中國寧夏人群HOTAIR單核苷酸多態(tài)性與胃癌易感性的相關(guān)性研究

姚 麗, 馮雅寧, 游顏杰, 羅 明, 辛瑞娟

姚麗, 馮雅寧, 游顏杰, 羅明, 辛瑞娟, 寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 寧夏回族自治區(qū)銀川市 750001

核心提要：在中國寧夏人群中長鏈非編碼RNA HOTAIR Rs920778位點單核苷酸多態(tài)性與胃癌(gastric cancer, GC)的遺傳易感性具有一定程度的聯(lián)系, Rs920778位點的單核苷酸多態(tài)性與男性, 吸煙人群及腫瘤大小大于或等于5 cm的GC患者的GC遺傳易感性高度相關(guān).

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)是世界上死亡率高最常見的惡性腫瘤之一[1]. 最近, GLOBOCAN項目(http：// globocan.iarc.fr)報告稱GC在全球發(fā)病率和死亡率分別位于第五位和第三位[2]. 在亞洲國家尤其是中國, GC的確診病例和每年死亡人數(shù)仍然呈上升趨勢. 盡管有越來越多的證據(jù)表明受環(huán)境因素影響的表觀遺傳/遺傳效應(yīng)和GC病因?qū)W具有顯著聯(lián)系[3]. 然而, 關(guān)于GC發(fā)展的確切機(jī)制仍知之甚少.

長鏈非編碼RNA(lncRNA)具有的生物調(diào)節(jié)功能在廣泛的范圍內(nèi)受到了極大的關(guān)注[4]. 許多研究已經(jīng)證明lncRNA參與癌癥的發(fā)病機(jī)制中, 主要通過介導(dǎo)表觀遺傳修飾, 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄表達(dá)過程以及介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程[5-7]. 在這其中l(wèi)ncRNA HOX轉(zhuǎn)錄反義基因RNA(HOTAIR)在早些時候已經(jīng)被確認(rèn)參與了惡性腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展過程[8]. Gupta等[9]人最初證明HOTAIR在乳腺癌組織中上調(diào)表達(dá), 并與乳腺癌的進(jìn)展有關(guān). 在GC中, HOTAIR表達(dá)水平在腫瘤組織中高度表達(dá)且與患者的臨床表型有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián), 例如侵犯靜脈, 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存預(yù)后情況[10]. 此外, HOTAIR可以募集miR-331-3p, 作為競爭性內(nèi)源RNA以調(diào)節(jié)HER2在GC細(xì)胞中的表達(dá)[11].

最近, 大量研究調(diào)查了lncRNA基因變異, 主要是基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)對癌癥遺傳易感性的影響. lncRNA H19的rs2839698位點最初發(fā)現(xiàn)與降低膀胱癌的風(fēng)險顯著相關(guān)[11,12], lncRNA PCGEM1中的rs6434568位點與增加前列腺癌風(fēng)險有關(guān)[13]. 同時, 有研究指出, HOTAIR中rs7958904位點的SNP對結(jié)腸直腸癌易感性和等位基因特異性細(xì)胞表型在結(jié)腸直腸癌增殖具有保護(hù)作用[14]. 此外, 盡管HOTAIR的SNP rs12826786與賁門腺癌風(fēng)險有關(guān), 但很少有證據(jù)支持HOTAIR SNP對GC易感性和基因功能的遺傳效應(yīng). 因此, 在這項研究中, 我們進(jìn)行了一個病例對照研究來評估中國人群中HOTAIR SNPs與GC風(fēng)險之間的關(guān)聯(lián).

1 材料和方法

1.1 材料 307名健康對照者均來自2008年寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院健康查體門診, 其中男165例, 女142例, 年齡范圍31-81歲, 中位年齡57歲. 全部研究對象均為隨機(jī)選取, 無血緣關(guān)系. 152名GC患者均來自2008/2011年我院消化內(nèi)科GC患者, 其中男88例, 女64例, 年齡范圍37-81歲, 中位年齡61歲.

1.2 方法 DNA抽取： 人外周血白細(xì)胞基因組DNA抽提取對照者或患者靜脈血5 mL, EDTA抗凝, 以QUAGE公司DNA抽提試劑盒抽提血DNA.

