小麥穗部性狀和株高的QTL定位及T6VS·6AL易位效應(yīng)分析

胡文靜，高德榮,，陸成彬，梁秀梅，石宜宗，程順和,

(1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中下游小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇揚(yáng)州 225007； 2.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434023)

迄今，已有諸多國內(nèi)外學(xué)者利用不同的群體對小麥總小穗數(shù)、千粒重、穗粒數(shù)、穗長和株高進(jìn)行了QTL定位[1-6]。但由于穗部性狀間關(guān)系錯綜復(fù)雜，都是受多基因控制的數(shù)量性狀，且受環(huán)境影響較大[7-8]，導(dǎo)致前人在一些穗部性狀的研究上結(jié)果差異較大，很大程度上限制了其在遺傳育種中的應(yīng)用。

穗粒數(shù)是重要的產(chǎn)量構(gòu)成因素，而總小穗數(shù)和每小穗結(jié)實(shí)粒數(shù)共同決定了穗粒數(shù)，因此，通過減少不育小穗數(shù)，并增加穗頂部和基部小穗的結(jié)實(shí)粒數(shù)，可進(jìn)一步增加小麥產(chǎn)量。Ma等[9]利用望水白和南大2419構(gòu)建的RIL群體和IF2群體對小麥穗基部不育小穗數(shù)進(jìn)行了QTL定位，在13個染色體區(qū)段檢測到與基部不育小穗數(shù)相關(guān)的位點(diǎn)。Li等[10]利用川35050和山農(nóng)483構(gòu)建的RIL群體檢測到8個控制不育小穗數(shù)的QTL。Wu等[11]利用旱選10號和魯麥14構(gòu)建的DH群體在不同干旱脅迫條件下檢測到24個控制不育小穗數(shù)的QTL。Xu等[12]利用小偃54和京411構(gòu)建的RIL群體在不同的氮肥和磷肥環(huán)境下檢測到控制不育小穗數(shù)的QTL。Cui等[13]利用溫麥8號和煙農(nóng)19、溫麥8號和濟(jì)麥20構(gòu)建的兩個RIL群體檢測到與可育小穗數(shù)相關(guān)的QTL。株高與小麥產(chǎn)量的提高密切相關(guān)，國內(nèi)外學(xué)者在小麥21條染色體上相繼定位出50多個株高相關(guān)QTL[14-16]，且已經(jīng)命名了27個主效的矮稈基因(Rht)，Rht1、Rht2、Rht3和Rht10分別被克隆[17-18]，其他矮稈基因研究也取得了一定的進(jìn)展[19-21]。目前育種中利用最多的矮稈基因是Rht1、Rht2、Rht8、Rht9和Rht10。

揚(yáng)麥17和揚(yáng)麥18是江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的抗病優(yōu)質(zhì)小麥品種和矮稈大穗白粉病免疫小麥品種，本研究利用揚(yáng)麥17和揚(yáng)麥18創(chuàng)制的206個單株組成的F2群體為材料構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，并結(jié)合F2和F2:3群體的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行小麥穗部性狀和株高QTL定位，以期發(fā)掘新的穗部性狀和株高QTL，為分子標(biāo)記輔助育種提供材料和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

以普通小麥揚(yáng)麥18為父本，揚(yáng)麥17為母本雜交獲得F1代，F(xiàn)1自交得到206株F2植株，F(xiàn)2按單株收種，獲得F2:3群體。揚(yáng)麥18的穗頂部、基部結(jié)實(shí)性狀明顯好于揚(yáng)麥17。簇毛麥( 2n = 14，VV) 種質(zhì)來自英國劍橋植物園?？剐怨w南農(nóng)P045是由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所培育的T6VS·6AL抗白粉病易位系(含PM21)。

1.1.2 引物

所用的2 403對SSR引物可覆蓋小麥全基因組，全部由農(nóng)業(yè)部長江中下游小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗室(江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所)提供，由上海捷瑞生物有限公司合成。其引物序列和退火溫度通過GrainGenes數(shù)據(jù)庫或Somers 等(2004)公布的遺傳圖譜可查。

1.2 方 法

1.2.1 田間試驗和表型調(diào)查

親本材料、F2及其F2:3家系分別于2015-2016年度、2016-2017年度種植于江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所灣頭基地試驗田。其中，F(xiàn)2群體按單株種植；F2:3家系按株行種植，2次重復(fù)；行長1.3 m，行距35 cm，每行點(diǎn)播30粒，栽培管理同大田生產(chǎn)，小麥生長季未見嚴(yán)重病蟲害和倒伏。

