DNA甲基化在胰腺癌早期診斷及治療中的研究進(jìn)展

盧家俊, 袁 周

盧家俊, 袁周, 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院普外科 上海市200233

核心提要：DNA甲基化是在基因在DNA序列不發(fā)生改變的情況下, 通過(guò)對(duì)基因的調(diào)控和修飾重塑作用,使基因的表達(dá)異常, 從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展, 其過(guò)程往往發(fā)生在體細(xì)胞癌變之前, 對(duì)于腫瘤的早期診斷具有極大的價(jià)值,并且通過(guò)運(yùn)用藥物改變DNA甲基化的狀態(tài)有可能促進(jìn)癌癥的治療.

0 引言

胰腺癌(pancreatic cancer, PC)是一種惡性程度極高的消化道惡性腫瘤, 大約60%的PC患者在確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移, 僅有約20%的病人可以得到根治性手術(shù)切除治療,導(dǎo)致總體五年生存率低于5%, 而接受根治性手術(shù)后的患者5年生存率也只有20%[1,2]. 根據(jù)美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)的調(diào)查, 2017年美國(guó)PC死亡率高居腫瘤相關(guān)死亡的第四位,并且呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[3]. 常規(guī)的腫瘤標(biāo)志物CA19-9的檢測(cè)及影像學(xué)檢查作為高危人群的篩查方法對(duì)PC早期診斷幫助較小[4,5]. 因此, 發(fā)現(xiàn)一種有效的標(biāo)記物來(lái)用于PC的早期診斷成為了研究的熱點(diǎn).

近年來(lái), 研究者們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)通過(guò)對(duì)基因的調(diào)控和修飾重塑在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到作用. DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種常見形式, 其改變往往發(fā)生在體細(xì)胞癌變之前, 是腫瘤發(fā)生的早期事件.在人體的多種體液中能夠檢測(cè)到甲基化的DNA, 例如膽汁、排泄物以及血液. ctDNA是由腫瘤細(xì)胞釋放到血液中的游離DNA, 攜帶著腫瘤細(xì)胞中的基因突變和表觀遺傳學(xué)改變[6]. 隨著二代測(cè)序及ddPCR技術(shù)的發(fā)展,ctDNA得到了廣泛的研究, 已檢測(cè)到多種惡性腫瘤患者ctDNA中有多種基因存在異常甲基化, 且與腫瘤患者的臨床病理特征存在不同程度的相關(guān)性, 具有檢測(cè)穩(wěn)定性好, 組織特異性高的優(yōu)點(diǎn), 使得DNA甲基化成為一個(gè)能夠指導(dǎo)診斷、分期、判斷預(yù)后及監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的有前景的生物標(biāo)記.

1 DNA甲基化與PC的發(fā)病機(jī)制

DNA甲基化是指在三種主要的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT1, DNMT3a和DNMT3b)的作用下, 從甲基供體轉(zhuǎn)移甲基到胞嘧啶5'位的過(guò)程[7]. 理論上任何人類基因組上每個(gè)C都可以發(fā)生甲基化, 但人類的DNA甲基化通常發(fā)生在基因的CPG島上, 大約60%的人類基因中存在啟動(dòng)子區(qū)的CPG島, 其中僅有5%的啟動(dòng)子基因發(fā)生甲基化[8]. 目前許多研究已經(jīng)在各種腫瘤中檢測(cè)到了異常的啟動(dòng)子甲基化模式(表1[9-21]), 為揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供了線索, 并被視為一種潛在的標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)腫瘤.

