維生素D受體啟動(dòng)子DNA異常甲基化水平與視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病的關(guān)系☆

牟茂 徐竹 賀電 邵冰 吳欽華 蒙延筱 朱俊羽 楚蘭○☆

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病 （neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD）是自身免疫介導(dǎo)的主要累及視神經(jīng)和脊髓的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾?。╥nflammatory demyelination diseases in central nervous system，IDDCNS）[1]。 病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前越來(lái)越多的研究提示表觀遺傳在IDDCNS的發(fā)病中也起著關(guān)鍵作用，特別是作為表觀遺傳最具有代表性的DNA甲基化[2-3]。有研究顯示，維生素 D（vitamin D，VD）可以從表觀遺傳學(xué)影響 IDDCNS的發(fā)病[4]。VD除了熟知的調(diào)節(jié)鈣磷代謝外，在維持固有免疫和獲得性免疫功能平衡中也起著不可忽視的作用[5-8]。NMOSD的發(fā)病機(jī)制之一為免疫平衡被打破，鑒于VD具有調(diào)節(jié)免疫平衡的作用，對(duì)缺乏VD的NMOSD患者單獨(dú)補(bǔ)充VD后，卻發(fā)現(xiàn)不能對(duì)疾病起到很好的保護(hù)作用[9]。針對(duì)臨床上遇到的問(wèn)題，有必要對(duì)介導(dǎo)VD發(fā)揮生物學(xué)作用的VDR進(jìn)行研究，近年來(lái)關(guān)于VDR DNA的研究多集中在基因多態(tài)性上，目前尚未見(jiàn)到關(guān)于NMOSD VDR啟動(dòng)子DNA甲基化的研究?；谝陨显颍覀冏龀鋈缦聦?shí)驗(yàn)：通過(guò)亞硫酸氫鹽測(cè)序法對(duì)NMOSD患者VDR啟動(dòng)子DNA甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，并探討VDR啟動(dòng)子DNA甲基化狀態(tài)與NMOSD及其殘疾程度的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象收集2017年7月至2018年10月就診于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的NMOSD患者作為研究對(duì)象。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合2015年國(guó)際NMO診斷小組修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；②在入組前2個(gè)月內(nèi)未補(bǔ)充VD的NMOSD患者；③采集標(biāo)本前2個(gè)月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑的NMOSD患者；④年齡18至70歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他系統(tǒng)性自身免疫性疾病如甲狀腺疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等；②顱內(nèi)感染或其他感染性疾病急性期；③骨代謝異常的患者。

納入我院體檢中心體檢的年齡、性別相匹配的健康人群作為健康對(duì)照組。該研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有研究均經(jīng)過(guò)患者同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1DNA及RNA提取 所有研究對(duì)象于清晨空腹采集5 mL乙二胺四乙酸 （EDTA）抗凝血，分別用核酸磁珠提取試劑盒（海貍，中國(guó)）及Trizol法提取PBMC中的DNA及總RNA。

1.2.2亞硫酸氫鹽測(cè)序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）檢測(cè)VDR啟動(dòng)子 DNA甲基化水平取 200～500 ng DNA 用 EZ DNA Methylation Direct試劑盒（Zymo Research，美國(guó)）進(jìn)行亞硫氫酸鹽處理，取經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后的DNA用巢氏PCR擴(kuò)增，引物序列及退火溫度見(jiàn)表1。取擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體（Promega，美國(guó)）連接后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆，每個(gè)樣本挑選10個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序由上海生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-QPCR）檢測(cè)VDR mRNA表達(dá) 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板在ViiA7Dx實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI，美國(guó)）中檢測(cè)VDR mRNA表達(dá)。引物序列及退火溫度見(jiàn)表1。

表1 引物序列及退火溫度

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。NMOSD及其疾病殘疾程度危險(xiǎn)因素分析用logistic回歸模型。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料本研究共納入急性期NMOSD患者39 例，男 11 例，女 28 例，平均年齡（37.1±2.1）歲?；颊?EDSS 評(píng)分在 1～6.5 分之間，平均（2.4±1.8）分。健康對(duì)照組16例，男6例，女10例，平均年齡（35.2±2.9）歲。 兩組性別（P=0.78）、年齡（P=0.63）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