2016和2017年分別于小麥灌漿后期調(diào)查主莖的穗粒數(shù)、總小穗數(shù)、不育小穗數(shù)、穗頂部結(jié)實(shí)粒數(shù)、穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)、穗長和株高。其中，穗頂部結(jié)實(shí)粒數(shù)為頂部第一小穗、第二小穗和第三小穗結(jié)實(shí)粒數(shù)之和；穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)為基部第一小穗、第二小穗和第三小穗結(jié)實(shí)粒數(shù)之和。親本P1和P2分別調(diào)查50株；F2群體調(diào)查每個單株；F2:3群體按株行調(diào)查，每行隨機(jī)選取10株，取平均值，并調(diào)查2個重復(fù)。

教學(xué)中筆者發(fā)現(xiàn)，學(xué)生對1平方分米的表象往往停留在邊長為1分米的小正方形上，觀察后感悟:原來1平方分米不一定是邊長1分米的正方形，可以是相應(yīng)的其他圖形。這一做法幫助學(xué)生突破思維定勢，發(fā)展面積守恒觀念。

1.2.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

取親本和F2群體的苗期葉片，采用常規(guī)CTAB法提取DNA，PCR體系與程序參考Taq酶(北京天根生化科技有限公司)說明書，循環(huán)數(shù)35，延伸時間為45 s，退火溫度取決于不同引物。采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，銀染檢測，觀察記錄結(jié)果并拍照保存。F2群體苗期用能夠追蹤T6VS·6AL易位染色體的6V染色體短臂末端共顯性標(biāo)記MBH1[22]進(jìn)行鑒定，其正向引物序列為5′-GCCATTATAGTCAAGAGTGCACTAGCTGT-3′，反向引物序列為5′-AGCTCCTCTCGTTCTCCAATGCT-3。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

用 Microsoft Excel 2013對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 22.0對親本的穗部相關(guān)性狀和株高進(jìn)行獨(dú)立樣本t測驗，并同時對 F2和 F2:3群體中所調(diào)查的性狀進(jìn)行統(tǒng)計和相關(guān)性分析。

1.2.4 連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL分析

利用JoinMap 4.0軟件并采用Kosambi函數(shù)構(gòu)建遺傳圖譜，用WinQTLCart 2.5軟件選擇復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL定位分析[23]，若LOD值>2.5，就認(rèn)為該處存在一個有效的QTL，同時分析其加性效應(yīng)和貢獻(xiàn)率。以“Q+性狀名稱縮寫+群體英文縮寫+染色體名稱+QTL次序”[24]對QTL進(jìn)行命名。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀及相關(guān)性分析

由表1可知，除總小穗數(shù)外，揚(yáng)麥17與揚(yáng)麥18在穗部相關(guān)性狀和株高上均具有顯著或極顯著差異。其中，揚(yáng)麥18的穗頂部結(jié)實(shí)粒數(shù)、穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)和穗粒數(shù)在表型上屬于高值親本，而揚(yáng)麥17的總小穗數(shù)、不育小穗數(shù)和株高在表型上屬于高值親本。此外，穗長性狀表現(xiàn)為揚(yáng)麥17<揚(yáng)麥18。F2:3群體中的偏度和峰度的絕對值都小于1，即滿足正態(tài)分布。同時，各性狀存在明顯的雙向超親分離現(xiàn)象，表明均為多基因控制的數(shù)量性狀。

相關(guān)性分析結(jié)果(表2)表明，在揚(yáng)麥17/揚(yáng)麥18的F2:3群體中，穗粒數(shù)與不育小穗數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與總小穗數(shù)、穗頂部結(jié)實(shí)粒數(shù)、穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)以及穗長均呈極顯著正相關(guān)，與株高呈顯著正相關(guān)；穗頂部、基部結(jié)實(shí)粒數(shù)與不育小穗數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，尤其穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)與不育小穗數(shù)之間呈高度負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明，不育小穗數(shù)的減少，穗頂部結(jié)實(shí)粒數(shù)、穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)、穗長以及總小穗數(shù)的增加，均有利于穗粒數(shù)的增加。

2.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

表1 揚(yáng)麥17/揚(yáng)麥18的F2:3群體穗部性狀和株高的變異Table 1 Phenotypic variation of spike traits and plant height in the F2:3 population of Yangmai 17/Yangmai 18

GNS:Grain number per spike; TSS:Total spikelet number per spike; SSS:Sterile spikelets; GNAS:Grain number in top spikelet;GNBS:Grain number in basal spikelet; SL:Spike length; PH:Plant height.The same in tables 2-4.

