zhì)復(fù)合物, 在多種細(xì)胞的胞漿內(nèi)形成, 包括巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞和HSC, 以接受與細(xì)胞應(yīng)激、損傷或感染有關(guān)的刺激[68,93,94]通過釋放促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18, 它們驅(qū)動對組織損傷的炎癥反應(yīng), 并影響細(xì)胞死亡、炎癥活性和纖維化. TLR和炎癥小體具有不同的激活途徑[95], 但是它們之間的合作對于促進(jìn)腸道微生物群與全身免疫應(yīng)答之間的交流至關(guān)重要. 增加炎性小體表達(dá)的因素, 如飽和脂肪酸和細(xì)菌內(nèi)毒素, 可增加TLR4的活化, 促進(jìn)肝纖維化[96].

炎性小體由非肥胖性糖尿病(NOD)樣受體(NLR)家族中的傳感器蛋白、適配分子(凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣CARD結(jié)構(gòu)域包含蛋白)和caspase(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)1組成[97]. 炎性小體可以感知微生物產(chǎn)物和代謝應(yīng)激[84], 激活caspase1, 觸發(fā)炎性細(xì)胞因子的釋放, 并形成先天的[88]和適應(yīng)性免疫應(yīng)答. LPS刺激后肝細(xì)胞NLRP3(NOD樣受體)表達(dá)上調(diào), Kupffer細(xì)胞和上皮細(xì)胞也表達(dá)高水平的NLRP1和NLRP3[95].

TLR和NLR共同為信號傳導(dǎo)途徑提供受體, 這些信號傳導(dǎo)途徑可響應(yīng)包括微生物成分在內(nèi)的各種內(nèi)源性和外源性危險信號, 它們各自可產(chǎn)生促炎癥反應(yīng), 維持和增強(qiáng)對肝臟的固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[98]TLRS也可能對炎性小體有反調(diào)節(jié)作用. LPS對TLRS的慢性刺激誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生并降低NLRP3的激活[99]. 此外, 激活TLR2或TLR4可增加肝細(xì)胞的自噬、NLRP3的降解和抑制IL-1β的產(chǎn)生[100].

表1 腸微生物驅(qū)動全身免疫應(yīng)答的機(jī)制

3.3 腸黏膜屏障作用的產(chǎn)生 生理情況下上皮細(xì)胞相互緊密連接形成一個生理屏障, 使細(xì)菌和系統(tǒng)循環(huán)很少接觸. 杯狀細(xì)胞分泌糖蛋白形成黏液層復(fù)蓋上皮[101], 這個黏液層由內(nèi)外兩層組成[101]外層是一個松黏液層, 含有大量細(xì)菌, 為共生菌提供一個理想的生存場所, 黏蛋白-2葡聚糖是重要的能量來源, 內(nèi)層是一個無菌的堅固稠密的黏液層可防止細(xì)菌與上皮細(xì)胞直接接觸[102].

共生菌對保持腸屏障完整性可能有益作用, 如艾克曼菌(Akkermamsia muciniphila)[103], 這些有益菌黏連至腸細(xì)胞, 可保持正常的屏障功能 . 嗜黏蛋白-艾克曼菌是一種從糞便中分離到的厭氧腸道菌, 可以利用腸道黏蛋白, 其主要功能與是調(diào)節(jié)腸道內(nèi)黏液厚度和維持腸道完整性, 它與肥胖、糖尿病、炎癥和代謝紊亂呈負(fù)相關(guān)[104].

抗菌分子包括防御素(dofensins)、抗菌肽溶酶體、C型凝集素等可阻止細(xì)菌與上皮細(xì)胞的相互作用[105]. 抗菌蛋白通過溶酶體或非酶抗菌分子如防御素、抗菌肽等把細(xì)菌殺死.

再生胰島衍生蛋白3γ(regenerating islet derived protein 3 gamma, REG3g). 是一種C-型凝集素, 在TLR-依存方式和TLR、TLR5配體引起REG3g表達(dá)[106,107].REG3g缺乏的小鼠腸上皮細(xì)胞, 特別是內(nèi)黏液層的上皮細(xì)胞上有細(xì)菌定植增加, 揭示REG3g在上皮細(xì)胞和腸菌隔離上的重要作用.

