精神分裂癥疾病診斷標志物circRNAs篩選及驗證☆

袁洋 楚璐萌 魏雨菲 劉雪玲 曾凌星 張紅星△ 于海川△○☆

SCZ是一組感知、思維、情感、行為等多方面精神活動出現(xiàn)障礙的重性精神病[1-3]。臨床上，SCZ診斷依賴于對患者癥狀判定，缺乏特異的分子診斷標志物。circRNAs是新近確認的一類非編碼RNA，形成無5’和3’末端的閉合環(huán)狀結構，具有結構穩(wěn)定、高豐度的特點，并且在細胞或組織中特異性表達[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)circRNAs在哺乳動物的大腦中表達豐富，參與調(diào)控大腦發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生，并且與多種神經(jīng)精神疾病相關，如阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化癥和精神分裂癥等[7-9]。本研究使用全轉錄組測序對SCZ患者外周血單個核細胞的circRNAs表達譜進行分析，系統(tǒng)地篩選SCZ患者差異性表達的circRNAs，經(jīng)實時熒光定量PCR（real-time PCR）驗證尋找可作為SCZ潛在診斷標志物的circRNAs。

1 對象與方法

1.1 研究對象SCZ患者來源于2017年2月至2018年10月新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院就診的SCZ患者。納入標準：①由超過2名具有精神疾病診斷資格且主治醫(yī)師以上職稱的醫(yī)師診斷，符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版》（Diagnostic and StatisticalManualofMentalDisorders,Fourth Edition,DSM-Ⅳ）SCZ診斷標準；②陽性與陰性癥狀量表 （positive and negative symptoms scale，PANSS）評分＞60分；③超過兩周未使用任何抗精神病藥物；④18～65歲。排除標準：①患有心膽肝腎等軀體疾病，內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)疾病，或者營養(yǎng)不良；②患有其他精神疾病；③有過敏史、激素治療史或者接受過免疫制劑治療；④妊娠或哺乳期婦女。共入組175例患者。

對照組來源于同時期醫(yī)院招募的豫北地區(qū)志愿者。納入標準：①經(jīng)DSM-IV-TR軸I障礙定式臨床檢查非患者版 （the Structured Clinical Interview for DSM-IV-TR Axis I Disorders，Nonpatient Edition，SCID-I/NP）篩查，無精神疾病臨床診斷；②無精神病史及精神疾病家族史；③18～65歲。排除標準同患者組。共入組200名對照。

本研究通過新鄉(xiāng)醫(yī)學院倫理委員會審批。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 RNA提取和逆轉錄所有被試在治療前用EDTA抗凝管采集外周血樣本5 mL。使用外周血淋巴細胞分離液梯度離心法分離單個核細胞，按照Trizol說明書一步法從單個核細胞中提取總RNA，使用微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）進行RNA濃度定量，通過凝膠電泳檢測RNA完整性。使用逆轉錄試劑盒，在20 μL逆轉錄反應體系中，將1.0 μg總RNA逆轉錄為cDNA。

1.3 全轉錄組測序分析選擇年齡、性別和民族相匹配的SCZ患者和對照外周血單個核細胞總RNA樣品各60份，每20份等量混合成1份RNA混合樣品，分別獲得3份患者RNA混合樣品（C1-C3）和3份對照RNA混合樣品 （N1-N3）。使用Hiseq 4000測序系統(tǒng)PE150平臺對每份混合樣品分別進行全轉錄組測序。使用CIRI軟件[10]檢測和鑒定 circRNAs，并使用circBase數(shù)據(jù)庫[11]對所鑒定的circRNAs進行注釋。對測序數(shù)據(jù)進行標準化，使用獨立樣本t檢驗分析兩組樣品的差異circRNAs，篩選兩組表達量倍數(shù)在2倍以上且差異有統(tǒng)計學意義（檢驗水準α=0.05）的circRNAs。使用R軟件對全轉錄組測序所得的原始數(shù)據(jù)進行分位數(shù)歸一化處理，繪制差異表達circRNAs的非監(jiān)督層次聚類圖和火山圖。