DNA甲基化主要通過(guò)CPG島的異常高甲基化使得抑癌基因表達(dá)沉默或低甲基化使得癌基因表達(dá)上調(diào), 從而影響甚至導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生, 因此理論上我們也能在PC疾病進(jìn)展的各個(gè)階段中檢測(cè)到這一改變. 胰腺導(dǎo)管腺癌是目前PC最常見的病理類型, 其的發(fā)生發(fā)展通常是從非侵襲性的癌前病變演化而來(lái), 其中最常見的類型是胰腺上皮內(nèi)瘤變(PanINs)[1]. Sato等[22]人對(duì)胰腺上皮內(nèi)瘤變的病變組織進(jìn)行了甲基化的研究, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)有8種基因(CAH3、reprimo、CLDN5、LHX1、NPTX2、SARP2、SPARC、ST14)的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生了不同程度的甲基化. Yokoyama等[23]人在胰腺導(dǎo)管腺癌患者中發(fā)現(xiàn)異常甲基化的基因MUC4和MUC1, 并證明了其低甲基化狀態(tài)與不良的預(yù)后有關(guān). Sato[24]的另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)5組PC細(xì)胞株中的癌基因MMP-2、MMP-7、MMP-9的CPG島甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn), 在表達(dá)的3組細(xì)胞株中檢測(cè)到基因中CPG島絕大部分表現(xiàn)為低甲基化狀態(tài),另外2組不表達(dá)的細(xì)胞株, 其CPG島則呈正常甲基化狀態(tài). 此外, 宋海榮等[25]和楊衛(wèi)華等[26]分別對(duì)比了PC腫瘤組織與癌旁組織中APC與P16基因的表達(dá)及其甲基化的水平, 結(jié)果都發(fā)現(xiàn)在PC中上述兩種抑癌基因的啟動(dòng)子序列均呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài), 并且Ginesta等[27]在71% PC患者的胰液中發(fā)現(xiàn)了甲基化的APC基因. 這些研究說(shuō)明了在PC進(jìn)展的不同階段有多種基因啟動(dòng)子區(qū)的CPG島異常甲基化起到作用. 不僅如此, Yi等[28]的研究發(fā)現(xiàn)在PanINs患者中甲基化的BNC1隨著PanINs病變的進(jìn)展檢出率得到提升, 在PaIN-3患者中達(dá)100%, 并且在其他研究中也發(fā)現(xiàn)了在一些腫瘤進(jìn)展的不同階段某些基因的CPG島甲基化狀態(tài)也被隨之發(fā)生變化[29,30]. DNA甲基化還被證實(shí)參與了在一些腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程[31,32], 但在PC中尚缺少有關(guān)研究.

隨著研究的不斷進(jìn)展, 除了以上這些主要的基因以外, 又有許多與PC相關(guān)的甲基化基因進(jìn)入了研究者的視線, 比如抑癌基因RASSF10[33], 轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因INSM2[34]等等. 由于這些癌基因與抑癌基因能在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn), 仍然需要進(jìn)一步的研究去尋找對(duì)PC特異性及敏感度高的甲基化標(biāo)志物.

表1 常見腫瘤中的潛在DNA甲基化標(biāo)記物

2 DNA甲基化與PC早期診斷

隨著影像學(xué)的逐步發(fā)展, 越來(lái)越多的腫瘤可以在早中期被發(fā)現(xiàn), 但對(duì)于早期且微小的胰腺惡性病變?nèi)匀惠^難做出準(zhǔn)確的診斷. 將近80%的患者在確診時(shí)已經(jīng)喪失了手術(shù)治療的時(shí)機(jī), 其中位生存期僅6-9 mo, 但有研究表明對(duì)于腫塊小于1 cm的PC患者接受手術(shù)切除治療后的五年生存率高達(dá)80%以上, 遠(yuǎn)高于晚期腫瘤患者[35]. 因此提升PC的早期診斷變得尤為迫切. 澳大利亞的PC基因組計(jì)劃(APGI)最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn), 在PC發(fā)生的關(guān)鍵信號(hào)通路中存在高水平的異常甲基化, 證明它作為PC診斷的生物標(biāo)志物是可行的[36].

PanINs向惡性腫瘤演變的過(guò)程非常緩慢, 可能需要10-15年才能完成[37], 這就給予了這些病人能夠?qū)崿F(xiàn)早期診斷及根治性治療的機(jī)會(huì). 對(duì)此, 一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了NTPX2、SARP2、RPRM及LHX1在PanINs中出現(xiàn)異常甲基化而導(dǎo)致基因沉默表達(dá), 這些基因的發(fā)現(xiàn)在PC的早期診斷及高危病人的一級(jí)預(yù)防中可能發(fā)揮一定的作用[22].

