“二加二”法建立金線蓮類原球莖培養(yǎng)新體系

焦展 安勝軍 邵鐵梅

摘? 要? 本研究以金線蓮組培苗莖段為試材，采用“二加二”法，即“兩步誘導(dǎo)”（1. 利用暗培養(yǎng)誘導(dǎo)出白化莖段;2. 由白化莖段誘導(dǎo)類原球莖）加“兩步增殖”（1. 新誘導(dǎo)的類原球莖在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周;2. 利用L16（45）正交試驗(yàn)優(yōu)選增殖培養(yǎng)方案）的方法，研究外植體來(lái)源、外植體處理方式、暗培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基及附加成分對(duì)類原球莖誘導(dǎo)的影響，以及培養(yǎng)時(shí)間、光照強(qiáng)度、紫外光照射時(shí)間對(duì)類原球莖增殖的影響，并比較“二加二”法與傳統(tǒng)單步法的培養(yǎng)效果。結(jié)果表明，適宜白化莖段誘導(dǎo)類原球莖的培養(yǎng)基為MS + 2.5 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +1.0 mg/L S3307。黑暗腋生白化莖段是最佳外植體，最佳處理方式為整個(gè)莖段平放，3周暗培養(yǎng)得到的白化莖段能夠顯著提高類原球莖的誘導(dǎo)率。增殖培養(yǎng)5個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響順序?yàn)椋篘H4+/NO3?>NAA濃度>6-BA濃度>S3307濃度>蔗糖濃度。最佳配比為MS+0.5 mg/L S3307+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+ NH4+/NO3?（15 mmol∶45 mmol）+ 蔗糖40 g/L，可獲得增殖鮮重為246.90 g/L。增殖培養(yǎng)最佳時(shí)間6周。光照強(qiáng)度500 lx和253.7 nm紫外光每天照射6 h連續(xù)6周適宜類原球莖的增殖和總黃酮的積累。利用“二加二”法建立了金線蓮類原球莖高效培養(yǎng)新體系，該體系誘導(dǎo)率、初始材料擴(kuò)大倍數(shù)、增殖倍數(shù)均高于傳統(tǒng)單步誘導(dǎo)法。92%的類原球莖能夠穩(wěn)定增殖，不發(fā)生分化和愈傷組織化。

關(guān)鍵詞? 金線蓮;類原球莖;高效體系;誘導(dǎo);總黃酮

中圖分類號(hào)? Q 949.9;S567.239? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

金線蓮（金線蘭），學(xué)名花葉開(kāi)唇蘭[Anoecto chilus roxburghii （Wall.） Lindl.]，是蘭科開(kāi)唇蘭屬珍稀藥用植物。近年來(lái)，其保肝護(hù)肝、抗氧化、抗衰老、提高機(jī)體免疫力等藥用價(jià)值，已引起人們的廣泛關(guān)注[1-3]。自然環(huán)境的惡化和人們的過(guò)度采挖，使得野生金線蓮資源嚴(yán)重匱乏，藥材資源供不應(yīng)求。原球莖是蘭科等科屬的植物繁殖過(guò)程中的一種特殊的胚狀結(jié)構(gòu)，組織培養(yǎng)可培育類似原球莖的結(jié)構(gòu)，稱為“類原球莖”（protocorm-like bodies，PLBs）。類原球莖培養(yǎng)具有繁殖效率較高，培養(yǎng)周期短的優(yōu)點(diǎn)。利用組織培養(yǎng)的方法培養(yǎng)類原球莖并從中提取藥用植物有效成分是擴(kuò)大藥材資源，拓展藥材利用的有效手段。

