植物組織培養(yǎng)過程中的DNA甲基化研究進(jìn)展

石鵬 王永 金龍飛 張大鵬 趙志浩 曹紅星 雷新濤

摘 ?要??組織培養(yǎng)是植物無性繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化的重要技術(shù)基礎(chǔ)。組織培養(yǎng)包括外植體脫分化、愈傷組織形成、再分化等過程，最后形成新的植株。在植物組織培養(yǎng)過程中，DNA甲基化模式不斷發(fā)生變化，表明植物細(xì)胞發(fā)生了大量的表觀遺傳重編程事件。一般來說，DNA甲基化可以促進(jìn)或加快組織培養(yǎng)過程，對于許多很難進(jìn)行組織培養(yǎng)和再生的植物來說非常重要。本文主要總結(jié)了植物組織培養(yǎng)過程中DNA甲基化模式的變化規(guī)律和分子機(jī)制，以及新的研究手段和思路，旨在為開展植物組織培養(yǎng)過程中的DNA甲基化研究提供幫助。

關(guān)鍵詞 ?植物;組織培養(yǎng);DNA甲基化中圖分類號??Q37??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Research Progress on DNA Methylation During Plant Tissue Culture

SHI Peng， WANG Yong， JIN?Longfei， ZHANG Dapeng， ZHAO?Zhihao， CAO Hongxing， LEI Xintao^*

Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Key Biological Laboratory of Tropical Oil Crops， Wenchang， Hainan 571339， China

Abstract ?Tissue culture is the important technical basis for plant asexual propagation and genetic transformation. Tissue culture includes explants?dedifferentiation， callus formation， callus redifferentiation and plantlets formation. DNA methylation pattern is constantly changing during tissue culture， which means many epigenetic reprogramming events occur in cells. Generally speaking， DNA methylation can promote or accelerate the tissue culture process， its very important for many plants that are difficult to regenerate. The paper mainly summarizes the pattern change and molecular mechanism of DNA methylation during plant tissue culture， as well as new methods and ideas. We hope the paper could help the study of DNA methylation in plant tissue culture.

Keywords ?plant; tissue culture; DNA methylation

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.029

植物組織培養(yǎng)是非常實(shí)用的技術(shù)之一，可以生產(chǎn)出基因型高度一致的克隆苗，還是遺傳轉(zhuǎn)化的重要平臺(tái)^[1]。擬南芥、水稻、玉米和毛白楊等植物組織培養(yǎng)技術(shù)成熟，發(fā)展出了相應(yīng)的遺傳轉(zhuǎn)化體系^[2-5]]。然而，油棕和椰子等木本植物的組織培養(yǎng)技術(shù)難以成功，其中原因未知^[6-7]。另外，大量研究發(fā)現(xiàn)，植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)的克隆苗會(huì)發(fā)生

表型變異^[8-10]。得益于高通量測序技術(shù)的發(fā)展，木本植物組織培養(yǎng)難和克隆苗產(chǎn)生變異的分子機(jī)制正逐步揭示。近年來的研究表明，植物組織培養(yǎng)過程伴隨著大量的表觀遺傳修飾，其中DNA甲基化修飾扮演了重要角色^[11]。DNA甲基化在調(diào)控基因的組織特異性表達(dá)方面發(fā)揮了重要作用，但其在植物組織培養(yǎng)過程中的作用機(jī)制還知之甚少。

1??植物組織培養(yǎng)

從20世紀(jì)后半葉開始，植物組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速。利用組織培養(yǎng)技術(shù)，植物外植體可以產(chǎn)生大量高度一致的無性系植株，用于培育新品種，也可據(jù)此構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系，開展基因功能研究。植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物“細(xì)胞全能性”。無菌條件下，分別在愈傷誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生、生根等培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，就可以誘導(dǎo)出愈傷組織、胚狀體、不定芽和根等器官，最終形成再生植株。植物組織培養(yǎng)主要涉及脫分化和再分化過程，脫分化涉及染色質(zhì)水平的動(dòng)態(tài)重構(gòu)，以此來誘導(dǎo)形成愈傷組織。隨后改變培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)物，增殖細(xì)胞開始再分化，誘導(dǎo)器官發(fā)生或形成植株。然而，植物組織培養(yǎng)的時(shí)間和難度受物種、外植體類型、培養(yǎng)基成分和環(huán)境因素影響，研究表明，DNA甲基化與其存在緊密聯(lián)系^[12]。另外，研究人員希望通過植物體細(xì)胞無性繁殖生產(chǎn)出與外植體完全一致的個(gè)體，然而實(shí)際情況并不是這樣，體細(xì)胞無性系變異（包括生理生化、生物學(xué)特性、染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)、DNA分子水平等變異）在植物組織培養(yǎng)過程中非常普遍。在分子水平上，體細(xì)胞無性系變異受DNA甲基化等表觀遺傳變異的影響^{[8， 10， 13]}。