胰液中含有來(lái)自胰腺各部分的脫落細(xì)胞, 是檢測(cè)胰腺導(dǎo)管細(xì)胞中異?；虮磉_(dá)的理想來(lái)源, 可能在區(qū)分無(wú)特異癥狀的胰腺良惡性疾病時(shí)發(fā)揮作用. 一項(xiàng)研究表明, 在胰液中檢測(cè)到CCND2、TFPI2、PENK、NPTX2和FOXE1這五種基因中的2種及以上甲基化可以區(qū)分癌癥患者和包括慢性胰腺炎在內(nèi)的非腫瘤患者, 且具有較高的敏感性(82%)和特異性(100%)[38]. 此外, Kisiel等[17]人在研究中對(duì)102名實(shí)驗(yàn)對(duì)象的CD1D、KCNK12、CLEC11A、NDRG4、IKZF1和PKRCB的甲基化改變進(jìn)行分析, 其中包括61名PC患者, 22名慢性胰腺炎病人以及19位健康對(duì)象, 發(fā)現(xiàn)了CD1D可以區(qū)分PC和正常組織, 其敏感性和特異性分別為75%和95%, 并且與慢性胰腺炎鑒別時(shí)特異性達(dá)到了91%.

PC患者外周血中存在著循環(huán)DNA, ctDNA可以用來(lái)定量血液中腫瘤的DNA, 為我們提供患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷的信息, 并且可以揭示腫瘤DNA的甲基化狀態(tài), 在微小病變患者中, 釋放進(jìn)入血液中的ctDNA濃度也較低[39]. 而各類實(shí)驗(yàn)中通常會(huì)以檢測(cè)到相應(yīng)的基因突變作為區(qū)別ctDNA與正常循環(huán)DNA的方法[40], 但是由于基因突變的位點(diǎn)的多樣性導(dǎo)致即使在同一種腫瘤中其基因序列也可能在大范圍的區(qū)域內(nèi)發(fā)生變化, 而大部分基因發(fā)生甲基化的位點(diǎn)多位于啟動(dòng)子的CPG島的特定區(qū)域[41-43]. 因此與基因突變相比, DNA甲基化在同一腫瘤中具有更高的一致性, 可使ctDNA的檢出率提高[44,45]. Yi等[28]從PC腫瘤組織中篩選出與PC特異相關(guān)較高的基因位點(diǎn)BNC1和ADAMTS1基因,之后又在PC患者的血清中檢測(cè)到BNC1和ADAMTS1基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生異常的高甲基化, 其敏感度分別為79%和48%, 特異度分別為89%和92%, 并且更進(jìn)一步的分析顯示在PanINs患者以及Ⅰ期PC患者中也能檢測(cè)到BNC1(PanINs患者中70%, PCⅠ期患者中97%)和ADAMTS1基因(PanINs患者中25%, PCⅠ期患者中63%)的甲基化狀態(tài), 最終通過(guò)對(duì)10例早期PC患者的血清進(jìn)行檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證其對(duì)PC的診斷價(jià)值, 結(jié)果顯示這兩個(gè)基因位點(diǎn)的敏感度均達(dá)到90%, 故研究者認(rèn)為檢測(cè)血清中BNC1和ADAMTS1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)可能成為早期診斷PC的腫瘤標(biāo)記物.

上文中我們闡述了在一些研究中發(fā)現(xiàn)P16、APC及RASSF1A等基因在PC組織中存在高甲基化狀態(tài), 但是Kawasaki等[42]人在胃癌、肺癌、乳腺癌和肝癌的樣本中檢測(cè)P16的甲基化狀態(tài)也得到了相似的結(jié)果.Schneikert[46]的一項(xiàng)研究表明APC基因啟動(dòng)子高甲基化能在結(jié)直腸癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中被檢出. Leodolter等[47]發(fā)現(xiàn)在胃癌中可以檢測(cè)到RASSF1A基因的高甲基化. 因此血漿中P16、APC及RASSF1A等基因甲基化在PC診斷中缺乏特異性, 其臨床的應(yīng)用價(jià)值還有待進(jìn)一步研究討論.