金線蓮類原球莖組織培養(yǎng)已有部分研究[4-6]，研究?jī)?nèi)容局限于類原球莖的誘導(dǎo)與增殖的培養(yǎng)基配方[7]，以及不同添加物和不同培養(yǎng)條件對(duì)類原球莖誘導(dǎo)的影響[8-9]，近年來(lái)拓展到用類原球莖生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究[10]。以往研究都是通過(guò)單步直接誘導(dǎo)，大致分為兩種途徑：一種是從種子直接獲得原球莖[6-7]再進(jìn)行增殖，但金線蓮資源不足，種子量有限，大量應(yīng)用難以滿足生產(chǎn)需求;第二種是從組培苗莖段或莖節(jié)直接誘導(dǎo)類原球莖[5， 8]。此途徑應(yīng)用較廣，但仍存在許多問(wèn)題：如初代誘導(dǎo)困難，誘導(dǎo)率低[8， 11-12]。王建勤等[12]利用莖節(jié)做接種材料誘導(dǎo)率僅為66%。封應(yīng)麗等[8]的研究中誘導(dǎo)率提升至73%。韓曉紅等[13]以莖段切片為外植體，初步提高材料利用率，誘導(dǎo)率為81%，但仍不夠理想。此外，類原球莖增殖培養(yǎng)中常遇到“類原球莖穩(wěn)定性較差，易分化，易愈傷組織化”的問(wèn)題[11， 13-14]，嚴(yán)重降低其增殖效率，限制類原球莖培養(yǎng)體系在生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，本研究擬探索一種新的方法，即“兩步誘導(dǎo)”加“兩步增殖”的方法，簡(jiǎn)稱“二加二”法，先誘導(dǎo)白化莖段再誘導(dǎo)類原球莖并使其高效增殖，以期提高誘導(dǎo)率，同時(shí)數(shù)倍提高初始材料利用率，并進(jìn)一步構(gòu)建能夠穩(wěn)定增殖的類原球莖培養(yǎng)系統(tǒng)，為金線蓮類原球莖生產(chǎn)藥用成分的研究奠定基礎(chǔ)，也作為蘭科植物的原球莖培養(yǎng)等相關(guān)研究的參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 金線蓮品種為“福建尖葉”，帶根組培植株采購(gòu)于福建金草公司，切取莖段后在本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)連續(xù)1 a的繼代培養(yǎng)，獲得長(zhǎng)勢(shì)基本一致的金線蓮組培繼代植株。

1.1.2? 試劑? ?植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-芐氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid，NAA）、玉米素（Zeatin，ZT）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4- Dichlorophenoxyacet ic acid，2，4-D）、激動(dòng)素（Kinetin，KT）、噻苯?。═hiazuron，TDZ）、烯效唑（Uniconazole， S3307），購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。對(duì)照品為蘆?。˙BI），化學(xué)試劑亞硝酸鈉（科密歐），硝酸鋁（科密歐）。

1.1.3? 儀器? 蘇凈安泰SW-CJ-2FD型超凈臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SJC-Ⅱ型紫外線殺菌車(chē)，北京好特光紫外線科技有限公司;SPX-250I-G型微電腦人工氣候箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;ZHWY-1102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;UV-5200型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? “兩步誘導(dǎo)”法誘導(dǎo)類原球莖? 第一步：外植體的獲得。切取金線蓮組培繼代植株的莖段（外植體來(lái)源實(shí)驗(yàn)除外），每莖段帶1至2個(gè)節(jié)，放置于B1培養(yǎng)基（MS + 6-BA 2.0 mg/L +NAA 1.0 mg/L，蔗糖30 g/L，瓊脂8 g/L）中，溫度27 ℃，黑暗培養(yǎng)3周后（黑暗培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)除外），收獲白化莖段。

第二步：類原球莖的誘導(dǎo)。切取長(zhǎng)度為1 cm的白化莖段（每莖段帶一個(gè)節(jié)），放置于培養(yǎng)基Y1～Y9（待篩選）中，每瓶放置外植體14個(gè)，每處理6瓶，重復(fù)3次。光照500 lx，光照時(shí)間12 h，培養(yǎng)4周，收獲類原球莖。Y培養(yǎng)基的篩選：比較9種不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表1），4周后比較類原球莖的誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)個(gè)數(shù)。誘導(dǎo)率=每處理誘導(dǎo)出類原球莖的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%;平均誘導(dǎo)PLB個(gè)數(shù)=每處理誘導(dǎo)類原球莖的個(gè)數(shù)/接種外植體數(shù)。