2??DNA甲基化

表觀遺傳學(xué)是目前研究的熱點(diǎn)之一，其領(lǐng)域主要集中在DNA甲基化、基因組印記、核仁顯性、母本效應(yīng)、基因沉默、休眠轉(zhuǎn)座子激活以及RNA編輯等幾個(gè)方面^[14]。DNA甲基化是其中重要的形式之一。在植物基因組中，DNA甲基化主要為5甲基胞嘧啶（5mC），但也有少量的N6甲基腺嘌呤（6mA）和7-甲基鳥嘌呤（7mG）存在。植物基因組中DNA甲基化比例為6%～30%。DNA甲基化是一種被廣泛研究的表觀遺傳修飾方式，在調(diào)控植物再生過程中的基因表達(dá)和染色質(zhì)構(gòu)象等方面發(fā)揮重要作用^[15]。DNA甲基化通常主要指胞嘧啶的5′C位置的甲基化，主要在基因組序列中的CG、CHG和CHH序列（H指A、C或T）中的胞嘧啶上發(fā)生^[16]。一般來說，高度DNA甲基化會(huì)抑制基因表達(dá)，去甲基化可以激活基因表達(dá)。擬南芥基因組3種甲基化水平分別約為24%、6.7%和1.7%^[15]。高度重復(fù)序列、啟動(dòng)子區(qū)、編碼區(qū)域、基因間隔區(qū)是甲基化高發(fā)區(qū)。擬南芥基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化比例大于5%，編碼區(qū)DNA甲基化比例在1/3以上?？傮w情況是，啟動(dòng)子區(qū)甲基化和編碼區(qū)DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄水平高度相關(guān)。編碼區(qū)DNA甲基化程度高，則基因轉(zhuǎn)錄水平也越高，啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度高，轉(zhuǎn)錄水平則降低。目前研究認(rèn)為，被子植物中存在至少5類基因甲基化模式：基因未發(fā)生甲基化，基因發(fā)生甲基化，基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)甲基化，基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域較高的CG和CHG甲基化，以及基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域較高的CHH甲基化^[16]。

2.1DNA的從頭甲基化和維持

在高等植物中，DNA胞嘧啶甲基化的狀態(tài)由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶、DNA去甲基化酶、組蛋白修飾酶、核染色質(zhì)重塑因子以及RNA干擾機(jī)制共同維持^[16-19]。在植物中，可能有2種甲基化模式：①從頭甲基化，是指原本未甲基化的DNA雙鏈進(jìn)行甲基化的過程，通過維持甲基化的酶來保持其穩(wěn)定狀態(tài);②DNA甲基化的維持，指甲基化模式在細(xì)胞分裂過程中復(fù)制的過程，通過維持甲基化酶的作用，以半保留復(fù)制方式將親本的甲基化模式傳遞給子代。植物的從頭甲基化由域重排甲基化轉(zhuǎn)移酶DRM2（domains rearranged methyltransferase?2）催化，而甲基化狀態(tài)通過3個(gè)不同途徑維持：①CG甲基化是植物基因組中最普遍的胞嘧啶甲基化類型，在DNA復(fù)制過程中主要由甲基轉(zhuǎn)移酶MET1（methyltransferase?1）催化和維持;②CHG甲基化主要由染色質(zhì)甲基化酶CMT3（chromomethylase?3）和染色質(zhì)甲基化酶CMT2（chromomethylase?2）催化維持;③CHH序列甲基化主要由DRM2和CMT2共同維持。

2.2DNA去甲基化

在植物中，DNA去甲基化依賴4個(gè)5-甲基胞嘧啶糖基酶：ROS1（repressor of silencing 1，沉默抑制因子1）、DME（demeter DNA glycosylase，DNA糖基化酶）、DML2（DME-like 2，DNA糖基化酶2）和DML3（DME-like 3，DNA糖基化酶3），通過移除甲基化的堿基并切割DNA骨架來實(shí)現(xiàn)，形成的缺口通過DNA聚合酶和連接酶補(bǔ)齊^[18]。ROS1在不同組織中大量表達(dá)，阻止轉(zhuǎn)座子和內(nèi)源基因的沉默，維持轉(zhuǎn)座子一定水平的表達(dá)，DML2和DML3與ROS1功能類似。DME維持胚乳的基因印記和全基因組DNA去甲基化^[20]。

