細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定

摘要：細(xì)菌纖維素具有高結(jié)晶度、生物可降解性和合成可調(diào)控性等優(yōu)良特性，被公認(rèn)為是一種性能較好的纖維素，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、造紙、聲學(xué)等領(lǐng)域。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室自制蕎麥醋自然放置一段時間后，液面上長出厚厚的凝膠狀膜，經(jīng)成分分析，確定該膜成分為纖維素，結(jié)晶度為78%，Iα型纖維素含量為60%。取該蕎麥醋的醪液，經(jīng)富集、分離、初篩和復(fù)篩等，最終從108個單菌落中篩選出1株性能穩(wěn)定的纖維素高產(chǎn)菌株J2，纖維素產(chǎn)量可達(dá) 8762 g/L（濕質(zhì)量）。通過形態(tài)學(xué)與基于16S rRNA序列的分子生物學(xué)鑒定，確定菌株J2為漢森氏葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter hansenii，GenBank登錄號為GU213109）。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌纖維素；菌株；鑒定；漢森氏葡糖醋桿菌

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0282-04

收稿日期：2016-10-19

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃（編號：2016JQ3036）。

作者簡介：葛含靜（1981—），女，陜西咸陽人，博士，講師，主要從事糧食工程與發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新、食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)等方面的研究。E-mail：gehanjing1981@163com。

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，簡稱BC）是某些海洋生物（如被囊綱動物）、細(xì)菌（醋酸桿菌、假單胞桿菌、土壤桿菌、無色桿菌、八疊球菌等菌屬的細(xì)菌）代謝產(chǎn)物，由β-1，4-D-吡喃葡萄糖聚合而成，不摻雜任何其他形式的多糖，純度極高。與普通植物纖維相比，BC機(jī)械強(qiáng)度高、吸水保水率高、生物適應(yīng)性良好，被認(rèn)為是性能較好的纖維素，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、造紙、石油開采等領(lǐng)域。

目前，學(xué)術(shù)界對BC的合成研究主要是圍繞培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化、菌株的代謝工程改造、高產(chǎn)菌株的自然選育及誘變選育等方面展開。陳軍等利用糖廠副產(chǎn)物——酸化糖蜜生產(chǎn)BC，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量顯著提高，且用紅茶菌的復(fù)合菌種能更高效地利用碳源[3]。夏露等利用甲醇廢水發(fā)酵生產(chǎn)BC，發(fā)現(xiàn)以木醋桿菌靜態(tài)發(fā)酵，BC產(chǎn)量較低[4]。楊雪霞等研究發(fā)現(xiàn)，剪切力會影響纖維素產(chǎn)生菌的形態(tài)和生物量，不利于BC合成[5]。翁媛媛等以惰性吸附載體固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)BC，在避免剪切力的同時，增加了固液界面的表面積，BC產(chǎn)量為液態(tài)靜置發(fā)酵產(chǎn)量的3倍，但后處理難度增加了很多。de Melo等對漢森氏葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter hansenii） ATCC23769纖維素合成酶操縱子中部分基因進(jìn)行克隆，采用過表達(dá)這些基因以期提高BC產(chǎn)量。周勝虎等從腐爛的水果中自然分離得到BC產(chǎn)生菌JX303335[8]。余曉斌等通過紫外誘變[9]，杜雙奎等通過高靜水壓誘變方法[10]實(shí)現(xiàn)了BC高產(chǎn)突變株的成功選育。盡管BC生物合成的研究在各個方面都取得了長足進(jìn)展，但從源頭上自然篩選出性能穩(wěn)定的BC高產(chǎn)菌株，優(yōu)化其發(fā)酵條件，表征其產(chǎn)BC性能相關(guān)指標(biāo)，仍具有重要的研究意義。本研究初步篩選出了1株BC產(chǎn)量高且傳代穩(wěn)定的菌株J2，并擬對其進(jìn)行鑒定，同時，擬對菌株J2所產(chǎn)BC的超微結(jié)構(gòu)和超分子結(jié)構(gòu)也作鑒定，為后續(xù)通過誘變或基因工程方法選育優(yōu)良的BC產(chǎn)生菌株奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制蕎麥醋。

12試驗(yàn)試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒、2 000 bp DNA marker、Ex Taq酶，均購自日本TaKaRa公司。DNA膠純化及回收試劑盒，購自美國Amersham Biosciences公司。細(xì)菌16S rRNA通用擴(kuò)增引物F9/R1510及測序引物F9、R1510和F520，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他試劑均為分析純級或生化試劑級。

13培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母膏，1 g/L K2HPO4，10 g/L MgSO4·7H2O，無水乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%，005 g/L 制霉素，pH值自然。

