節(jié)律相關(guān)基因CRY2、ARNTL多態(tài)性與選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑療效的關(guān)聯(lián)研究

馬惠瑩 徐一凡 劉志芬 胡曉東 孫寧 李忻蓉 王彥芳 張克讓○☆

重性抑郁障礙（major depressive disorder，MDD）是一種常見的高遺傳度復(fù)雜疾病，目前已成為全球第二大致殘疾病[1]。既往大量研究表明，生物節(jié)律紊亂會使重性抑郁障礙發(fā)病風(fēng)險升高，并且睡眠—覺醒周期紊亂、情緒改變、晨重暮輕等是重性抑郁障礙患者常見臨床癥狀，而以重建生物節(jié)律為目標(biāo)的睡眠剝奪療法、光照療法等可在短時間內(nèi)改善抑郁癥狀[2-4]。眾多周期性表達的節(jié)律性基因是生物節(jié)律形成和維持的基礎(chǔ)[5]。在節(jié)律性基因振蕩反饋的控制環(huán)路中，隱花色素2基因（cryptochrome 2,CRY2）及芳烴核受體類轉(zhuǎn)運體基因（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocatorlike，ARNTL）產(chǎn)物作為起始激發(fā)和反饋抑制的重要組成部分，有著不可替代的作用[6]。目前基礎(chǔ)及臨床研究均發(fā)現(xiàn)CRY2及ARNTL基因多態(tài)性與抑郁障礙發(fā)病[7-9]及臨床癥狀[10-11]有關(guān)，但未見關(guān)于此二基因多態(tài)性與臨床常見抗抑郁藥療效及副反應(yīng)關(guān)聯(lián)的研究報道。本研究以中國漢族重性抑郁障礙患者為研究對象，對節(jié)律性基因CRY2 rs10838524位點及ARNTL rs2278749位點多態(tài)性與5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs）療效、副反應(yīng)及臨床癥狀的關(guān)聯(lián)性進行探討，試圖尋找相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記，并為個體化抗抑郁治療提供生物學(xué)預(yù)測指標(biāo)。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2015年4月至2017年8月山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院精神衛(wèi)生科門診及住院重性抑郁障礙患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～65歲，漢族，性別不限；②符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition,DSM-Ⅳ）重性抑郁障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過簡明國際神經(jīng)精神訪談問卷 （Mini-International Neuropsychiatric Interview,MINI）證實診斷；③首發(fā)、復(fù)發(fā)均可，從未或近14 d未使用抗抑郁藥物治療；④17項漢密爾頓抑郁量表（17-item Hamilton depression scale，HAMD17）總分≥17。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有嚴(yán)重的心、肝、腦、腎等器質(zhì)性疾病，遺傳性疾病，或患有其他精神障礙者；②妊娠期或哺乳期女性；③有嚴(yán)重消極自殺觀念者；③對SSRIs類藥物過敏者。共收集537例患者，其中完成6周SSRIs抗抑郁治療者319例，脫落218例（其中失訪者85例，因不能耐受藥物不良反應(yīng)而退出者63例，未規(guī)律服藥及自行停藥者29例，合并使用抗精神病藥物者15例，治療過程中伴發(fā)軀體疾病者26例）。

本研究獲山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1藥物治療 患者入組后給予一種SSRIs類抗抑郁藥物（包括艾司西酞普蘭、西酞普蘭、帕羅西汀、舍曲林、氟西?。┲委?周。以每種藥物的最低治療劑量為初始劑量：艾司西酞普蘭10 mg/d，西酞普蘭20 mg/d，帕羅西汀20 mg/d，舍曲林片50 mg/d，氟西汀片20 mg/d。2周內(nèi)增至治療量，根據(jù)患者病情可酌情增減劑量?？珊喜⑹褂帽蕉愃幬铮缓喜⑹褂闷渌挂钟羲幬?、抗精神病藥及情感穩(wěn)定劑。

1.2.2量表評估 使用一般情況問卷收集患者性別、年齡、婚姻、家族史等資料。采用HAMD17量表評估患者臨床癥狀和療效，該量表由焦慮/軀體化、阻滯、睡眠障礙、Maier、體重、核心、認(rèn)知障礙等7種癥狀群因子構(gòu)成。用不良反應(yīng)量表（treatment emergent symptom scale，TESS） 或 UKU 副作用評定量表（UKU side effect rating scale，UKU）評估治療過程中副反應(yīng)的發(fā)生情況，其中358例患者使用TESS量表進行評估，179例患者使用UKU量表進行評估。本研究在基線、治療第2周末、第4周末及第6周末評估患者的抑郁嚴(yán)重程度和副反應(yīng)情況。由2名專業(yè)心理測量師進行量表評估，HAMD17、UKU、TESS一致性檢驗Kappa值分別為0.81、0.76、0.68（對 100 名患者評估所得）。