2.3主要的DNA甲基化基因

2.3.1 ?甲基轉(zhuǎn)移酶1基因（MET1）??從擬南芥中最先克隆了第1個(gè)編碼植物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因MET1，該基因編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶和動(dòng)物中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTl同源性很高，主要是維持CG位點(diǎn)的甲基化^[21]。MET1還參與由RNA介導(dǎo)的DNA甲基化過程（RNA-directed DNA methylation，RdDM）。在不存在RNA引物時(shí)，RdDM可遺傳的甲基化只發(fā)生在對稱位點(diǎn)的胞嘧啶上，并且需要MET1的維持。MET1與DRM共同作用參與RNA介導(dǎo)的CG位點(diǎn)二核苷酸的重新甲基化。

2.3.2 ?染色質(zhì)甲基化酶基因（CMT）??擬南芥中最先鑒定出染色質(zhì)域甲基轉(zhuǎn)移酶，這是植物特有的DNA甲基化酶，結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物的DNMTl相似，主要維持CHG位點(diǎn)的甲基化^[22]此外，CMT還維持其他序列的甲基化。

2.3.3 ?結(jié)構(gòu)域重排甲基轉(zhuǎn)移酶基因（DRM）??植物中的DRM基因家族與哺乳動(dòng)物的DNMT3基因家族同源，擬南芥DRM家族有2個(gè)成員：DRM1和DRM2，它們的功能是催化植物中非對稱位點(diǎn)的從頭甲基化，主要依靠RdDM完成^[23]。DRM和CMT共同參與非CG位點(diǎn)的甲基化。

2.3.4 ?沉默抑制因子基因（ROS1）??擬南芥ROS1基因編碼有內(nèi)切酶Ⅲ結(jié)構(gòu)域的核蛋白，其具有對甲基化DNA的糖基化酶和裂解酶的活性^[24]。ROS1作為一種DNA修復(fù)蛋白，通過對靶基因啟動(dòng)子去甲基化抑制基因沉默。

2.3.5 ?Demeter DNA糖基化酶基因（DME）??擬南芥DME基因編碼具有核定位結(jié)構(gòu)域的DNA糖基化酶功能的蛋白質(zhì)，可以激活來源于母本的2個(gè)被甲基化的印記基因的表達(dá)^[25-26]。

2.3.6 ?Demeter DNA糖基化酶2/3基因（DML2/3）??擬南芥DML2和DML3是5-甲基化胞嘧啶DNA糖基化酶，在植物器官中廣泛表達(dá)^[27]。DML2和DML3不僅可以移除部分胞嘧啶的甲基化，還能維持某些位點(diǎn)的高甲基化水平。

2.4DNA甲基化的主要檢測方法

2.4.1 ?甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性PCR法??甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation?sensitive amplified?polymorphism，MSAP）PCR方法分別使用同裂酶MSPI、HpaII與內(nèi)切酶EcoR I組合對基因組DNA進(jìn)行雙酶切，從而得到片段大小不同的DNA片段，然后連上相應(yīng)的內(nèi)切酶接頭，根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。利用聚丙烯凝膠電泳、毛細(xì)管電泳或者其他方法檢測擴(kuò)增出的差異片段。MSP I和Hpa?II具有相同的識(shí)別位點(diǎn)（5′-CCGG-3′），但是對甲基化的敏感程度不同。Hpa?II能識(shí)別并切割非甲基化位點(diǎn)與單鏈甲基化位點(diǎn)，不能切割雙鏈甲基化位點(diǎn)，即不能消化含mCCGG、CmCGG、mCmCGG的位點(diǎn);MSP I能識(shí)別并切割非甲基化位點(diǎn)和雙鏈內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化位點(diǎn)，不能切割單鏈外側(cè)胞嘧啶甲基化位點(diǎn)，即不能切割UmCCGG、mCmCGG的位點(diǎn)。因此，PCR可以選擇性擴(kuò)增出不同的帶型，由此可以判斷基因組甲基化程度。MSAP已經(jīng)在油菜、油棕和蘋果等植物中得到應(yīng)用^[28-30]，但是由于其甲基化位點(diǎn)的局限性，不能完全準(zhǔn)確反映DNA甲基化水平。