腸道屏障功能破壞后, 細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)物從腸腔到達(dá)固有層, 其機(jī)制是許多細(xì)菌易位通過M-細(xì)胞(微褶細(xì)胞),細(xì)菌蛋白與M-細(xì)胞特異的相互作用后經(jīng)內(nèi)化、跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn), 有些病原體可改變緊密連接分子, 因而改變細(xì)胞旁滲透性, 有些細(xì)菌激活MLCK(肌球蛋白輕鏈激酶), 引起緊密連接破壞[108].

腸道微環(huán)境與全身免疫應(yīng)答之間腸黏膜屏障作用的產(chǎn)生意味著腸道域之間的自然屏障關(guān)系(表2). 有充分的證據(jù)證明這種假設(shè)是正確的, 但實(shí)際的機(jī)制目前尚不確定.

腸源性細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)物從腸腔到肝臟、腸系膜淋巴結(jié)和其他腸外部位的遷移可能通過易位發(fā)生. 易位意味著腸道通透性增加, 可能是因?yàn)槟c黏膜內(nèi)的緊密連接被削弱或腸屏障被細(xì)菌過度生長所致[109,110]. 易位的細(xì)菌產(chǎn)物, 包括LPS和未甲基化的CpG, 可以通過門靜脈輸送到肝臟并激活TLRS和NLRS[79].

細(xì)菌產(chǎn)生短鏈脂肪酸(乙酸、丁酸和丙酸), 這些脂肪酸可以影響腸黏膜內(nèi)的緊密連接[14,110](表2). 丁酸誘導(dǎo)腸黏膜中黏蛋白的合成, 加強(qiáng)緊密連接, 并減少細(xì)菌穿過應(yīng)激上皮的傳輸[104,111]丁酸還可通過促進(jìn)外周Tregs的胸腺外分化[112,113]和抑制NF-κB和促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄而具有抗炎作用. 其它短鏈脂肪酸(丙酸)和細(xì)菌副產(chǎn)物(琥珀酸和乙酸)不誘導(dǎo)黏蛋白的產(chǎn)生, 但可能會增加腸的通透性[11].

丁酸鈉部分通過調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白依賴的Wnt信號通路在細(xì)胞內(nèi)起作用. 這一途徑可影響細(xì)胞增殖和分化的基因轉(zhuǎn)錄. 在結(jié)腸癌細(xì)胞系中, β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的水平可影響其對丁酸的生理反應(yīng). 高水平的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡. 丁酸調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的能力可能反過來又影響細(xì)胞活力和功能, 這些作用可能有助于維持胃腸黏膜屏障的完整性[114].

表2 腸道屏障的微生物機(jī)制

丁酸還可以通過促進(jìn)細(xì)胞的凋亡或通過自噬來保存和調(diào)節(jié)細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)[115-117]丁酸可促進(jìn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達(dá)和誘導(dǎo)大腸細(xì)胞凋亡的caspases(尤其是caspase3)的激活. 它也是一種短鏈脂肪酸, 包括丙酸酯, 可以誘導(dǎo)受損細(xì)胞的自噬, 并通過產(chǎn)生能量和阻滯凋亡的內(nèi)在途徑(線粒體)來保存它們的存活[117,118]腸源性短鏈脂肪酸, 如丁酸和丙酸, 可能是腸黏膜細(xì)胞增殖和功能的重要調(diào)節(jié)因子, 它們可能有助于預(yù)防全身性自身免疫反應(yīng)[115]. 乳酸是碳水化合物發(fā)酵的細(xì)菌副產(chǎn)物, 也同時可降低腸道的通透性(表2). 乳酸菌主要通過腸道菌群發(fā)酵成丁酸酯起作用. 乙酰輔酶A途徑是乳酸產(chǎn)生丁酸的主要途徑, 腸道微生物區(qū)系在乳酸的消耗上具有相當(dāng)大的變異性[119,120].