** 表示與揚(yáng)麥17的差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

** indicates the difference reached to the extremely significant level compared with Yangmai 17(P<0.01).

表2 揚(yáng)麥17/揚(yáng)麥18F2:3群體中穗部各性狀之間的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients for all traits in the F2:3 population of Yangmai 17/Yangmai 18

*和** 分別表示相關(guān)性達(dá)到顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平。

*and ** indicate the correlation reaching the significant level at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

2.3 QTL定位分析

基于復(fù)合區(qū)間作圖法，共定位到15個控制穗部性狀和株高的QTL，分布在2B、2D、4B、5A、5B、7A染色體上(圖1和表3)。

圖1 (揚(yáng)麥17/揚(yáng)麥18)F2和F2:3群體穗部性狀和株高QTL在染色體上的分布

2.3.1 穗部性狀QTL

1個控制穗粒數(shù)的QTL位于5B染色體上的Xgpw4483～Xgpw4478標(biāo)記之間，僅能在F2代檢測到，可解釋9.92%的表型變異，其增效等位基因來自揚(yáng)麥18。3個控制總小穗數(shù)的QTL分別位于2B和5B染色體上，僅在F2:3代被檢測到。其中，QTss-YY-5B位于Xgdm3～Xgpw7180之間，表型變異解釋率為7.28%，增效基因來源于揚(yáng)麥17；QTss-YY-2B.1和QTss-YY-2B.2分別位于Xgwm429～Xmag3635和Xgwm148～Xgpw4347之間，兩個QTL的峰值在20 cM以內(nèi)，推測是相同QTL，表型變異解釋率分別為6.77%和9.21%，增效等位基因均來自揚(yáng)麥18。2個控制不育小穗數(shù)的QTL均位于2B染色體上，僅在F2:3代檢測到，分別位于Xgwm120～Xgpw4112和Xgpw4112～Xgwm501之間，Xgpw4112是二者共同緊密連鎖的分子標(biāo)記，兩個QTL的峰值在20 cM以內(nèi)，推測是相同QTL，QTL表型變異解釋率分別為7.05%和7.65%，增效等位基因均來自揚(yáng)麥18。1個控制穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)的QTL位于5B染色體上，位于Xgpw4483～Xgpw4478之間，僅在F2代檢測到，表型變異解釋率為6.43%，增效等位基因來源于揚(yáng)麥18。未能檢測到控制穗頂部結(jié)實(shí)粒數(shù)及其構(gòu)成性狀的QTL。

表3 揚(yáng)麥17/揚(yáng)麥18 F2和F2:3群體穗部性狀以及株高的QTL定位結(jié)果Table 3 QTLs for spike traits and plant height in the F2 and F2:3 populations of Yangmai 17/Yangmai 18

加性效應(yīng)值中，正值表示增效基因來自揚(yáng)麥17，負(fù)值表示增效基因來自揚(yáng)麥18。

Positive additive effect values indicate increased effects from Yangmai 17,and negative additive effect values indicate increased effects from Yangmai 18.

5個與穗長相關(guān)的QTL分別位于2B、2D、5A和7A(2)染色體上。其中，QSl-YY-7A.1、QSl-YY-7A.2分別位于Xpsp3050～Xgpw7386和Xgpw2119～Xmag794之間，僅在F2代檢測到，兩個QTL的峰值在20 cM以內(nèi)，推測是相同QTL，表型變異解釋率分別為7.39%和6.32%，增效等位基因均來自揚(yáng)麥17；QSl-YY-2B位于Xgwm429～Xmag3635之間，僅在F2:3代下檢測到，表型變異解釋率為5.98%，增效等位基因來源于揚(yáng)麥18；QSl-YY-2D和QSl-YY-5A在兩代中均能被檢測到，前者在兩代中都位于Xcfd53～Xgwm261之間，表型變異解釋率分別為9.71%和10.43%，增效等位基因均來自揚(yáng)麥17，后者在兩世代中分別位于Xgpw7007～Xwmc327、Xwmc327～Xbarc1182之間，表型變異解釋率分別為7.99%和11.84%，增效等位基因均來自揚(yáng)麥18。