1.4 實時熒光定量PCR根據(jù)上述測序結果選擇表達豐度較高的20個circRNAs在已送測序的60例SCZ患者和60名對照樣品中進行real-time PCR驗證，得到與測序結果一致的circRNAs作為候選circRNAs。然后在175例SCZ患者和200名對照中使用real-time PCR進一步確證。real-time PCR使用PikoReal TM實時熒光定量PCR檢測儀（Therom Fisher Scientific公司）。引物見表1。

1.5 統(tǒng)計學方法運用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，兩組年齡比較采用獨立樣本t檢驗，性別比較采用χ2檢驗。采用GraphPad Prism 6.0對real-time PCR結果進行分析，結果以均數(shù)±標準差（x±s）描述，組間比較采用非配對t檢驗。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 人口學資料SCZ組和對照組均為來自豫北地區(qū)的漢族人口。SCZ組共納入175例患者，其中男 99 例，女 76 例，年齡（33.2±10.0）歲。 對照組共納入200名，其中男106名，女94名，年齡（40.2±9.6）歲。SCZ 組和對照組性別（χ2=0.480，P＜0.001）、年齡（t=-6.930，P＜0.001）差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 樣本總RNA提取與質(zhì)檢結果SCZ和對照測序樣品中提取的 RNA總量均≥2 μg，A260/A280為 1.9～2.0， 電泳條帶清晰，28S、18S、5S 條帶亮度清晰，且28S與18S之比為2:1，提示所有樣本RNA質(zhì)量均達到質(zhì)檢標準。RNA混合樣品電泳結果見圖1。

表1引物列表

圖1 全基因組測序樣本總RNA電泳圖。C1-C3為SCZ患者混合RNA測序樣本，N1-N3為對照混合RNA測序樣本

2.3 circRNAs表達水平非監(jiān)督層次聚類分析全轉錄組測序后，繪制差異表達circRNAs非監(jiān)督層次聚類圖，見圖2。結果表明SCZ組和對照組的circRNAs表達譜存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

圖2非監(jiān)督層次聚類圖。N1-N3為對照組混合RNA測序樣本，C1-C3為SCZ組混合RNA測序樣本，圖中紅色表示circRNAs表達量相對高，藍色表示circRNAs表達量相對低

2.4 差異表達的circRNAs火山圖分析通過繪制火山圖觀察差異表達circRNAs的整體分布情況。由圖3可見，在精神分裂癥患者外周血單個核細胞中存在差異性表達的circRNAs。

2.5 全轉錄組測序獲得差異表達的circRNAs全轉錄組測序共檢測到23418條circRNAs。將其與基因元件比較，獲得circRNAs在基因組上的位置，可以將circRNAs分為以下5類：exonic circRNAs、introniccircRNAs、 antisensecircRNAs、 senseoverlapping circRNAs、intergenic circRNAs。 分類統(tǒng)計信息見圖4。SCZ患者組和對照組相比，存在差異表達的 circRNAs共 195 個（差異倍數(shù)≥2，P＜0.05），其中SCZ患者表達上調(diào)的circRNAs有83個，表達下調(diào)的circRNAs有112個。

圖3 火山圖。每個點均表示一個circRNA，橫坐標為circRNA在兩組樣品中表達量差異倍數(shù)的對數(shù)值，其絕對值越大，說明兩組間的表達差異越大；縱坐標為-log10 P值，P值越小，該值絕對值越大，表明篩選得到的差異表達circRNAs越可靠。圖中綠色的點代表circRNAs表達量下調(diào)，紅色的點代表circRNAs表達量上調(diào)，灰色的點代表circRNAs表達量在組間無統(tǒng)計學差異