1.2.3療效評定 以第6周末HAMD17總分減分率作為療效評價指標(biāo)，總分減分率≥50%為有效，＜50%為無效。減分率=（基線總分-治療后總分）/基線總分×100%。

1.2.4基因型檢測 所有受試者采集肘靜脈血5 mL，酚氯仿法提取DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和PCR產(chǎn)物直接測序法，對CRY2 rs10838524位點及ARNTL rs2278749位點進行基因分型。使用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，引物由深圳華大基因公司合成。rs10838524上游引物 5’-AGCTTCTTC TAGAAGCAGGC-3’， 下游引物 5’-CCTGAACAG GACGTGGGTAA-3’；rs2278749上游引物 5’-GCG ATTGGTGGGCGGGGGGC-3’，下游引物 5’-CGGG CCTGGGCCGGCGGGGA-3’。PCR反應(yīng)體系為25μL，含有 60 ng DNA，2.5 μL dNTPs（2 mmol/L）。 PCR擴增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。使用美國ABI PRISM 3700DNA自動測序儀，利用雙脫氧核苷酸末端終止法進行PCR產(chǎn)物的序列分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗進行Hardy-Weinberg（HW）遺傳平衡吻合度檢驗。治療有效組與無效組間一般資料比較采用獨立樣本t檢驗或χ2檢驗；兩組間基因型分布比較及不同基因型患者間副反應(yīng)發(fā)生情況比較采用χ2檢驗；不同基因型患者間基線期HAMD17各因子得分比較，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以假陽性錯誤率（false discovery rate，F(xiàn)DR）法對結(jié)果進行多重校正。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 社會人口學(xué)特征和臨床資料完成治療的319例患者中，268例治療有效 （84.0%），51例無效（16.0%）。在年齡、性別、婚姻狀況、家族史、基線期HAMD17總分方面，治療有效組和無效組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。有效組6周末HAMD17總分低于無效組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.540，P＜0.001）。 見表 1。

2.2 遺傳平衡吻合度檢驗本研究對象中CRY2基因rs10838524位點（χ2=0.218，P=0.897）及ARNTL基因rs2278749位點（χ2=0.004，P=0.998）的基因型分布均符合H-W遺傳平衡（P＞0.05）。

2.3CRY2基因rs10838524位點及ARNTL基因rs2278749位點多態(tài)性在治療有效組與無效組之間，CRY2基因rs10838524位點及ARNTL基因rs2278749位點各基因型分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表 2。

表1 SSRIs抗抑郁治療有效與無效組社會人口學(xué)特征和臨床資料

表2 SSRIs抗抑郁治療有效組與無效組各基因型分布

2.4各基因型患者基線期抑郁癥狀CRY2基因rs10838524位點各基因型患者基線期HAMD17總分及各因子分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ARNTL基因rs2278749位點各基因型患者基線期HAMD17總分及各因子分差異也無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。見表3。

2.5 各基因型患者SSRIs治療過程中副反應(yīng)治療過程中出現(xiàn)的副反應(yīng)主要集中在消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)及植物神經(jīng)系統(tǒng)，多數(shù)為輕度，少數(shù)為中度，未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)。ARNTL基因rs2278749CT+TT基因型患者相對于CC基因型更易發(fā)生腹瀉 （χ2=4.725， 校正后P=0.042，OR=1.91,95%CI:1.06 ～3.45）及頭暈（χ2=4.288，校正后P=0.048,OR=1.55， 95%CI:1.02～2.35）副反應(yīng)。未發(fā)現(xiàn)CRY2基因rs10838524位點各基因型患者發(fā)生副反應(yīng)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

3 討論

生物節(jié)律存在于地球上幾乎所有生物體中，是生物體適應(yīng)外界環(huán)境和自我保護的重要機制[12-13]。在人體中，受周期性信號的刺激，生物節(jié)律基因經(jīng)過層級信號傳遞形成周期性振蕩的反饋控制環(huán)路[14]，而基礎(chǔ)研究表明CRY2基因與ARNTL基因在反饋控制環(huán)路的形成與振蕩中起著重要作用[15-16]。在環(huán)路起始，由ARNTL基因轉(zhuǎn)錄翻譯形成異質(zhì)二聚體，激活CRY2等基因轉(zhuǎn)錄翻譯，并進一步激活下游基因形成層級擴大的轉(zhuǎn)錄翻譯事件，而CRY2基因轉(zhuǎn)錄翻譯形成的大量異質(zhì)二聚體又會逆向抑制ARNTL基因激活，進而減弱CRY2等基因激活，最終形成反饋控制環(huán)路[6]。