腸上皮細(xì)胞與結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合在一起[120]結(jié)構(gòu)蛋白被組織組成緊密連接、黏附連接和橋粒三部分組成連接復(fù)合物. 閉塞素是唯一已知的在細(xì)胞旁空間具有結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白, 是緊密連接的主要成分. 閉塞帶1和2和扣帶蛋白是在細(xì)胞與細(xì)胞接觸部位緊密連接處發(fā)現(xiàn)的非跨膜蛋白. 它們可能被封閉, 它們可能將細(xì)胞耦合到細(xì)胞骨架. 肌動蛋白和肌球蛋白絲通過鈣依賴性黏附分子(E-cadherins)在黏附連接處將細(xì)胞錨定在一起, 中間絲錨定到橋粒上, 并幫助細(xì)胞結(jié)合. 多種細(xì)胞信號通路影響連接點(diǎn)的組裝和封閉, 并且它們是蛋白激酶C調(diào)節(jié)的閉塞蛋白和閉塞帶1特異性的細(xì)胞類型[4,5,121,122].

大腸桿菌和艱難梭菌通過打開細(xì)胞旁通路[11,123],可解離結(jié)合蛋白, 增加腸通透性(表2). 腸上皮細(xì)胞上的TLR可以調(diào)節(jié)腸屏障的完整性, 可能通過影響結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)或功能的分子介質(zhì)的表達(dá)所致[124]. TLR2的激活增加了蛋白激酶C亞型的磷酸化, 這種作用與增強(qiáng)閉塞帶的表達(dá)和緊密連接的密封有關(guān). 相反, TLR4的激活降低磷酸化閉塞蛋白的表達(dá)并增加細(xì)胞間的通透性[124].來自不同微生物物種的細(xì)菌配體可能通過TLR信號來影響腸道通透性, 而微生物產(chǎn)物通過多孔腸屏障的轉(zhuǎn)移可能有助于全身的自身反應(yīng)的發(fā)生[125].

微生物體影響全身免疫應(yīng)答的另一個機(jī)制是通過細(xì)菌抗原在Peyer結(jié)內(nèi)的M細(xì)胞穿過黏膜屏障的活性轉(zhuǎn)運(yùn). 雖然免疫細(xì)胞可以在腸內(nèi)被激活, 并通過易位遷移到肝臟或外周淋巴組織, 但它們也可以通過易位或主動運(yùn)輸?shù)募?xì)菌成分在體內(nèi)循環(huán)中被激活, 這些細(xì)菌成分由抗原呈遞細(xì)胞呈遞并識別, 用循環(huán)的CD4+T輔助淋巴細(xì)胞作為外源抗原[20].

4 診斷AILD時對腸道菌群檢測的評價

傳統(tǒng)的糞便培養(yǎng)技術(shù)在評估腸道微生物群方面受到限制, 主要是因?yàn)閰捬跷⑸镫y以培養(yǎng)并且一些微生物種群可能無法通過常規(guī)方法檢測[126,127]. 研究腸道菌群多樣性的常用方法是測序16S核糖體核糖核酸(rRNA)基因. 16S rRNA基因存在于所有原核細(xì)胞中, 具有高度可變的區(qū)域散布著高度保守的區(qū)域, 其序列是原核生物的主要群組所特有的. 這些序列可用于重建腸道微生物群的系統(tǒng)發(fā)育[127].

設(shè)計引物以補(bǔ)充可變區(qū)域兩側(cè)的普遍保守區(qū)域,并確定細(xì)菌種類及其在微生物群中的比例. 通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增可變區(qū), 并將PCR產(chǎn)物純化為測序. 測序結(jié)果與已建立的注釋數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較[127].

用于重構(gòu)人腸道微生物組分的技術(shù)的進(jìn)一步進(jìn)展包括微陣列技術(shù)、指紋技術(shù), 例如末端限制性片段長度多態(tài)性的測定和下一代測序(NGS)[128,129]. 脫氧核糖核酸的微陣列雜交提供了一個高通量平臺, 它由幾千個探針組成, 可以同時檢測核酸序列[130].

人類腸道芯片有4441個探針, 包括2442個針對已知微生物的探針, 以及1919個針對未知微生物的探針[130]具有重疊相似性的探針對數(shù)量較少的微生物物種變得更加敏感, 具有探索性設(shè)計的探針正與具有微生物特異性的探針耦合, 以盡力識別具有非特異序列的微生物[131].

目前, 腸道生態(tài)系統(tǒng)主要通過16S rRNA測序進(jìn)行研究. 該技術(shù)在鑒定構(gòu)成腸道微生物群落的微生物種類、確定微生物群落的進(jìn)化與變遷(系統(tǒng)發(fā)育)以及定量微生物多樣性方面是有用的[128].