圖4circRNA基因結構分布圖

2.6 real-time PCR驗證差異表達的circRNAs根據(jù)測序和分析結果選擇表達豐度較高的20個circRNAs，見表 2。

2.6.1小樣本量real-time PCR驗證在已送測序的60例SCZ和60名對照樣品中進行real-timePCR驗證，結果表明circRNA_16588（circbase_id：has_circ_0004669）表達量（0.479±0.080vs.1.022±0.012，t=6.434，P=0.003） 和 circRNA_12825（circbase_id：has_circ_0004442）表 達 量 （0.387±0.050vs.1.372±0.230，t=4.256，P=0.013）在 SCZ 患者組和對照組表達差異具有統(tǒng)計學意義，二者均在SCZ患者外周血單個核細胞中表達下調(diào)，與測序結果相一致。

表2 全基因組測序real-time PCR驗證差異表達的circRNAs（差異倍數(shù)≥2，P＜0.05）

2.6.2大樣本量real-time PCR驗證 將hsa_circ_0004669和hsa_circ_0004442作為候選circRNAs在175例SCZ患者和200名對照中進行real-time PCR確證，SCZ組hsa_circ_0004669表達量（0.583±0.050vs.0.910±0.060，t=4.312，P＜0.001）和hsa_circ_0004442 表達量 （0.680±0.080vs.1.219±0.090，t=4.334，P＜0.001）均低于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

SCZ是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結果，其大多數(shù)遺傳突變位點發(fā)生在人類基因組的非編碼區(qū)[12-14]。研究表明非編碼 RNA，包括微小RNAs（microRNAs，miRNAs）、長非編碼 RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs） 和 circRNAs與 SCZ 密切相關[15-16]。近年研究已在SCZ患者腦組織中發(fā)現(xiàn)許多差異性表達的非編碼RNA[17-18]。由于腦組織不易獲得，檢測血液非編碼RNA表達相對簡便可行，并且非編碼RNA在血液和腦組織中表達具有一定的一致性，因此在血液中尋找SCZ診斷標志物成為研究熱點[19]。使用基因芯片和PCR驗證的方法在外周血單個核細胞中已發(fā)現(xiàn)部分可作為SCZ診斷標志物的非編碼RNA，如miR-30e、miR-130b、miR-132 以及 NONHSAT 041499 等[20-22]。

circRNAs是一種新型非編碼RNA，參與廣泛的生物過程，影響基因轉錄、mRNA剪接、RNA衰變和翻譯等，在哺乳動物的大腦中高度表達，尤其是在神經(jīng)突觸小體[23]。近年研究表明circRNAs與抑郁癥、精神分裂癥相關聯(lián)[12,24]。circRNAs在唾液、血液、組織和外泌體中表達非常穩(wěn)定[25-28]。因此研究SCZ患者外周血單個核細胞circRNAs表達譜具有潛在臨床意義和實用價值。

目前關于circRNAs與SCZ診斷標志物的相關研究國內(nèi)外尚無報道，并且circRNAs在SCZ中差異性表達也鮮有報道。本研究通過全轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)SCZ患者外周血單個核細胞中存在顯著差異性表達的circRNAs，并使用real-time PCR驗證發(fā)現(xiàn)has_circ_0004669和has_circ_0004442在SCZ患者外周血單個核細胞中表達顯著下降。

盡管本研究已經(jīng)獲得初步結果，找到部分差異表達的circRNAs，但仍存在尚未解決的問題：①circRNAs表達在腦組織中是否與外周血中結果一致；②差異表達的 circRNAs，如 has_circ_0004669和has_circ_0004442，在SCZ發(fā)病機制中有何作用；③抗精神病藥物治療對這些circRNAs的表達有何影響。進一步研究將圍繞上述科學問題，在繼續(xù)加大樣本量驗證的同時，對SCZ患者用藥前后has_circ_0004669和has_circ_0004442表達變化進行檢測，為SCZ診斷和抗精神藥物治療效果評價提供新的支持。

綜上所述，SCZ患者外周血單個核細胞存在顯著的差異性表達circRNAs，本研究發(fā)現(xiàn)并驗證has_circ_0004669和has_circ_0004442在SCZ患者外周血中表達顯著下調(diào)。它們有望成為SCZ潛在診斷標志物，協(xié)助臨床進行SCZ早期診斷，但其作用機制還需進一步研究探討。