1.2.2? “兩步增殖”法使類原球莖增殖? 第一步，將“兩步誘導(dǎo)”法得到的類原球莖切分為單個(gè)小球，接種到新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Y）中培養(yǎng)3周;第二步，將增殖培養(yǎng)第一步得到的類原球莖切割為直徑5 mm左右的小塊，將其放置于液體培養(yǎng)基中，每150 mL三角瓶接種50 g，每處理6瓶，采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基中激素含量、蔗糖含量以及N素比（NH4+∶NO3?）進(jìn)行比較，篩選適宜的增殖培養(yǎng)基配方。6周后統(tǒng)計(jì)類原球莖的鮮重增長(zhǎng)量，鮮重增長(zhǎng)量（g）=[每處理獲得的類原球莖質(zhì)量（g）?每處理起始類原球莖接種質(zhì)量（g）]/每處理樣本數(shù)。正交試驗(yàn)的表頭設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.2.3? 外植體的不同來(lái)源比較試驗(yàn)? 分別選用普通組培苗莖段，經(jīng)暗處理3周的組培苗莖段，光照條件下腋生莖段，黑暗3周后腋生的白化莖段，4種不同的外植體來(lái)源進(jìn)行比較，按照1.2.1第二步的培養(yǎng)基Y進(jìn)行培養(yǎng)，再4周后，統(tǒng)計(jì)類原球莖的誘導(dǎo)率。

1.2.4? 誘導(dǎo)培養(yǎng)中黑暗處理時(shí)間試驗(yàn)? 采用0、1、2、3、4、5周的暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)出白化莖段，將白化莖段放置于培養(yǎng)基為Y1，再4周后比較各處理的誘導(dǎo)效率和總黃酮得率。

1.2.5? 外植體不同處理方式試驗(yàn)? 將外植體分別采用整個(gè)莖段平放、整個(gè)莖段斜插、整個(gè)莖段埋入、莖段縱切半平放、莖段縱切半斜插、莖段縱切半埋入、莖片平放、莖片斜插、莖片埋入9種方法，放入培養(yǎng)基，按照1.2.1第二步的方法進(jìn)行誘導(dǎo)，4周后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.2.6? 增殖培養(yǎng)時(shí)間的確定? 分別在0、1、2、3、4、5、6、7、8周，每周統(tǒng)計(jì)類原球莖的鮮重和干重增長(zhǎng)量，確定最適宜生物量增長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.7? 光強(qiáng)對(duì)金線蓮類原球莖增殖培養(yǎng)和總黃酮得率的影響? 增殖培養(yǎng)中使用黑暗、弱光（500 lx）、較強(qiáng)光（1000 lx）和強(qiáng)光（2000 lx）4種處理，比較光照強(qiáng)度對(duì)類原球莖增殖和總黃酮得率的影響。

1.2.8? 紫外光不同處理時(shí)間試驗(yàn)? 在增殖培養(yǎng)過(guò)程中，在光周期中光培養(yǎng)階段紫外燈（SJC-Ⅱ型，60 w，波長(zhǎng)253.7 nm）每天照射6 h，分別照射7、14、21、28、35、42、48、56 d。紫外燈不照射的光培養(yǎng)時(shí)段日光燈照射（光照時(shí)間和強(qiáng)度同1.2.1）。接種量為150 mL三角瓶中接種50 g鮮重類原球莖，8周后測(cè)定所得材料的總生物增長(zhǎng)量和總黃酮含量，總生物量增長(zhǎng)量分為鮮重增長(zhǎng)量（g）和干重增長(zhǎng)量（g）。干重增長(zhǎng)量（g）=[每處理獲得的類原球莖干重（g）–每處理接種時(shí)類原球莖干重（g）]/每處理樣本數(shù)?？傸S酮得率=樣品中總黃酮質(zhì)量（g）/樣品質(zhì)量（g）×100%。

1.2.9? 總黃酮的測(cè)量? 將培養(yǎng)好的金線蓮類原球莖收集，在烘箱60 ℃干燥3 h后，80 ℃干燥0.5 h，并研成粉末?？傸S酮的測(cè)量采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[15]。分別精確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.12 g/L）0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用30%的乙醇溶液補(bǔ)充至5.0 mL。依次加入0.5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，10%硝酸鋁溶液0.3 mL，1.0 mol/L NaOH溶液4.0 mL，每加入新的試劑混勻后靜置10 min。取混合溶液4.0 mL，分光光度計(jì)510 nm測(cè)定吸光度?？瞻兹芤簽閷?duì)照，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出線性方程。將金線蓮類原球莖干燥粉末過(guò)40目篩，取0.5 g溶于95%乙醇濃度，提取時(shí)間24 h，料液比1∶100。取上清液2.0 mL，用30%乙醇補(bǔ)充至5.0 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)品同樣的反應(yīng)程序，最終取反應(yīng)完的溶液4.0 mL測(cè)定510 nm處吸光度。代入線性方程即可得到總黃酮的含量?？傸S酮得率=樣品中總黃酮質(zhì)量（g）/樣品質(zhì)量（g）×100%。