根據(jù)EDSS評(píng)分將NMOSD組分為輕度組（EDSS≤2.5分，28 例）和中重度組（EDSS＞2.5 分，11例），因重度組患者僅1例，故將中度組和重度組合為中重度組。

2.2 VDR啟動(dòng)子DNA甲基化水平與健康對(duì)照組相比，NMOSD組VDR啟動(dòng)子甲基化水平（0.10±0.07）較健康對(duì)照組（0.12±0.35）低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。分別比較測(cè)序的 19個(gè) CPG位點(diǎn)的DNA甲基化水平發(fā)現(xiàn)，有12個(gè)CPG位點(diǎn)的DNA甲基化水平較對(duì)健康照組低，但僅CPG-3及CPG-5位點(diǎn)DNA甲基化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P=0.045）。 健康對(duì)照組在 CPG-3 及CPG-5位點(diǎn)的DNA甲基化水平分別是NMOSD組的7倍和2倍（見(jiàn)表2）。

以NMOSD組及健康對(duì)照組作為因變量，將19個(gè)CPG位點(diǎn)作為協(xié)變量，進(jìn)行單因素logistics回歸分析顯示，CPG-3及CPG-5位點(diǎn)的P值小于0.1，將上述位點(diǎn)同時(shí)作為協(xié)變量進(jìn)行多因素logistics回歸分析發(fā)現(xiàn)：CPG-3位點(diǎn)低甲基化水平可能與NMOSD相關(guān)（OR=0.272，95%CI:0.112～0.662，P=0.004）（見(jiàn)表 4）。

此外，我們分析了NMOSD組的輕度組與中重度組VDR啟動(dòng)子DNA甲基化的差異 （見(jiàn)表3），發(fā)現(xiàn)在CPG-14位點(diǎn)，重度組的DNA甲基化水平是輕度組的5倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.044）。

以輕度組及中重度組作為因變量，將19個(gè)CPG位點(diǎn)作為協(xié)變量，進(jìn)行單因素logistics回歸分析顯示，CPG-11及CPG-14位點(diǎn)的P值小于0.1，將上述位點(diǎn)同時(shí)作為協(xié)變量進(jìn)行多因素lo gistics回歸分析發(fā)現(xiàn)：CPG-14位點(diǎn)的高甲基化水平可能與NMOSD疾病殘疾程度相關(guān)（OR=4.013，95%CI:1.01～15.92，P=0.048）（見(jiàn)表 4）。

表2 NMOSD組與健康對(duì)照組甲基化水平

表3 NMOSD組的輕度組與中重度組DNA甲基化水平

表4 NMOSD及其殘疾程度危險(xiǎn)因素分析

2.3 VDR mRNA表達(dá)水平與健康對(duì)照組相比，NMOSD組VDR mRNA上調(diào)了1.9倍（P=0.001）。此外，我們分析了VDR mRNA水平與年齡和EDSS之間的關(guān)系，以及與性別之間的差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著相關(guān)及差異（P＞0.05）。