5 治療策略

腸道微生物群可通過飲食調(diào)整、益生菌制劑、補(bǔ)充維生素A和維甲酸、抗生素、腸道再定植、降低腸道通透性的藥物來控制和調(diào)節(jié)腸道屏障, 阻斷TLR信號和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的分子干預(yù)等進(jìn)行治療, 也可通過刺激抗炎反應(yīng)的分子干預(yù)(如多糖A), 以及調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸信號通路來影響基因表達(dá)、腸屏障完整性和炎癥反應(yīng)[129-131].

含有雙歧桿菌的益生菌補(bǔ)充劑促進(jìn)了Tregs在細(xì)胞培養(yǎng)物中的擴(kuò)展[15]鞣酸明膠已被用于小鼠急性結(jié)腸炎模型中, 其作用是保護(hù)黏膜屏障, 改變微生物組成, 并降低炎癥活性[132]. 在LPS刺激的細(xì)胞培養(yǎng)中也評價了鞣酸明膠, 它抑制細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá), 并以劑量依賴的方式減少IL-8和TNF-α的產(chǎn)生[25]. 新近報道益生菌可減輕NASH患者的脂肪變性, 此需要進(jìn)一步驗(yàn)證[133].

腸道微生物群的控制在動物模型和肝病患者中也顯示出了希望. 在四氯化碳誘發(fā)的肝硬化大鼠中, 抗生素治療和益生菌補(bǔ)充劑可降低全身內(nèi)毒素水平并改善了肝功能試驗(yàn)[134]而在缺血/再灌注性肝損傷大鼠中, 益生菌補(bǔ)充劑乳酸桿菌降低了前體內(nèi)毒素的產(chǎn)生. 炎癥、促纖維化細(xì)胞因子和肝功能試驗(yàn)也得到改善[135]. 一個小型隨機(jī)臨床試驗(yàn)表明, 萬古霉素或甲硝唑治療可提高血清堿性磷酸酶和降低膽紅素水平, 減少瘙癢[130]. 澄清腸道微生物在自身免疫性肝炎中的作用是必要的, 以指導(dǎo)研究戰(zhàn)略, 將有助于制定輔助干預(yù)措施, 以改善這種疾病的結(jié)局[136].

免疫抑制劑皮質(zhì)類固醇、依那西普、他克莫司、環(huán)孢素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤和英夫利昔單抗用于治療AIH和重疊綜合征, 但對PSC患者沒有顯示出臨床效果[137-139], 因此不推薦使用. 最近用布地奈德治療AIH的效果尚不清楚.

肝移植是PSC患者在斯堪的納維亞半島一些國家肝移植的主要適應(yīng)征. 也是美國第五大肝移植最常見的適應(yīng)癥1年和5年生存率分別超過90%和80%, PSC患者是肝移植最成功的患者之一[140].

與其他慢性肝病患者相比, PSC患者更容易接受活體供者的肝移植, 自從終末期肝病模型(Model for endstage liver disease, MELD)評分開始使用以來, 這一趨勢有所增加. 一項(xiàng)研究并未發(fā)現(xiàn)因膽管炎而導(dǎo)致死亡或臨床惡化的風(fēng)險增加[141].

6 結(jié)論

腸道共生微生物利用多種途徑形成 黏膜免疫, 從而有助于導(dǎo)致遺傳易感個體的系統(tǒng)自身免疫發(fā)生. 由于腸道微生物隨時在變化中, 情況變得非常復(fù)雜, 因此觀察到的結(jié)果是疾病的原因還是結(jié)果目前仍不完全了解. 從目前研究證據(jù)來看, 腸道微生物引起自身免疫進(jìn)一步導(dǎo)致疾病的發(fā)生已得到共識. 今后應(yīng)探索特定微生物的免疫和代謝功能, 并尋求糞便微生物的輔助治療. 糞便移植或益生菌治療可補(bǔ)充目前的免疫抑制方案, 對于將來臨床改善自身免疫性疾病及炎癥性疾病有很大的前景.

阻斷TLR信號傳導(dǎo)或調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)的分子干預(yù)可能會減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生, 限制不利的基因表達(dá),并增強(qiáng)腸屏障的完整性, 致使減少疾病的發(fā)生.