基因多態(tài)性分析： 所有的基因多態(tài)性分析均采用Taqman基因分型技術(shù), Pre-designed Taqman SNP基因分型探針購于Applied Biosystems(加州, 美國), PCR引物、探針及Master Mix均購于Applied Biosystems(加州, 美國). 所有的基因分型均在7900HT Fast Real-Time PCR System 384孔板完成. 反應(yīng)體系包括： 2×TaqMan Genotyping Master Mix 2.5 μL, 40×TaqMan SNP Genotyping Assay0.125 μL, 模板DNA 2.5 μL. 質(zhì)控： 每次實驗均設(shè)NTC(no template controls)以及陽性對照.預(yù)讀板后進(jìn)行real-time PCR循環(huán). Real-time PCR的循環(huán)條件為： 50 ℃ 2 min, 95 ℃10 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃1 min; 循環(huán)50次, 之后進(jìn)行后讀板. 結(jié)果采用SDS 2.2 software分析.

統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 16.0 for Windows軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析. 組間均數(shù)比較采用t檢驗,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義. Logistic回歸進(jìn)行危險因素獨立性分析, 其風(fēng)險率用比數(shù)比(odds ratio, OR)和95%CI表示,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 臨床GC患者和健康對照的特點 共有449名年齡和性別匹配的土耳其科目(152名GC患者和307名健康對照)進(jìn)行基因分型探討HOTAIR單核苷酸多態(tài)性與GC易感性的關(guān)系(表1).

2.2 HOTAIR各個基因位點與GC發(fā)病危險關(guān)系分析HOTAIR Rs920778位點基因型TT在病例組和對照組中的頻率分別為26.3%和24.7%, 基因型C/T在兩組中的頻率分別為21.1%和31.3%, 基因型CC在兩組中的頻率分別為52.6%和44.0%. 以基因型CC作為對照, 該位點基因型TT的調(diào)整危險度為1.454(95%CI： 1.069-1.927,P＜0.05).表明HOTAIR Rs920778位點TT基因型在GC患者和健康人群中的分布頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義, (P＜0.05)基因型TT在病例組和健康組中相對于CC基因型為GC發(fā)病的危險因素. 而對于Rs12826786和Rs4759314兩個基因位點與GC發(fā)病危險關(guān)系的結(jié)果并無統(tǒng)計學(xué)意義(表2).

2.3 HOTAIR基因Rs920778位點各基因型不同分層后與GC發(fā)病危險關(guān)系分析 為消除年齡, 性別, 吸煙等混雜因素的影響, 進(jìn)一步對HOTAIR Rs920778位點各基因型按不同的臨床表型進(jìn)行分層分析(表3). 根據(jù)性別將研究人群分為男生和女生兩組, 分析發(fā)現(xiàn), 此位點在男性中基因型TT的OR值為1.865(95%CI： 1.266-2.457,P＜0.05), 為GC的危險因素, 但在女性中無統(tǒng)計學(xué)意義;此外, 根據(jù)吸煙史將人群分為吸煙組和非吸煙組, 可以觀察到, 在吸煙組中Rs920778位點TT基因型的OR值為1.822(95%CI： 1.151-2.458847,P＜0.05), 而在非吸煙組中并沒有得到有意義的結(jié)果; 在依據(jù)腫瘤的大小的人群分組中, 患者腫瘤≥5 cm的人群中HOTAIR Rs920778位點TT基因型OR值為1.429(95%CI： 1.015-2.451,P＜0.05),而在腫瘤≤5 cm的患者中結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義, 最后,Rs920778位點與GC患者的腫瘤家族史因素并無顯著聯(lián)系.

表1 健康人群及胃癌人群的總體情況 n (%)

3 討論

作為一類新型非編碼RNA, lncRNA已經(jīng)吸引了更多的關(guān)注和研究, 特別是在有關(guān)癌癥研究方面. 雖然大多數(shù)lncRNAs的具體功能仍不清楚, 最近的研究已經(jīng)開始闡明了這些分子在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用, 包括分化, 發(fā)育和腫瘤發(fā)生. LncRNAs在廣泛的生物過程中通過與關(guān)鍵組件蛋白質(zhì)的相互作用和參與基因過程包括表觀遺傳調(diào)控, 轉(zhuǎn)錄, 以及mRNA剪接和翻譯等方式對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到了重要的作用.