2.4.2 ?酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）??針對DNA甲基化的酶聯(lián)免疫法是對樣品中的5mC進(jìn)行精確定量，其使用與5mC特異結(jié)合的單克隆抗體和帶有發(fā)光基團(tuán)的二抗對甲基化的胞嘧啶進(jìn)行定量。該方法準(zhǔn)確快速，雖然不能獲取序列信息，但是能夠?qū)NA甲基化水平進(jìn)行初步的定量分析。駱薇^[31]用ELISA測定轉(zhuǎn)基因白樺微繁（脫分化和再分化）過程中的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。

2.4.3??甲基化DNA免疫沉淀測序法（methylated DNA immunoprecipitation-sequencing，MeDIP-?seq）??免疫沉淀測序法首先要針對5mC設(shè)計(jì)特異抗體，利用抗體對胞嘧啶甲基化的DNA、甲基結(jié)合域（MBD）或其他蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行免疫共沉淀，然后將這些序列進(jìn)行高通量測序。該類方法已經(jīng)應(yīng)用于玉米、毛白楊和柑橘等植物甲基化區(qū)域的分析^{[13， 32-33]}。用MeDIP-seq檢測玉米組織培養(yǎng)過程中全基因組DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)基因上游區(qū)域發(fā)生大量的甲基化變化事件，并且啟動(dòng)子區(qū)域的去甲基化與該基因位點(diǎn)的表達(dá)變化相關(guān)。

2.4.4??亞硫酸氫鹽測序法（bisulfite sequencing）??該方法是運(yùn)用亞硫酸氫鹽處理變性的基因組DNA片段，將其中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而已被甲基化的胞嘧啶將不?huì)被轉(zhuǎn)換。接著通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增轉(zhuǎn)變后的序列，將尿嘧啶轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶，再結(jié)合高通量測序技術(shù)，未轉(zhuǎn)化的甲基胞嘧啶最后以胞嘧啶形式被檢測到。該方法可以確定分辨率為單堿基水平的甲基化圖譜，從而被視為辨認(rèn)基因組DNA甲基化狀態(tài)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。該方法首先應(yīng)用于擬南芥中，因其高分辨率和豐富的序列信息，目前在油棕和玉米等植物中得到廣泛應(yīng)用^{[10， 34]}。

3??組織培養(yǎng)過程中的DNA甲基化

3.1變化情況

組織培養(yǎng)過程中DNA甲基化水平持續(xù)變化，不同物種、不同時(shí)期、基因組不同區(qū)域的DNA甲基化水平存在差異。另外，激素和DNA甲基化抑制劑等外源添加物對植物組織培養(yǎng)過程中的DNA甲基化水平也有影響。