2.3.2 株高QTL

3個控制株高的QTL被定位在2D、4B和5A染色體上。其中，QPh-YY-2D和QPh-YY-4B分別位于Xcfd53～Xgwm261和Xbarc1096～Xgpw4335之間，在兩世代中均被檢出，表型變異解釋率分別為1.93%和20.78%，增效等位基因均來自揚(yáng)麥17；QPh-YY-5A位于Xwmc327～Xbarc1182之間，僅能在F2代中檢測到，表型變異解釋率為3.84%，增效等位基因來自揚(yáng)麥18。

2.4 小麥-簇毛麥易位染色體T6VS·6AL在F2群體中的傳遞及對小麥穗部性狀的影響

表4 兩世代中含有純合T6VS·6AL、雜合T6VS·6AL和不含T6VS·6AL的個體間穗部性狀比較Table 4 Comparison of spike traits among homologous T6VS·6AL,heterozygous T6VS·6AL and non T6VS·6AL subgroups in two generations

*表示兩世代中含有純合T6VS·6AL與不含T6VS·6AL類群間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

* indicates the difference between homologous T6VS·6AL and non T6VS·6AL subgroups in two generations reaching a significant level(P<0.05).

3 討 論

3.1 QTL位點(diǎn)的一致性

本研究結(jié)果表明，穗長QTL分別位于2D、5A、7A和2B上， 增效等位基因QSl-YY-2D位于Xcfd53和Xgwm261之間，這與Heidari等[25]和Sourdille等[1]的研究結(jié)果一致；增效等位基因QSl-YY-5A位于Xbarc327～Xbarc1182之間，與Liu等[26]檢測到與穗長相關(guān)的QTLQSL-5A.2所屬區(qū)段相同，推測是同一QTL；在7A上檢測到的穗長QTL與前人報道[26-27]相距較遠(yuǎn)，推測是一個新的QTL；QSl-YY-2B所屬標(biāo)記區(qū)間Xgwm429～Xmag3635位于2BS上，標(biāo)記Xgwm429落在侯立江[28]定位到的Qsl2B區(qū)段內(nèi)，但是因為另一標(biāo)記不在此區(qū)段，因此無法推斷是否是同一QTL。

株高QTL分別位于2D、4B和5A上，QPh-YY-2D位于Xcfd53～Xgwm261區(qū)段內(nèi)，增效等位基因來自揚(yáng)麥17，已有報道顯示Xgwm261可以作為2DS上矮稈基因Rht8的特異分子標(biāo)記[29]，推測此QTL是Rht8。QPh-YY-4B位于Xbarc1096～Xgpw4335區(qū)段內(nèi)，F(xiàn)2:3代表型貢獻(xiàn)率達(dá)到20.78%，增效基因來自揚(yáng)麥17，經(jīng)過與中國春(CS)V1.0 版本參考基因組(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)比對發(fā)現(xiàn)該QTL位于4BL上，與已報道4BS上矮稈基因Rht-B1b的物理位置相距較遠(yuǎn)，推測此處是一個新的矮稈QTL。QPh-YY-5A位于Xwmc327～Xbarc1182區(qū)段內(nèi)，增效基因來自揚(yáng)麥18，與Gao等[30]報道的5AS上株高QTL位置不同，與已知矮稈基因Rht12相距較遠(yuǎn)[31]，推測是一個新的株高QTL。

總小穗數(shù)QTLQTss-YY-2B.1位于Xgwm429～Xmag3635區(qū)段，增效等位基因來自揚(yáng)麥18，此QTL與梁秀梅等[32]檢測到的總小穗數(shù)QTLQTSS-2B區(qū)段具有共同分子標(biāo)記Xgwm429，推測是同一QTL。另一總小穗數(shù)QTLQTss-YY-5B，表型貢獻(xiàn)率7.28%，增效基因來自揚(yáng)麥17，所屬區(qū)段為Xgdm3～Xgpw7180，未見前人報道。

5B長臂末端同時定位到穗粒數(shù)和穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)QTL，增效等位基因均來自揚(yáng)麥18，標(biāo)記區(qū)間為Xgpw4483～Xgpw4478，這與王健勝[33]定位到的控制穗粒數(shù)的QTLQGns.wa-5B.e3所屬標(biāo)記區(qū)段位置相近[27]，推測是同一QTL。有關(guān)穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)QTL研究罕見，已知梁秀梅等[32]在3D上檢測到穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)QTLQGnbs-YN-3D，其他未見報道，因此本研究定位到的QGnbs-YY-5B是一個新的穗粒數(shù)QTL。