3 討論

盡管DNA甲基化參與了眾多疾病的發(fā)生發(fā)展[11-14]，但目前關(guān)于NMOSD DNA甲基化的研究甚少，關(guān)于NMOSD VDR啟動(dòng)子的DNA甲基化研究更是尚未見(jiàn)報(bào)告。本研究發(fā)現(xiàn)NMOSD患者VDR啟動(dòng)子的DNA甲基化水平較健康對(duì)照組低，且VDR mRNA表達(dá)水平增高。提示DNA甲基化參與了NMOSD的發(fā)生，這與我國(guó)趙俊杰等[15]的報(bào)告相似，該研究也提出DNA甲基化參與了NMOSD的發(fā)生，國(guó)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)告。本研究顯示NMOSD患者VDR啟動(dòng)子DNA甲基化水平稍低于健康對(duì)照，DNA甲基化是機(jī)體調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種機(jī)制，受多種原因的影響，根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道：在自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等的研究中，發(fā)現(xiàn)一些基因在疾病的急性期呈低甲基化改變[16-18]，據(jù)此我們推測(cè) VDR啟動(dòng)子DNA甲基化改變的原因可能是由于NMOSD的炎癥反應(yīng)參與了VDR啟動(dòng)子DNA甲基化改變，后期我們將納入緩解期的NMOSD患者以證明這種猜想。此外關(guān)于VDR啟動(dòng)子DNA甲基化改變的原因，還可能與VD降低后，機(jī)體通過(guò)DNA甲基化調(diào)控機(jī)制上調(diào)VDR表達(dá)，以增加與VD的結(jié)合，這個(gè)推測(cè)在兩項(xiàng)關(guān)于青少年的研究中得到證實(shí)：VD缺乏導(dǎo)致包括VDR啟動(dòng)子在內(nèi)的全基因組DNA呈低甲基化改變[19-20]。但是補(bǔ)充VD是否會(huì)改善VDR的DNA甲基化狀態(tài)還需進(jìn)一步的研究。

VDR啟動(dòng)子DNA甲基化的研究多限于腫瘤，本研究首次報(bào)道了NMOSD患者VDR啟動(dòng)子DNA甲基化。在本研究測(cè)序的VDR-800 bp～-506 bp區(qū)域中，共有19個(gè)CPG位點(diǎn)，經(jīng)多因素logistics回歸分析發(fā)現(xiàn)：VDR啟動(dòng)子CPG-3位點(diǎn)的低甲基化水平可能與NMOSD相關(guān)（OR=0.272，95%CI:0.112～0.662，P=0.004）。NMOSD 組的 390個(gè)克隆中，僅7個(gè)（1.79%）克隆在CPG-3位點(diǎn)是甲基化的，且僅5例（12.8%）在此位點(diǎn)有甲基化。而在健康對(duì)照組的160個(gè)克隆中，有23個(gè)（15.63%）克隆在CPG-3位點(diǎn)是甲基化的，有10例（62.5%）在此位點(diǎn)有甲基化。

在輕度組與中重度組中經(jīng)多因素logistics回歸分析發(fā)現(xiàn)，CPG-14位點(diǎn)的高甲基化水平可能與NMOSD殘疾程度相關(guān)（OR=4.013，95%CI:1.01～15.92，P=0.048）。在輕度組中的280個(gè)克隆中，僅8個(gè)（2.86%）克隆是甲基化的，僅3例（10.7%）在此位點(diǎn)有甲基化。而中重度的110個(gè)克隆中，有21個(gè)（19.09%）克隆是甲基化的，有7例（63.6%）在此位點(diǎn)有甲基化。由此可見(jiàn)，健康對(duì)照與NMOSD患者在CPG-3位點(diǎn)的甲基化分布、輕度組與中重度組在CPG-14位點(diǎn)的甲基化分布是有明顯差異的。

本研究為以后關(guān)于NMOSD VDR啟動(dòng)子的DNA甲基化研究提供了一定的基礎(chǔ)，待多中心大樣本的研究進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果后，可以對(duì)NMOSD的診療提供一定的幫助，同時(shí)也為尋找新的潛在治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

本研究不足之處：①樣本量?。菏紫扔捎谘芯繉?duì)象屬于罕見(jiàn)疾病，發(fā)病率少，其次選取樣本的時(shí)間及范圍限制，導(dǎo)致最終納入的樣本偏小；②在CPG-14位點(diǎn)的logistic回歸分析中，P=0.048，95%CI：1.011～15.924，P值接近 0.05，可信區(qū)間稍寬，可信度偏低，更準(zhǔn)確的結(jié)果還期待多中心，大樣本的研究；③本研究未能納入緩解期的NMOSD患者。在接下來(lái)的研究中，我們會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并納入緩解期的NMOSD患者，以期得出更為詳實(shí)的結(jié)果。