基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母膏，1 g/L K2HPO4，15 g/L MgSO4·7H2O，無水乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%，pH值自然。分離培養(yǎng)基、斜面保藏培養(yǎng)基配方在基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加17%瓊脂。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母膏，1 g/L K2HPO4，10 g/L MgSO4·7H2O，無水乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%，pH值自然。

所有培養(yǎng)基均于121 ℃高壓滅菌15 min后備用。

14方法

141菌種篩選[11]富集：自制蕎麥醋于自然條件放置一段時間，液面長出厚厚的凝膠狀膜。經(jīng)成分分析，確定為BC。吸取10 mL該醋樣，加到90 mL富集培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng) 4 d，培養(yǎng)基表面長出BC。

分離：吸取1 mL長膜的富集培養(yǎng)液，用無菌生理鹽水稀釋成濃度梯度為10-1、10-2、…、10-7的溶液。吸取后3個濃度梯度的稀釋液各02 mL，涂布于分離培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)5 d，選擇菌落長勢良好、分布均勻且菌落數(shù)適中的1個平板，挑取所有單菌落，接種于斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)18～24 h，長出豐厚菌苔后，保藏于4 ℃冰箱。

初篩：將保藏的菌種各挑取1環(huán)，分別接種于10 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)5 d，篩選產(chǎn)BC的菌株，挑取其菌膜，連續(xù)2次劃線分離，鏡檢為純培養(yǎng)物后，斜面保藏于4 ℃冰箱。

復(fù)篩：挑取純化的菌株接種于基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基，連續(xù)5代傳代培養(yǎng)，測定每代菌株產(chǎn)生的BC濕質(zhì)量，篩選出產(chǎn)量最高且穩(wěn)定的菌株。培養(yǎng)方法：挑取1環(huán)活化的斜面菌苔，接種于100 mL基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基，30 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化，再接入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定BC產(chǎn)量。

BC產(chǎn)量的測定：將活化的種子液按10%接種量（體積分?jǐn)?shù)）接入1 L發(fā)酵培養(yǎng)基，用8層滅菌紗布封口，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d，測定處理后的BC產(chǎn)量。BC處理方法：用蒸餾水過夜沖洗BC膜，然后浸泡于05 mol/L NaOH溶液中并煮至乳白色半透明狀[12]。處理后的BC膜在濾紙上瀝干，稱質(zhì)量（即BC濕質(zhì)量）；將瀝干的BC膜在烘箱中于105 ℃烘至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量（即BC干質(zhì)量）。纖維素產(chǎn)量用單位體積培養(yǎng)液的纖維素質(zhì)量表示。

142凝膠狀膜成分分析[11]定性分析：在培養(yǎng)皿中放入1張新的載玻片，倒入蒸餾水，能覆蓋載玻片即可。挑取培養(yǎng) 2 d 的凝膠狀膜，自然平展于載玻片上，取出載玻片并晾干，向膜上滴665%硫酸，然后用碘液染色，在顯微鏡下觀察顯色情況。

酶解試驗(yàn)：取凝膠狀膜，于105 ℃烘干至恒質(zhì)量，準(zhǔn)確稱取0500 0 g，剪碎，加入纖維素酶溶液中，55 ℃長時間保溫，若溶液變清亮且烘干后膜的質(zhì)量減輕90%以上，則可確定凝膠狀膜主要成分為纖維素。

143BC結(jié)構(gòu)鑒定超微結(jié)構(gòu)表征：用掃描電子顯微鏡（scanning electronic microscope，簡稱SEM）觀察。BC干膜用雙膠碳導(dǎo)電帶安裝在1截銅段上，用鉑涂層設(shè)備為BC膜涂鉑，室溫進(jìn)行掃描電鏡拍照。

超分子結(jié)構(gòu)表征：用固態(tài)13C-核磁共振光譜（muclear magnetic resonance，簡稱NMR）測定過夜水洗并烘干的纖維素的結(jié)晶度、晶體類型。測試頻率7546 MHz，脈沖寬度 38 kHz，接觸時間1 ms，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速5～6 kHz，轉(zhuǎn)角547°，循環(huán)時間3 s，每個光譜2 400次掃描。

144菌種鑒定形態(tài)學(xué)鑒定：取對數(shù)期菌體，結(jié)晶紫染色后用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)；同時，取對數(shù)期菌體劃線接種于種子培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取BC產(chǎn)生菌株基因組DNA。以基因組為模板、F9/R1510為引物擴(kuò)增16S rRNA序列。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對，用MEGA4繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合表型特征確定其生物學(xué)地位。