愈傷組織形成過程中，DNA甲基化水平變化存在以下4種情況：上升，下降，先降低后升高，先下降后上升再下降。Liu等^[35]通過甲基化DNA免疫沉淀測序、表達(dá)譜和小RNA測序，發(fā)現(xiàn)脫分化的玉米胚比正常胚甲基化程度高，在胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程中，DNA甲基化水平上升。Rival等^[36]使用HPLC（high performance liquid?chrom at ography）分析油棕體細(xì)胞胚胎在懸浮培養(yǎng)長期增殖過程中的基因組甲基化水平和體細(xì)胞發(fā)生能力的變化，發(fā)現(xiàn)體外增殖導(dǎo)致DNA甲基化上升，體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力增加。Or?owska等^[37]使用HPLC、SSAP（sequence specific amplified polymor phism，特異序列擴(kuò)增多態(tài)性）和MSTD（methyl-sensitive transposon?display，甲基化敏感轉(zhuǎn)座子顯示）等方法分析大麥花藥和未成熟胚組織培養(yǎng)過程中的DNA甲基化變化，發(fā)現(xiàn)不同外植體之間沒有差異。單株無性系形成過程中甲基化水平提高，轉(zhuǎn)座子在組織培養(yǎng)過程中被激活。組織培養(yǎng)可能會(huì)激活一些轉(zhuǎn)座子，而有一些則始終保持沉默。Temel等^[38]用甲基化敏感限制性指紋圖譜（methylation-sensitive restriction finger- printing，MSRF）技術(shù)研究大麥愈傷組織形成過程中的甲基化水平變化，發(fā)現(xiàn)胞嘧啶甲基化水平呈上升趨勢。韓柏明等^[39]用MSAP技術(shù)研究草莓組織培養(yǎng)過程DNA甲基化水平變化，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平下降，甲基化模式變異以去甲基化為主。Matthes等^[29]使用AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）和MSAP標(biāo)記分析油棕外植體和無性系之間的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)MSAP標(biāo)記在樣品之間存在多態(tài)性而AFLP沒有，且DNA甲基化水平降低。Kubis等^[40]分析油棕外植體和無性系轉(zhuǎn)座子，發(fā)現(xiàn)序列甲基化水平存在差異。使用限制性酶McrBC分析發(fā)現(xiàn)，在組織培養(yǎng)過程中，全基因組的DNA甲基化水平降低，HPLC分析也發(fā)現(xiàn)無性系的甲基化水平要低于外植體。Machczyńska等^[41]利用HPLC分析小黑麥組織培養(yǎng)過程中的DNA甲基化變化，發(fā)現(xiàn)組織培養(yǎng)導(dǎo)致DNA甲基化水平降低。DNA甲基化水平降低加快了隨后的體細(xì)胞胚胎發(fā)生。Stelpflug等^[13]使用MeDIP-seq評估玉米愈傷組織、無性系等全基因甲基化水平變化，發(fā)現(xiàn)組織培養(yǎng)過程中甲基化水平降低的頻率更高，在基因上游區(qū)域，甲基化變化和啟動(dòng)子DNA甲基化缺失與隨后位點(diǎn)的表達(dá)變化有關(guān)。分析組織培養(yǎng)過程中和自然發(fā)生的差異甲基化區(qū)域（differentially methylated regions，DMRs）的重疊區(qū)域，發(fā)現(xiàn)重疊區(qū)域比例高于預(yù)期，說明引起體細(xì)胞克隆變異的基因組壓力與自然變異類似，并且某些位點(diǎn)對表觀遺傳變化特別敏感。呂曉婷^[30]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的5-氮胞苷對蘋果愈傷組織的形成沒有顯著影響，100?μmol/L的5-氮胞苷處理可以使愈傷組織形成時(shí)間比對照提前3?d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)愈傷組織形成過程中，DNA甲基化水平先降低后升高。DNA甲基化可以通過改變相關(guān)基因的甲基化模式來參與愈傷組織形成的調(diào)控。孟海軍^[42]以來源于同一單胚系的愈傷、胚狀體、葉片以及長期繼代的愈傷為材料建立了山金柑MSAP實(shí)驗(yàn)體系。結(jié)果表明，DNA甲基化水平在新鮮愈傷組織中最低，繼代和再生過程中都會(huì)上升。丁明麗^[43]利用基因芯片、HPLC法和MSAP標(biāo)記分析小麥成熟胚脫分化過程中的DNA甲基化變化情況，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平在2，4-D誘導(dǎo)下先下降后上升再下降，并發(fā)現(xiàn)了一些差異表達(dá)基因。

基因組不同區(qū)域的DNA甲基化水平變化不一致。Zakrzewski等^[44]分析甜菜葉片和其誘導(dǎo)形成的愈傷組織的全基因組DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和基因的CG和CHG位點(diǎn)甲基化水平上升，DNA轉(zhuǎn)座子CHH位點(diǎn)的甲基化水平下降，說明葉片和愈傷組織在基因組不同區(qū)域呈現(xiàn)不同的甲基化水平。

植物組織培養(yǎng)過程中，DNA甲基化形式會(huì)發(fā)生變化。張劍鋒等^[45]利用RAPD分子標(biāo)記研究漸滲系的水稻親本——粳稻品種“松前”在組織培養(yǎng)過程中發(fā)生的表觀遺傳變異。結(jié)果表明，松前在組織培養(yǎng)過程中發(fā)生的變異主要為DNA甲基化變異：一類變異是將未甲基化的CCGG位點(diǎn)的外側(cè)胞嘧啶半甲基化，此類變異基本上不能傳遞給再生苗;另一類變異是在CCGG位點(diǎn)內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化的基礎(chǔ)上，發(fā)生了外側(cè)胞嘧啶的甲基化，大多數(shù)的外側(cè)胞嘧啶甲基化在再生苗中發(fā)生了去甲基化。