但是無(wú)論從胰液或者組織標(biāo)本中獲取DNA甲基化信息, 患者都需要接受一定程度的有創(chuàng)操作, 并且難以反復(fù)獲取, 而從血液中獲取的甲基化的ctDNA則具有無(wú)創(chuàng)、易獲得、方便簡(jiǎn)潔的優(yōu)點(diǎn), 我們可以通過(guò)測(cè)定患者血液中的甲基化ctDNA來(lái)對(duì)患者的整個(gè)疾病進(jìn)展過(guò)程進(jìn)行檢測(cè), 對(duì)于具有癌前病變的病人進(jìn)行監(jiān)測(cè)相應(yīng)基因的甲基化狀態(tài), 例如PanINs患者, 可以做到早期診斷. 但這仍只存在于我們的設(shè)想中, 能作為PC特異性診斷標(biāo)記物的甲基化位點(diǎn)仍未發(fā)現(xiàn), 仍然需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)攻克這一難題.

3 甲基化與PC的治療及預(yù)后評(píng)價(jià)

目前PC發(fā)病機(jī)制尚不清楚, 越來(lái)越多的證據(jù)顯示PC發(fā)病與多基因病變有關(guān), 這包括DNA序列變化引起的基因突變和非DNA序列變化引起的基因表達(dá)改變, 后者與基因的突變不同, 表觀遺傳學(xué)的改變大都是可逆的, 因此, 利用藥物來(lái)改變細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)可能是治療癌癥的一條新途徑. 針對(duì)異常的甲基化DNA可以被逆轉(zhuǎn), Dammann等[48]發(fā)現(xiàn)用去甲基化藥物 5-重氮-2’脫氧嘧啶(5-AzA-2’dC)處理PC細(xì)胞后,可使沉默的RASSF1A基因重新獲得表達(dá). 同樣有研究表明, 通過(guò)使用藥物如5-氮雜-2’脫氧胞苷處理PC細(xì)胞后, 發(fā)現(xiàn)表達(dá)沉默的SPARC基因可以得到逆轉(zhuǎn), 這樣的作用還能出現(xiàn)在宮頸癌及大腸癌中[49-51]. Shakya等[52]人發(fā)現(xiàn)在胰腺導(dǎo)管腺癌中存在STAT1的高甲基化狀態(tài), 而5-重氮-2’脫氧嘧啶與γ干擾素合用可以對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌產(chǎn)生正性抗增殖作用, 為進(jìn)一步研究去甲基化藥物與細(xì)胞因子和免疫治療的結(jié)合提供了理論基礎(chǔ). 但是PC的發(fā)病并非單基因的作用, 盡管部分DNA的甲基化狀態(tài)可以被藥物糾正, PC的進(jìn)展仍然難以逆轉(zhuǎn).

至今為止, 根治性手術(shù)仍是治愈PC的唯一希望, 并且藥物治療敏感性低, 使得一些研究開始轉(zhuǎn)向PC患者的預(yù)后評(píng)估以及對(duì)藥物的反應(yīng)監(jiān)測(cè). 許多研究已經(jīng)表明在一些腫瘤中部分單基因的甲基化與患者生存率有關(guān)[53,54]. 在一項(xiàng)對(duì)30例PC患者的血液標(biāo)本中的啟動(dòng)子區(qū)甲基化的研究中, 研究者們發(fā)現(xiàn)甲基化的TNFRSF10C和ACIN 1基因與較短的生存時(shí)間存在顯著的相關(guān)性[55]. 并且有進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在PC患者中檢測(cè)到基因MUC1和MUC4的低甲基化狀態(tài)較其高甲基化狀態(tài)具有更加不良的預(yù)后[23]. 此外, Thompson等[33]發(fā)現(xiàn)了PC患者基因FAM150A、ONECUT1和RASSF10啟動(dòng)子區(qū)CPG島的甲基化狀態(tài)與不良的預(yù)后有關(guān). 外周血液中ctDNA的半衰期一般小于2 h, 因此其濃度能作為一種快速檢測(cè)術(shù)后病人是否有腫瘤殘余的手段, 而DNA甲基化檢測(cè)較基因突變能提高ctDNA的檢出率, 且一些研究表明, 術(shù)后ctDNA陽(yáng)性的患者具有更短的生存時(shí)間[56]. 對(duì)于大部分中晚期腫瘤患者而言, 確診時(shí)已經(jīng)失去難以行根治性手術(shù)治療的機(jī)會(huì), 化學(xué)治療成為了主要的治療方式, 而目前吉西他濱作為PC治療的一線化療藥物, 僅不足25%的患者具有敏感性. Tan[57]的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)吉西他濱可能對(duì)攜帶高甲基化基因GSTM1和ONECU的PC患者具有更高的敏感性. 這一發(fā)現(xiàn)可以使得我們對(duì)部分PC患者的化學(xué)治療效果有更好的預(yù)測(cè). 我們想通過(guò)常規(guī)的影像學(xué)檢查及腫瘤標(biāo)記物了解到患者的治療效果通常至少需要3個(gè)化療周期, 這往往可能延誤了對(duì)藥物不敏感的患者得到其他有效的治療, Mahon等[58]人發(fā)現(xiàn)在前列腺癌患者血漿中的異常甲基化的GSTP1(約存在大于90%的前列腺癌患者中[59])能作為追蹤前列腺癌化療效果的指標(biāo), 該研究對(duì)35名前列腺癌患者進(jìn)行了化療后的隨訪, 發(fā)現(xiàn)在第一次化療后出現(xiàn)甲基化的GSTP1提示前列腺癌仍在進(jìn)展.