3.2 QTL 位點(diǎn)的表型貢獻(xiàn)率和穩(wěn)定性

定位結(jié)果顯示大多數(shù)穗部性狀QTL的貢獻(xiàn)率較低，只有QSl-YY-2D、QSl-YY-5A、QPh-YY-2D和QPh-YY-4B能夠同時在兩世代中被檢測到，其他位點(diǎn)只能在單一世代被檢測到，而QPh-YY-2D在F2:3世代表型貢獻(xiàn)率達(dá)到20.78%，F(xiàn)2代表型貢獻(xiàn)率只有4.9%。這是因為穗部性狀大都屬于數(shù)量遺傳性狀，由微效多基因控制，且受環(huán)境影響，并且供試群體F2和F2:3屬于低世代臨時性群體，表型調(diào)查誤差大，導(dǎo)致大多數(shù)穗部性狀在不同世代中檢測到的QTL有差異。我們后續(xù)會增加重組自交系群體多環(huán)境試點(diǎn)以提高結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，尋找在不同環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá)的穗部相關(guān)性狀QTL。

3.3 QTL位點(diǎn)的“一因多效性”或者緊密連鎖

相關(guān)性狀的QTL往往存在于相同或相近染色體區(qū)，表現(xiàn)出“一因多效”或緊密連鎖效應(yīng)，通過不同性狀的QTL同時定位可以在一定程度上解釋復(fù)雜性狀及其構(gòu)成要素或相關(guān)性狀之間的關(guān)系，也在一定程度上證明了該位點(diǎn)的穩(wěn)定性。本研究在2D、5A染色體同一區(qū)段發(fā)現(xiàn)了控制穗長和株高的QTL，在5B染色體同一區(qū)段發(fā)現(xiàn)控制穗粒數(shù)和穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)的QTL，在2B染色體相近區(qū)段發(fā)現(xiàn)控制總小穗數(shù)和穗長的QTL。利用這些“一因多效”或者緊密連鎖的QTL，結(jié)合穩(wěn)定表達(dá)的位點(diǎn)，通過回交和分子標(biāo)記輔助選擇，可同時聚合不同位點(diǎn)上控制多個性狀的等位基因，從而創(chuàng)制出優(yōu)異的小麥種質(zhì)資源。

3.4 T6VS·6AL易位系的遺傳效應(yīng)

李桂萍等[34]的研究結(jié)果表明，T6VS·6AL易位染色體對后代的穗長和千粒重表現(xiàn)出一定的正向效應(yīng)，對其他產(chǎn)量構(gòu)成要素及產(chǎn)量沒有表現(xiàn)出明顯的影響。本研究供試親本揚(yáng)麥18與揚(yáng)麥17雜交后獲得的F2代中T6VS·6AL類群的穗頂部結(jié)實(shí)粒數(shù)顯著高于非T6VS·6AL類群，而穗長、穗粒數(shù)和穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)在兩個類群之間無顯著差異，與以往的報道不完全一致，這是因為外源染色體導(dǎo)入小麥背景后產(chǎn)生的遺傳效應(yīng)有可能受小麥不同遺傳背景、不同世代的影響。

F2代中，含有純合T6VS·6AL類群的穗長、穗粒數(shù)、穗頂部結(jié)實(shí)粒數(shù)最高，含雜合T6VS·6AL類群的穗長、穗粒數(shù)、穗頂部結(jié)實(shí)粒數(shù)和穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)均高于另兩個類群的平均值，不含T6VS·6AL類群的穗長、穗粒數(shù)、穗頂部結(jié)實(shí)粒數(shù)和穗基部結(jié)實(shí)粒數(shù)最低。而F2:3代中含有純合T6VS·6AL類群的穗長、穗粒數(shù)最高，含雜合T6VS·6AL類群的穗長、穗粒數(shù)均高于另兩個類群的平均值，初步推測6VS上攜帶有增加穗長、穗粒數(shù)的基因，且為部分顯性。由于研究所用的群體為尚未穩(wěn)定的分離群體，特別是F2群體缺少生物學(xué)重復(fù)鑒定，因此本研究獲得的有關(guān)T6VS·6AL對產(chǎn)量性狀的效應(yīng)還需進(jìn)一步利用穩(wěn)定的重組自交系群體通過多年多點(diǎn)試驗進(jìn)行驗證。

致謝：感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所夏先春研究員在 KASP 基因分型方面提供的技術(shù)支持！