組織培養(yǎng)過程中，添加外源物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致植物DNA甲基化水平發(fā)生變化。Temel等^[46]用MSRF分析大麥愈傷組織在0.5 μmol/L油菜素內(nèi)酯處理下的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)與對照組相比有少量變化。劉鵬飛等^[47]利用MSAP分子標(biāo)記分析GA（赤霉素）對火龍果DNA甲基化的影響，發(fā)現(xiàn)火龍果組培苗DNA甲基化對低濃度GA敏感，對高濃度GA敏感性降低。聶麗娟等^[48]使用MSAP分子標(biāo)記對菊花組織培養(yǎng)繼代過程中的DNA甲基化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)組培苗和添加材料之間有DNA甲基化差異，繼代材料與母體之間也有甲基化差異。Ghosh等^[49]使用MSAP標(biāo)記分析藍(lán)莓葉片外植體和愈傷組織DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)存在較大差異。Bardini等^[50]同時(shí)采用免疫標(biāo)記和MSAP標(biāo)記分析非生物脅迫（卡那霉素處理）對擬南芥葉片愈傷組織形成的DNA甲基化影響，發(fā)現(xiàn)全基因組的DNA甲基化水平降低。

3.2分子機(jī)制

植物組織培養(yǎng)過程中會(huì)發(fā)生DNA甲基化變化，并且需要維持一定水平的DNA甲基化。然而，植物組織培養(yǎng)過程中發(fā)生的DNA去甲基化也會(huì)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄異常，造成組培苗性狀變異。植物再生過程主要受到WUS（WUSCHEL）、LEC（LEAFY COTYLEDON）、BBM（BABY BOOM）和WOX（WUSCHEL RELATED HOMEOBOX）等基因的調(diào)控^[51-52]，其中WUS基因受DNA甲基化調(diào)控的研究最為深入。

植物組織培養(yǎng)過程伴隨著DNA甲基化水平的變化，愈傷組織和體細(xì)胞胚胎發(fā)生等與DNA甲基化密切相關(guān)。Ho等^[53]使用焦磷酸測序分析甲基化敏感限制性內(nèi)切酶差異產(chǎn)物，定量PCR分析表明，油棕EgNB3的甲基化狀態(tài)與葉片體細(xì)胞胚胎發(fā)生率有關(guān)。Xu等^[33]以柑橘愈傷組織為材料，設(shè)置不添加、添加5-氮胞苷和處理恢復(fù)組，通過甲基化組、轉(zhuǎn)錄組和代謝物含量分析，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化抑制劑5-氮胞苷能通過激活CpCCD1促進(jìn)類胡蘿卜素的降解，同時(shí)造成全基因組的去甲基化效應(yīng)。Gao等^[54]使用HPLC技術(shù)分析甘藍(lán)型油菜組織培養(yǎng)過程中的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)在含有0.1 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率最高（91.0%），甲基化水平最低。外植體在培養(yǎng)后6、21、30 d的甲基化比例分別為4.33%、8.07%和38.7%，表明激素的作用和愈傷組織分化與甲基化水平有關(guān)。Santos等^[55]利用甲基化敏感酶分析5-氮胞苷對蒺藜苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生和DNA甲基化水平的影響，發(fā)現(xiàn)100 μmol/L的5-氮胞苷能抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生，說明體細(xì)胞胚胎發(fā)生需要維持一定水平的DNA甲基化，否則會(huì)喪失再生能力。Vining等^[32]使用MeDIP-seq技術(shù)比較節(jié)間莖段、脫分化的愈傷組織和再生植株節(jié)間的甲基化差異，發(fā)現(xiàn)3種組織在56%基因組區(qū)域存在甲基化差異。然而，組織之間的基因啟動(dòng)子甲基化差異較小。45%的差異甲基化基因是短暫的甲基化，其在愈傷組織中被甲基化，在再生植株中又發(fā)生去甲基化。表達(dá)芯片數(shù)據(jù)顯示，啟動(dòng)子和基因區(qū)域發(fā)生甲基化的基因表達(dá)量比未發(fā)生甲基化或只有啟動(dòng)子發(fā)生甲基化的基因表達(dá)量更低。4種轉(zhuǎn)座子豐度顯示，再生植株節(jié)間組織有最高水平的甲基化。Stroud等^[11]研究發(fā)現(xiàn)，水稻再生植株的DNA甲基化水平降低。啟動(dòng)子去甲基化與蛋白編碼基因的下調(diào)表達(dá)有關(guān)。組織培養(yǎng)階段發(fā)生去甲基化。Wang等^[56]使用MSAP分子標(biāo)記和基因熒光定量分析水稻組織培養(yǎng)形成的愈傷組織和再生苗的DNA甲基化差異，發(fā)現(xiàn)了一些差異表達(dá)的DNA甲基化基因[如CMT3、DRM2、DDM1（DECREASED DNA METHYLATION 1）、MET1、DME1和DME2等]。Han等^[34]使用亞硫酸鹽測序法分析玉米組織培養(yǎng)過程中的DNA甲基化變化，發(fā)現(xiàn)在多個(gè)獨(dú)立材料中的一些位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生高比例的DNA甲基化變化，說明這些位點(diǎn)是組織培養(yǎng)過程中表觀遺傳變異的靶位點(diǎn)或者熱點(diǎn)。