2結(jié)果與分析

21BC產(chǎn)生菌株篩選

涂布分離得到108個單菌落（依次編號為J1，J2，…，J108）。初篩發(fā)現(xiàn)，有9株菌能產(chǎn)凝膠狀膜，3株所產(chǎn)凝膠狀膜松軟、有空洞。對能產(chǎn)膜的9株菌連續(xù)5代傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)編號J2的菌株的每一代培養(yǎng)物性狀穩(wěn)定、凝膠狀膜產(chǎn)量最高（平均為8762 g/L），且膜外觀結(jié)實(shí)、平滑、有彈性。

22凝膠狀膜成分分析

被染色為深藍(lán)色的物質(zhì)在顯微鏡下呈無規(guī)則層狀分布，包裹著未染色的桿狀菌體細(xì)胞。初步判斷，凝膠狀膜主要成分為纖維素。酶解50 h后溶液變清亮，酶解前膜質(zhì)量 0500 2 g，酶解后質(zhì)量0023 6 g，因此可以算出，纖維素含量為（0500 2～0023 6）/0500 2×100%=9528%?？梢耘袛?，凝膠狀膜的主要成分為纖維素。

23BC結(jié)構(gòu)鑒定

超微結(jié)構(gòu)：如圖1所示，堿煮處理的BC中菌體殘留更少；水洗與堿煮后BC超微結(jié)構(gòu)沒有變化，說明純化方法對纖維素的微觀結(jié)構(gòu)沒有影響，這與McKenna等的研究結(jié)果一致。此外，BC的微纖維直徑不足01 μm，呈密集網(wǎng)狀，很多根微纖維組成纖維絲帶，進(jìn)而形成不計其數(shù)的不規(guī)則、相互疊加的孔穴，即三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)持水保水性能良好，也有利于吸附有機(jī)試劑，因而BC可用作吸水材料和吸附材料，用于食品加工及藥物緩釋體系中[14]。

超分子結(jié)構(gòu)：對比天然纖維素的NMR圖譜（圖2），圖3中信號均為纖維素信號，說明菌株J2所產(chǎn)BC純度高，進(jìn)一步測定發(fā)現(xiàn)，該纖維素結(jié)晶度達(dá)78%，Iα型纖維含量達(dá)60%。生物材料的結(jié)晶度與其拉伸性能、尺寸穩(wěn)定性及密度呈正相關(guān)[15]，因此可知，菌株J2所產(chǎn)BC拉伸性能及尺寸穩(wěn)定性良好、密度高。Iα型是纖維素的亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，在一定條件下可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的Iβ晶型，BC具有很強(qiáng)的生物適應(yīng)性且在環(huán)境中易于分解，很可能是由于其中Iα型纖維含量高[16]。因此，與高等植物相比（后者Iα型纖維含量為30%[17]），菌株J2所產(chǎn)BC生物適應(yīng)性良好。

24菌種鑒定

241形態(tài)學(xué)鑒定J2菌體細(xì)胞呈桿狀，單個或成對，大小為（212～418）μm×（081～092）μm；菌落呈圓形，表面光滑，凸起，不透明，乳白色，大小為09～14 mm，詳見圖4，可初步判斷菌株J2為醋酸桿菌屬。

242分子生物學(xué)鑒定對菌株J2進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析，如圖5、圖6所示，菌株J2與菌株Ga hansenii NBRC14817、Ga hansenii NBRC14816和Ga hanseniiNBRC14820同支，相似度達(dá)100%。

微生物的分類鑒定從來沒有一個黃金指標(biāo)。表型特征雖然可進(jìn)行表型分群，但分類學(xué)結(jié)果不夠精準(zhǔn)，因而只能用于描述微生物的表型性狀特征。遺傳學(xué)分類法，即根據(jù)核酸分析得到的遺傳相關(guān)性所作的分類，以決定生物表型特征的遺傳特征DNA和RNA作為比較的準(zhǔn)繩，是一種更客觀和高度可信的分類方法。因此，表型鑒定與遺傳學(xué)分類法結(jié)合，可以更為準(zhǔn)確地對未知微生物進(jìn)行分類鑒定。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定與基于16S rRNA序列擴(kuò)增的分子生物學(xué)鑒定，即可確定菌株J2是漢森氏葡糖醋桿菌（Ga hansenii）。

3結(jié)論

本研究以筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制蕎麥醋為材料，將該蕎麥醋放置一段時間后，從其表面凝膠狀膜中自然分離出1株性能良好的BC高產(chǎn)菌株J2，其BC結(jié)晶度為78%，Iα型纖維含量為60%，表明BC密度高，拉伸性、尺寸穩(wěn)定性和生物適應(yīng)性均良好。通過形態(tài)學(xué)鑒定與基于16S rRNA序列的分子生物學(xué)鑒定，確定菌株J2為漢森氏葡糖醋桿菌（Ga hansenii）。

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