1.2.10? 與傳統(tǒng)單步誘導(dǎo)法效率比較? 將本研究所用的“二加二”法獲得的誘導(dǎo)率、初始材料擴(kuò)大倍數(shù)、增殖倍數(shù)、增殖鮮重、總效率和穩(wěn)定率分別與傳統(tǒng)單步法獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。初始材料擴(kuò)大倍數(shù)=每處理獲得的白化莖段個(gè)數(shù)/接種外植體數(shù)×100%，增殖倍數(shù)=每處理獲得的類原球莖個(gè)數(shù)/起始接種類原球莖個(gè)數(shù)×100%，總效率=誘導(dǎo)率×初始材料擴(kuò)大倍數(shù)×增殖倍數(shù)。穩(wěn)定率=每處理未分化、未愈傷組織化的類原球莖個(gè)數(shù)/收獲的類原球莖總個(gè)數(shù)×100%。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件和DPS7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncans新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 外植體來(lái)源對(duì)金線蓮類原球莖誘導(dǎo)的影響

結(jié)果表明，4種不同的外植體，以黑暗腋生白化莖段的平均誘導(dǎo)率最高，可達(dá)88.33%，與其他處理差異顯著（p<0.05）。經(jīng)過(guò)黑暗培養(yǎng)的兩個(gè)處理比光照條件下的2個(gè)處理的誘導(dǎo)率都高，并且差異顯著（圖1）。結(jié)果說(shuō)明，黑暗培養(yǎng)3周能夠顯著促進(jìn)金線蓮類原球莖的誘導(dǎo)。

2.2? 類原球莖的誘導(dǎo)過(guò)程

金線蓮組培莖段經(jīng)暗培養(yǎng)3周，獲得腋生白化莖段（圖2A）。白化莖段接種后2周，已有部

不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著（p<0.05）。1：普通組培苗莖段;2：經(jīng)暗處理的組培苗莖段;3：光照腋生莖段;

4：黑暗腋生白化莖段。

分莖段萌發(fā)出直徑1～2 mm的白色小球（圖2B）。3周后，白色小球逐漸膨大成為球狀或橢圓形的類原球莖，直徑約3 mm;原球莖個(gè)數(shù)逐漸增多，并且繼續(xù)有新的類原球莖萌發(fā)（圖2C）。4周后，類原球莖的萌發(fā)量最多，以后基本不再有新的類原球莖形成（圖2D）。

有的類原球莖為比較規(guī)則的球形，有的為橢圓形，有的為棒狀，有的為不規(guī)則形。后續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，黑暗腋生莖段誘導(dǎo)的類原球莖為球形，顏色潔白，生長(zhǎng)速度快，增殖率高，質(zhì)量最好（圖2E）。橢圓形的類原球莖顏色偏黃，多數(shù)帶有小芽，可用于誘導(dǎo)類原球莖再生植株;而棒狀和不規(guī)則形的，在生長(zhǎng)后期多數(shù)為膨大增殖，而且類原球莖生長(zhǎng)擁擠變形，有些還發(fā)生了玻璃化，不利于后續(xù)增殖培養(yǎng)。

與普通組培苗莖段誘導(dǎo)的類原球莖相比，利用腋生白化莖段誘導(dǎo)類原球莖，誘導(dǎo)速度快（2周已有50%以上外植體萌發(fā)出類原球莖，而普通莖段此時(shí)只有1/3萌發(fā)），質(zhì)量好（圖2B～圖2D，圖2F～圖2H）。