植物組織培養(yǎng)再生能力受WUS、LEC、BBM和WOX等基因的調(diào)控，這些基因又受DNA甲基化調(diào)控。WUS的表達(dá)是植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生所必需的，其受到DNA甲基化調(diào)控，從而進(jìn)一步調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子和功能基因，最終調(diào)控體細(xì)胞胚胎發(fā)生^[52]。Su等^[57]研究表明，生長素梯度和PIN1介導(dǎo)的生長素極性運(yùn)輸對于WUS誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生是必要的。擬南芥莖的再生需要生長素介導(dǎo)的WUS基因表達(dá)的誘導(dǎo)，WUS基因編碼轉(zhuǎn)錄因子WUSCHEL，其啟動(dòng)子發(fā)生去甲基化。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶CMT3或者MET1的功能缺失引起的去甲基化會(huì)誘導(dǎo)WUS表達(dá)，加快莖的再生。因此，DNA去甲基化可以促進(jìn)或加快組織培養(yǎng)過程，這對于許多很難進(jìn)行組織培養(yǎng)和再生的植物來說非常重要^[18]。DNA甲基化和組蛋白修飾通過調(diào)控WUS的表達(dá)和生長素信號來調(diào)控?cái)M南芥莖的再生^[58]。Mahdavi等^[59]認(rèn)為，WUS和LEC1基因受到DNA甲基化調(diào)控，從而調(diào)控體細(xì)胞胚胎發(fā)生。Shemer等^[60]研究發(fā)現(xiàn)，cmt3突變體表現(xiàn)出CHG甲基化的顯著降低，同時(shí)在富含細(xì)胞分裂素的莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上具有高的再生能力。在野生型中，WUS的啟動(dòng)子高度甲基化，然而在cmt3中WUS被富含細(xì)胞分裂素的莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)，說明WUS基因啟動(dòng)子的去甲基化可能是導(dǎo)致其獲得較高再生能力的因素。Liu等^[61]分析擬南芥莖再生過程中MET1表達(dá)的上游信號，發(fā)現(xiàn)在莖再生過程中MET1表達(dá)模式和WUS的啟動(dòng)存在動(dòng)態(tài)變化。細(xì)胞循環(huán)調(diào)節(jié)因子E2FA是直接促進(jìn)MET1表達(dá)的上游因子。細(xì)胞分裂素通過增強(qiáng)CYCD3的表達(dá)部分提升了MET1的表達(dá)量。結(jié)果表明，MET1介導(dǎo)的莖再生受到細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的細(xì)胞循環(huán)調(diào)控。DNA甲基化抑制劑5-氮胞苷通過降低DNA甲基化水平，以及LEC1和BBM1的表達(dá)強(qiáng)烈抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生。DNA甲基化和組蛋白修飾共同調(diào)控咖啡體細(xì)胞胚胎發(fā)生，LEC1和BBM1在體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)階段表達(dá)，而WOX4在胚胎成熟時(shí)期表達(dá)量降低^[62]。

Ongabdullah等^[10]利用表觀基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定到油棕MANTLED基因，mantled變異使油棕組培后產(chǎn)生果實(shí)畸形，影響產(chǎn)量。結(jié)果表明，mantled變異是由于油棕EgDEF1基因內(nèi)含子中的LINE反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Karma的DNA甲基化水平降低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的可變剪接和提前終止，從而造成果實(shí)畸形。