Guo等[15]人發(fā)現(xiàn)HOTAIR Rs12826786位點T等位基因會增加GC的易感風(fēng)險, 并且Rs12826786位點單核苷酸多態(tài)性會增加HOTAIR在GC中的表達(dá)量, 高表達(dá)的HOTAIR與低分化的GC類型及較差的預(yù)后情況相關(guān). 而Du等[16]人的研究結(jié)果表明, HOTAIR Rs4759314(A＞G)與GC風(fēng)險增加顯著相關(guān), 特別是在老年人和男性人群中.此外, 與AA基因型相比, HOTAIR Rs4759314位點AG基因型可以增加HOTAIR和HOXC11在GC組織中的表達(dá)量. 在本研究中, 在Rs12826786與Rs4759314位點中并沒有得到有意義的結(jié)果, 原因可能是因為地域因素且本研究樣本數(shù)量較少. 但是本研究發(fā)現(xiàn)在HOTAIR Rs920778位點中, TT基因型相對于CC基因型為GC的危險因素.進(jìn)一步的分層分析中發(fā)現(xiàn)此位點與男性, 吸煙人群及腫瘤大小≥5 cm的GC患者的GC遺傳易感性高度相關(guān), 而與年齡因素, 女性, 非吸煙人群, 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況及GC家族史并無顯著聯(lián)系. 這可能與樣本量及研究對象的選擇有關(guān).

表2 HOTAIR中3個基因位點的單核苷酸多態(tài)性與胃癌的遺傳易感相關(guān)性分析n(%)

表3 RS920778位點與胃癌的遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性分析n(%)

1患有基因型的病例患者/具有基因型的對照受試者的數(shù)量.

總之, 在GC的發(fā)生過程中HOTAIR Rs920778位點單核苷酸多態(tài)性可能對GC的易感性產(chǎn)生了一定影響.充分考慮腫瘤多影響因素的復(fù)雜過程, 可為全面了解GC病因提供科學(xué)依據(jù).

文章亮點

實驗背景

胃癌(gastric cancer, GC)是世界上死亡率高最常見的惡性腫瘤之一, 但GC的發(fā)病機(jī)制的討論卻亟待增強(qiáng), 目前關(guān)于基因的單核苷酸多態(tài)性與多種腫瘤的遺傳易感性之前關(guān)系的研究是一個熱門話題.

實驗動機(jī)

本文旨在研究長鏈非編碼RNA與GC易感性的關(guān)聯(lián)性,并進(jìn)一步探究GC的高發(fā)人群中基因單核苷酸多態(tài)性所扮演的角色, 為GC的治療方式提供新的思路.

實驗?zāi)繕?biāo)

探究中國寧夏人群中長鏈非編碼RNA HOTAIR單核苷酸多態(tài)性與GC遺傳易感性的相關(guān)性研究.

實驗方法

本實驗利用隊列研究的優(yōu)勢, 并通過PCR與高通量TaqMan實驗, 分析中國寧夏人群中長鏈非編碼RNA HOTAIR單核苷酸多態(tài)性與GC遺傳易感性的相關(guān)性研究, 并采用多因素回歸分析進(jìn)一步分層討論Rs920778位點各基因型與GC發(fā)病危險關(guān)系分析.

實驗結(jié)果

HOTAIR Rs920778位點基因型TT在病例組和對照組中的頻率分別為26.3%和24.7%, 基因型C/T在兩組中的頻率分別為21.1%和31.3%, 基因型CC在兩組中的頻率分別為52.6%和44.0%, 該位點的TT基因型與GC的遺傳易感性具有顯著聯(lián)系, 結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05). 進(jìn)一步的分層分析中發(fā)現(xiàn)Rs920778位點的單核苷酸多態(tài)性與男性, 吸煙人群及腫瘤大小≥5 cm的GC患者的GC遺傳易感性高度相關(guān).

實驗結(jié)論

中國寧夏人群中HOTAIR Rs920778位點單核苷酸多態(tài)性與GC的遺傳易感性具有一定程度的聯(lián)系.

展望前景

GC的發(fā)生過程中HOTAIR Rs920778位點單核苷酸多態(tài)性可能對GC的易感性產(chǎn)生了一定影響, HOTAIR可能作為GC治療中的一個可能性靶點.