2.3? 誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)基的確定

供試的9種培養(yǎng)基中，以Y5和Y8的培養(yǎng)基類原球莖誘導(dǎo)率和平均誘導(dǎo)PLB個(gè)數(shù)顯著高于其他處理。Y8培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的類原球莖呈圓形，質(zhì)量好，后期增殖速度快;Y5培養(yǎng)基誘導(dǎo)率雖然較高，但是長(zhǎng)出的原球莖“球”狀不明顯，不夠典型，個(gè)別后期培養(yǎng)時(shí)增殖緩慢，增殖方式多為膨大，而原球莖個(gè)數(shù)增加不顯著，并且初期誘導(dǎo)的原球莖體積越大后期越不圓，有伸長(zhǎng)分化的趨勢(shì)，并且有些發(fā)生了玻璃化。因而，Y8培養(yǎng)基最適于誘導(dǎo)類原球莖，效率高，效果好。比較Y1、Y2兩種培養(yǎng)基，兩者在誘導(dǎo)率和平均出芽數(shù)方面均沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明Y2添加2.0 mg/L KT沒(méi)有提高Y1的誘導(dǎo)效果。比較Y1與Y3培養(yǎng)基，Y3的2個(gè)指標(biāo)都低于Y1培養(yǎng)基，可以推測(cè)在與6-BA、ZT配比時(shí)，NAA比2，4-D更利于類原球莖的誘導(dǎo)。比較培養(yǎng)基Y1、Y2、和Y7、Y9，在沒(méi)有6-BA的作用下，Y7和Y9中細(xì)胞分裂素ZT的誘導(dǎo)效果明顯降低，即使在Y9中將ZT濃度提升至1.0 mg/L也沒(méi)有達(dá)到好的誘導(dǎo)效果，推測(cè)6-BA較為適宜誘導(dǎo)金線蓮類原球莖，而ZT并不適宜其誘導(dǎo)。比較Y4、Y5、Y6、Y7發(fā)現(xiàn)，TDZ作為細(xì)胞分裂素加入培養(yǎng)基，與6-BA配合（Y4）不能提高誘導(dǎo)效果;TDZ單獨(dú)使用，只有在加入1.0 mg/L S3307（Y5）時(shí)顯著提高了誘導(dǎo)效果，而其余3種效果均不理想。誘導(dǎo)效果較好的Y5和Y8中的都含有1.0 mg/L S3307，說(shuō)明添加1.0 mg/L S3307能夠顯著提高類原球莖誘導(dǎo)效率（圖3）。

不同小寫(xiě)字母表示平均誘導(dǎo)率的差異顯著（p<0.05），不同大寫(xiě)字母表示平均誘導(dǎo)個(gè)數(shù)的差異顯著（p<0.05）。

2.4? 外植體處理和接種方式對(duì)金線蓮類原球莖誘導(dǎo)的影響

整個(gè)莖段平放是類原球莖誘導(dǎo)率最高的處理方式，誘導(dǎo)率為81.67%，顯著高于其他處理。而3種莖片的誘導(dǎo)處理方式誘導(dǎo)率在9種處理中顯著低于其他處理，說(shuō)明將莖段切片的處理方式不適宜誘導(dǎo)類原球莖（圖4）。

2.5? 暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)金線蓮類原球莖誘導(dǎo)的影響

與對(duì)照相比3周以上的暗培養(yǎng)能夠顯著促進(jìn)類原球莖的誘導(dǎo)效率。然而，對(duì)培養(yǎng)出的類原球莖的總黃酮得率進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)4、5周，類原球莖總黃酮得率有所降低。因而推測(cè)，“兩步誘導(dǎo)”階段，適宜類原球莖誘導(dǎo)的初始暗培養(yǎng)時(shí)間為3周（圖5）。

2.6? 增殖培養(yǎng)培養(yǎng)基的確定

結(jié)果表明供試的16個(gè)處理中，處理13的鮮重增長(zhǎng)量為35.91 g，且與其他處理差異顯著（表3）。本研究初始接種量為鮮重50 g/150 mL，理論上可獲得類原球莖增殖鮮重239.4 g/L。根據(jù)正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果顯示，對(duì)類原球莖增殖培養(yǎng)中鮮重的增加，培養(yǎng)基中NH4+/NO3是影響最大