4??研究趨勢和新思路

近年來，結(jié)合DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)研究植物響應(yīng)外界刺激的DNA甲基化機(jī)制成為趨勢，為研究植物組織培養(yǎng)過程中的表觀遺傳機(jī)制提供了思路。Zakrzewski等^[44]利用亞硫酸氫鹽測序法測定甜菜葉片和誘導(dǎo)形成的愈傷組織的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)在愈傷組織形成過程中，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和基因的CG和CHG類甲基化水平降低，而轉(zhuǎn)座子的CHH類甲基化水平上升。Xu等^[33]結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組測序，分析發(fā)現(xiàn)5-氮胞苷處理后柑橘愈傷組織的類胡蘿卜素降解、ABA含量上升，是由于某些轉(zhuǎn)錄因子被激活，從而促進(jìn)了CpCCD1基因的表達(dá)。Liu等^[35]利用MeDIP-seq和表達(dá)譜分析玉米未成熟胚和愈傷組織的甲基化和基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)甲基化水平上升，而功能基因表達(dá)量下降。Yaish等^[63]通過全基因組亞硫酸氫鹽測序法分析蒺藜苜蓿根響應(yīng)鹽處理（NaCl）的DNA甲基化變化，對差異甲基化基因篩選后進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)鉀離子通道蛋白KAT3基因和ERF類轉(zhuǎn)錄因子是潛在的鹽響應(yīng)基因。Feng等^[64]結(jié)合全基因組DNA甲基化測序和轉(zhuǎn)錄組分析研究水稻響應(yīng)鎘的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)差異甲基化和表達(dá)的基因主要涉及抗逆、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)錄因子等基因，并發(fā)現(xiàn)5-氮胞苷可以降低DNA甲基化水平，促進(jìn)水稻幼苗生長和鎘的積累。因此，利用DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組（或表達(dá)譜）測序技術(shù)來研究DNA甲基化機(jī)制是可行的。

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)有結(jié)合基因編輯技術(shù)來開展靶向去甲基化的報(bào)道，為研究植物組織培養(yǎng)過程中相關(guān)基因的表觀遺傳修飾提供了有效途徑。Gallego等^[65]開發(fā)了擬南芥基因組中特定位點(diǎn)靶向去除DNA甲基化的2個(gè)新工具，這些工具具有高特異性和低脫靶效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。利用人源去甲基化酶TET1和人工鋅指蛋白ZF融合蛋白ZF-TET1cd靶向開花基因FWA，可以高效去甲基化，引起FWA基因的上調(diào)，并形成可遺傳的晚花表型。ZF-TET1cd也可以靶向轉(zhuǎn)座子CACTA1的甲基化區(qū)域，引起去甲基化，改變基因表達(dá)。同時(shí)，該研究也開發(fā)了基于CRISPR/ dCas9的去甲基化系統(tǒng)SunTag-TET1cd，和ZF- TET1cd類似，SunTag-TET1cd系統(tǒng)可以靶向FWA或CACTA1，引起去甲基化，促進(jìn)基因表達(dá)。這些工具為開發(fā)優(yōu)良性狀的表觀等位基因，為重新激活沉默的基因、轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)座子提供了新的方法。Ji等^[66]開發(fā)了“表觀突變”（epimutage nesis）技術(shù)，可以通過對擬南芥基因組的隨機(jī)去甲基化快速產(chǎn)生DNA的甲基化變異。該技術(shù)通過在擬南芥中表達(dá)人類TET酶，產(chǎn)生可遺傳給后代的基因組低甲基化，以此來模擬植物中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MET1的突變體，將表觀突變技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)上的重要作物，可導(dǎo)致先前由于DNA甲基化而沉默的等位基因的差異表達(dá)，從而揭示隱藏的表型變異。因此，未來可以借鑒靶向去DNA甲基化的思路，對組織培養(yǎng)過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子或功能基因進(jìn)行靶向表觀修飾，加快組織培養(yǎng)進(jìn)程，提高組織培養(yǎng)效率。

5??展望

目前，植物組織培養(yǎng)過程中的DNA甲基化研究主要在擬南芥、水稻、玉米和柑橘等模式植物和重要農(nóng)作物中開展，研究層面主要包括DNA甲基化水平變化規(guī)律、愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的DNA甲基化分子機(jī)制。雖然許多植物的組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但組培再生的分子機(jī)制特別是受DNA甲基化調(diào)控的機(jī)制還知之甚少。另外，許多木本植物，特別是油棕和椰子等棕櫚科植物組織培養(yǎng)過程長，效率低，組織培養(yǎng)困難。因此未來的研究方向，一是借鑒其他植物中添加DNA甲基化抑制劑來促進(jìn)組織培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn);二是在模式植物中繼續(xù)開展組織培養(yǎng)過程的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制研究，理解愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生等重要過程中受什么基因控制，這些基因受DNA甲基化調(diào)控的機(jī)制是什么;三是結(jié)合基因編輯技術(shù)在模式植物和重要農(nóng)作物中開展靶向DNA甲基化修飾，定點(diǎn)調(diào)控啟動(dòng)組培再生的關(guān)鍵基因表達(dá)，加快組織培養(yǎng)進(jìn)程，提高組織再生效率。

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