雖然目前已經(jīng)進(jìn)行了許多關(guān)于異常DNA甲基化與腫瘤的治療及監(jiān)測(cè)的研究, 并取得了一系列的進(jìn)展, 在許多腫瘤中我們可以持續(xù)性監(jiān)測(cè)患者的治療后ctDNA濃度動(dòng)態(tài)變化, 為后續(xù)的治療提供了更加精準(zhǔn)的判斷和治療措施. 但DNA甲基化在PC治療及預(yù)后判斷中仍存在大量的空白, 而作為一種極具前景的生物標(biāo)記物, 我們?nèi)孕枰罅康难芯考皩?shí)驗(yàn)來(lái)推動(dòng)DNA甲基化在PC治療及預(yù)后判斷中的應(yīng)用.

4 結(jié)論

PC是臨床上常見預(yù)后不良的惡性腫瘤之一. 目前, PC仍缺乏高特異度及靈敏度的早期診斷標(biāo)記物和有效的治療手段. 在PC發(fā)病中, 表觀遺傳學(xué)在控制細(xì)胞行為方面扮演著重要的角色, 并且能在PC的各個(gè)階段中得以檢測(cè), 而外周血中的ctDNA攜帶著腫瘤的基因突變及甲基化改變. 甲基化ctDNA作為表觀遺傳學(xué)與液體活檢技術(shù)的結(jié)合, 具有無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、易獲得的優(yōu)點(diǎn), 并且檢測(cè)敏感性高于基于基因突變的ctDNA, 能查出更微小的病灶, 具有早期診斷的優(yōu)勢(shì), 并且能預(yù)測(cè)腫瘤的預(yù)后、監(jiān)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)及藥物治療效果, 為腫瘤早期診斷、治療提供了新的方向. 但由于ctDNA的在外周血中的含量較少, 難以被檢測(cè)出, 而其中的甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)則更是難上加難, 雖然隨著目前ctDNA的檢測(cè)技術(shù)如二代測(cè)序及ddPCR得到了極大的進(jìn)展, 使得檢出率有所提升, 但是仍然不能滿足我們臨床應(yīng)用的要求. PC的發(fā)病機(jī)制是多基因?qū)用娴? 雖然目前的研究發(fā)現(xiàn)已知的PC中的DNA甲基化的基因位點(diǎn)較多, 但缺乏特異性, 這些甲基化同時(shí)也能在乳腺癌、肺癌、胃癌、大腸癌等腫瘤中被發(fā)現(xiàn). 目前進(jìn)行的PC DNA甲基化的相關(guān)研究大多側(cè)重于單個(gè)基因位點(diǎn)啟動(dòng)子甲基化在PC診斷中的敏感度與特異度研究, 且目前還沒有合適的單個(gè)基因位點(diǎn)能夠作為PC的診斷標(biāo)記物. 同時(shí), 能逆轉(zhuǎn)PC患者某些基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的去甲基化藥物對(duì)于PC的療效尚需大量的研究及臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證. DNA甲基化雖然為我們對(duì)于PC發(fā)病機(jī)制的研究提供了一條線索并且為PC患者提供了早期診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)的可能, 但是仍然缺乏有效的生物標(biāo)記物. 因此今后的研究應(yīng)該更加注重于發(fā)現(xiàn)特異性和敏感性更高的PC診斷標(biāo)記物, 并為PC的早期診斷及治療提供監(jiān)測(cè)手段.