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（p<0.05）。1：整個(gè)莖段平放;2：整個(gè)莖段斜插;3：整個(gè)莖段埋入;4：莖段縱切半平放;5：莖段縱切半斜插;6：莖段縱切半埋入;7：莖片平放;8：莖片斜插;9：莖片埋入。的因素，其次是NAA濃度，再次是6-BA濃度、S3307濃度，影響最小的是蔗糖濃度。最佳實(shí)驗(yàn)配比為：A1B4C4D2E2，即MS+0.5 mg/L S3307+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA + NH4+/NO3?（15 mm ol∶45 mmol）+蔗糖40 g/L（表4）。經(jīng)驗(yàn)證，按最佳實(shí)驗(yàn)配比得到的類原球莖增殖鮮重為246.90 g/L。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果顯示，對(duì)于鮮重的增加，5個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響大小順序與極差分析結(jié)果一致。并且，各因素p值均小于0.01，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響均達(dá)到極顯著水平（表5）。

2.7? 增殖培養(yǎng)時(shí)間的確定

每周統(tǒng)計(jì)類原球莖的鮮重和干重增長(zhǎng)量，0～6周生物量增長(zhǎng)量顯著增高，7～8周較6周有所下降，所以6周是最適宜生物量增長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間（圖6）。

不同小寫(xiě)字母表示平均誘導(dǎo)率的差異顯著（p<0.05），不同大寫(xiě)字母表示總黃酮得率的差異顯著（p<0.05）。

2.8? 光強(qiáng)對(duì)金線蓮類原球莖增殖培養(yǎng)和總黃酮得率的影響

對(duì)于鮮重增長(zhǎng)量和干重增長(zhǎng)量，光照處理的結(jié)果均顯著高于黑暗處理;對(duì)于總黃酮得率，弱光（500 lx）和較強(qiáng)光（1000 lx）處理顯著高于黑暗培養(yǎng)處理和強(qiáng)光處理（2000 lx）（表6）。而弱光和較強(qiáng)光處理的3個(gè)指標(biāo)差異均不顯著（表6）。因此，根據(jù)經(jīng)濟(jì)原則選擇500 lx的弱光培養(yǎng)有助于類原球莖增殖過(guò)程中總黃酮的積累。

2.9? 紫外光處理時(shí)間對(duì)金線蓮類原球莖增殖培養(yǎng)和總黃酮得率的影響

紫外光處理7～42 d，鮮重增長(zhǎng)量與對(duì)照沒(méi)有顯著性差異，而隨著紫外光處理時(shí)間的延長(zhǎng)，48 d和56 d的紫外光處理明顯降低了鮮重的增長(zhǎng)量（表7）。而對(duì)于干重的增長(zhǎng)量，紫外光處理只有一個(gè)相對(duì)降低的趨勢(shì)，但差異并不顯著。總黃酮得率受紫外光處理的影響呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，42、48、56 d的紫外光照射有利于總黃酮的積累，顯著高于其他處理。因而，為獲得較高的生物量和較高的總黃酮得率，選擇42 d的紫外光照射綜合效果較好（表7）。

2.10? “二加二”法和傳統(tǒng)單步誘導(dǎo)增殖法的培養(yǎng)效果比較

“二加二”法獲得的誘導(dǎo)率、初始材料擴(kuò)大倍數(shù)、增殖倍數(shù)、增殖鮮重、總效率和穩(wěn)定率均比傳統(tǒng)單步法獲得的數(shù)據(jù)有顯著提升（表8）。誘導(dǎo)率提升至88%的同時(shí)，初始材料擴(kuò)大8.9倍，總效率可提升至27.76。增殖培養(yǎng)中92%的類原球莖不會(huì)發(fā)生分化和愈傷組織化（表8）。