CRY2和ARNTL基因分別位于人類11號染色體的長臂11p11和11p15。目前在此二基因多態(tài)性與抑郁障礙關(guān)聯(lián)性的研究報道中，關(guān)于CRY2 rs10838524位點及ARNTL rs2278749位點的研究較多。動物實驗發(fā)現(xiàn)，抑郁模型小鼠的CRY2基因表達顯著降低[17-19]。在針對高加索人群的研究中發(fā)現(xiàn)，CRY2 rs10838524位點A等位基因很可能是抑郁障礙發(fā)病的危險因子[20-22]，ARNTL rs2278749位點多態(tài)性與晝夜紊亂癥狀及抑郁障礙發(fā)病均具有顯著關(guān)聯(lián)性[23-24]。但目前并未發(fā)現(xiàn)此二基因多態(tài)性與臨床常見抗抑郁藥療效及副反應(yīng)的關(guān)聯(lián)研究報道，僅有2010年LAVEBRATT等[7]在臨床研究中，根據(jù)睡眠剝奪治療后CRY2mRNA水平的變化，提出CRY2基因多態(tài)性可能是反映抗抑郁療效的特征性標(biāo)志。

表3各基因型患者基線期HAMD17各因子得分

表4各基因型患者發(fā)生副反應(yīng)情況

基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，臨床常用抗抑郁劑SSRIs所作用的5-羥色胺系統(tǒng)，與生物節(jié)律系統(tǒng)及情感障礙相關(guān)的神經(jīng)回路，在解剖學(xué)和分子水平上廣泛聯(lián)系，并且這些系統(tǒng)在情緒和生理行為的調(diào)節(jié)上可能相互融合[4,25]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，以氟西汀、氟伏沙明為代表的SSRIs類抗抑郁藥物很可能是通過調(diào)控生物節(jié)律而發(fā)揮抗抑郁療效[26-27]。該結(jié)論曾在日本人群中得到證實[26]，但尚未在中國人群中發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。

本研究以中國漢族重性抑郁障礙患者為研究對象，通過6周的SSRIs抗抑郁治療，試圖探究CRY2rs10838524位點及ARNTLrs2278749位點多態(tài)性與SSRIs抗抑郁療效的關(guān)聯(lián)性。然而在6周末治療有效組與無效組之間，CRY2rs10838524位點及ARNTLrs2278749位點各基因型分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），這提示CRY2 rs10838524位點及ARNTL rs2278749位點多態(tài)性與中國漢族重性抑郁障礙患者SSRIs抗抑郁療效可能無關(guān)。但本研究中合并用藥、軀體合并癥、不耐受副反應(yīng)及患者依從性等因素造成較高的脫落率，會對研究結(jié)果的穩(wěn)定性造成一定影響，并且本研究并未依據(jù)患者年齡、性別進行分層分析，也并未排除環(huán)境影響、交互作用等混雜因素，因此本研究關(guān)于相關(guān)基因多態(tài)性與療效關(guān)系的結(jié)論，仍需未來在更大樣本量及盡可能純化樣本的基礎(chǔ)上進一步研究證實。2015年SAVALLI等[19]通過對小鼠行為觀察發(fā)現(xiàn)節(jié)律性基因可能與抗抑郁劑的長期療效相關(guān)，而本研究較短觀察期或許無法揭示節(jié)律性基因與長期療效的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)節(jié)律相關(guān)基因CRY2 rs10838524位點及ARNTL rs2278749位點多態(tài)性可能與重性抑郁障礙的焦慮/軀體化癥狀、阻滯癥狀、睡眠障礙癥狀、Maier癥狀、體重減輕癥狀、核心癥狀、認(rèn)知障礙癥狀無關(guān)。由于HAMD17量表評估內(nèi)容的限制，未對睡眠紊亂及晝夜變化癥狀進行深入分析，或許是造成本研究與既往研究結(jié)果不一致的原因。ARNTL基因rs2278749位點多態(tài)性可能與使用SSRIs抗抑郁治療過程中是否出現(xiàn)腹瀉及頭暈副反應(yīng)有關(guān)，其中攜帶T等位基因的患者風(fēng)險較高。CRY2基因rs10838524位點多態(tài)性可能與使用SSRIs抗抑郁治療過程中出現(xiàn)的副反應(yīng)無關(guān)。上述結(jié)果可為將來深入研究個體化及精準(zhǔn)化的抗抑郁治療提供部分理論依據(jù)。

本研究不足之處在于脫落率較高，數(shù)據(jù)收集不充分，分組后例數(shù)過少，隨訪時間較短，未能觀察長期療效，以及療效的穩(wěn)定性及其與相關(guān)基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性仍需繼續(xù)觀察，因此對本研究療效結(jié)果的推斷仍應(yīng)謹(jǐn)慎。并且本研究也未考慮到基因的連鎖不平衡、基因交互作用及基因與環(huán)境之間的交互作用。未來應(yīng)在擴大樣本量、充分收集數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進行深入研究，以進一步證實本研究的結(jié)論。