3? 討論

本研究是在普通單步誘導(dǎo)法莖段誘導(dǎo)途徑的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。其優(yōu)勢(shì)和創(chuàng)新點(diǎn)包括：誘導(dǎo)培養(yǎng)第一步，每個(gè)組培莖段可萌發(fā)出多個(gè)白化莖段作為誘導(dǎo)材料;誘導(dǎo)培養(yǎng)第二步，與傳統(tǒng)單步法所用的普通組培苗莖段相比，黑暗腋生白化莖段誘導(dǎo)效率更高（88.33%），類原球莖發(fā)生早，特征典型，質(zhì)量更好，本方法在提高誘導(dǎo)率的同時(shí)數(shù)倍提高初始材料利用率（8.9倍），這也是本方法與傳統(tǒng)單步法的本質(zhì)區(qū)別;增殖培養(yǎng)第一步，將誘導(dǎo)出的類原球莖在原誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代一次，保證了穩(wěn)定的生長(zhǎng)增殖環(huán)境，同時(shí)，不需要多次繼代即可達(dá)到較好的狀態(tài)，縮短了繼代周期;增殖培養(yǎng)第二步，液體懸浮培養(yǎng)增加了類原球莖與培養(yǎng)液和空氣的接觸面積，使生物量顯著增加。正交設(shè)計(jì)優(yōu)選的培養(yǎng)基成分配比保證了分化和愈傷組織化的類原球莖比例顯著下降，92%的類原球莖能夠保持穩(wěn)定增殖。

經(jīng)暗處理獲得白化莖段的方式，能夠顯著提高類原球莖的誘導(dǎo)效率。前人在不定芽再生研究中也有類似結(jié)論[6， 16-17]。但要在第二步誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)轉(zhuǎn)入光下，因?yàn)槌掷m(xù)黑暗處理則會(huì)影響類原球莖次生物質(zhì)的積累，總黃酮含量會(huì)受到抑制。而弱光下能夠促進(jìn)總黃酮的積累，這和鄭連金等[18]的研究結(jié)果一致。前期暗處理能夠促進(jìn)誘導(dǎo)率，提高類原球莖的獲得效率，而后期必須要一定強(qiáng)度的光照才能實(shí)現(xiàn)類原球莖的生物量和總黃酮的積累。這就要求后期繼續(xù)探討如何找到合適的臨界點(diǎn)，使得誘導(dǎo)率和總黃酮積累達(dá)到最大化，從而高效獲得總黃酮。本研究得到的適宜類原球莖增殖的光照強(qiáng)度低于文獻(xiàn)[19]中適宜金線蓮組培植株光照強(qiáng)度，推測(cè)原因可能是類原球莖本身的生理特點(diǎn)決定的，類原球莖組織材料相比完整組培植株較為幼化，因而誘導(dǎo)類原球莖所需的光照強(qiáng)度較弱。不同類型的光照對(duì)金線蓮的生長(zhǎng)和總黃酮等藥用成分的積累有顯著影響[20-21]。在周一鳴的研究中發(fā)現(xiàn)，C區(qū)紫外光（波長(zhǎng)200～280 nm）顯著促進(jìn)苦蕎總黃酮的積累[22]。而本研究使用的紫外燈車(chē)發(fā)射的紫外光正是C區(qū)紫外光（波長(zhǎng)253.7 nm），每天6 h，連續(xù)42 d，同樣對(duì)總黃酮積累達(dá)到了良好的促進(jìn)效果。

對(duì)于外植體來(lái)源，以往研究中采用的有：種子、組培苗的莖段、莖段切半、莖段切片等[4]。本研究采用的是黑暗處理的腋生莖段，取材方便，獲得率高，而且與種子直接誘導(dǎo)類原球莖相比，材料更多，誘導(dǎo)效率更高。與腋芽誘導(dǎo)的側(cè)芽莖尖外植體相比，材料的獲得率高（一個(gè)側(cè)芽只有一個(gè)莖尖，而白化莖段的莖節(jié)具有多個(gè)）。與莖片相比，操作簡(jiǎn)便，并且效率高，獲得的類原球莖質(zhì)量好。這和韓曉紅等[13]的莖片誘導(dǎo)研究結(jié)果不同，其原因可能是，本研究中雖然莖段切片與培養(yǎng)基的接觸面積增加，但破壞了莖段功能的完整性，反而抑制了類原球莖的萌發(fā)。此外，產(chǎn)地來(lái)源對(duì)金線蓮組織培養(yǎng)效果有較大影響[4]。本研究材料為“福建尖葉”，僅比較了該品種利用傳統(tǒng)單步誘導(dǎo)法和“二加二”法的培養(yǎng)效果。今后的研究可擴(kuò)展到其他品種。

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