芒果無機焦磷酸酶基因的克隆及其表達載體構(gòu)建

白蓓蓓 荊永琳 蔡秉宇 藍麗 王佳 趙志常

摘? 要? 無機焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase，PPase）催化焦磷酸（PPi）水解為2個無機正磷酸（Pi），是蔗糖合成途徑中的調(diào)控關鍵節(jié)點之一。本研究根據(jù)已經(jīng)報道的PPase基因的序列設計兼并引物，采用3′ RACE和5′ RACE方法，從貴妃芒果的果實中克隆得到了一個芒果PPase基因，將其命名為MiPPase，其全長cDNA序列為1014 bp，開放閱讀框為837 bp，編碼278個氨基酸，分子量為30.85 ku，等電點為4.68。通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白與紅花煙草具有較近的親緣關系。為深入探究MiPPase基因在蔗糖代謝過程中的作用，本研究成功構(gòu)建出pGreenII 62-SK-MiPPase基因過量表達載體，為后續(xù)研究MiPPase基因在芒果果實蔗糖合成的作用機理提供理論依據(jù)。

關鍵詞? 芒果;PPase;基因克隆;表達載體構(gòu)建

中圖分類號? S667.7; Q78? ? ? 文獻標識碼? A

無機焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase，PPase）是以焦磷酸為底物的水解酶，能夠水解多種代謝途徑中產(chǎn)生的焦磷酸（PPi），在自然界中廣泛存在[1-2]。PPase在植物組織中存在2種類型：一類是可溶性無機磷酸酶（soluble inorganic pyrophos-phatase，sPPase），主要存在于細胞質(zhì)基質(zhì)和細胞器中[3-4];第二類是膜結(jié)合焦磷酸酶（vacuolar pyrophosphatase，V-PPase），是不可溶性酶，主要與膜相結(jié)合。其中與線粒體膜相結(jié)合的PPase與可溶性無機磷酸酶結(jié)構(gòu)相似，均含有24個保守氨基酸，而功能卻與沒有24個保守氨基酸的與液泡膜結(jié)合的PPase相近[5-6]。自然界中大部分PPase都是可溶性的，其主要功能就是水解PPi。PPi屬于一種高能化合物，水解釋放大量能量，可以為生物體代謝過程提供能量[7]。在植物組織器官中，PPi主要是在細胞合成RNA、糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的生理過程中產(chǎn)生的，如果不能夠及時將其清除會影響細胞的生命活動，從而對植物的正常生長發(fā)育有不良影響[8-10]。到目前為止，已經(jīng)在擬南芥、馬鈴薯、煙草、橡膠樹等植物中對PPase基因有一定的研究和功能鑒定，在芒果中對于PPase作用機理方面的研究甚少。相關報道可知PPase催化焦磷酸PPi水解為2個無機正磷酸Pi，是蔗糖合成途徑中的調(diào)控關鍵節(jié)點之一。開展該研究可為后續(xù)研究MiPPase基因在芒果果實蔗糖合成的作用機理提供理論依據(jù)。本研究從貴妃芒果果實中采用3′RACE和5′RACE方法，克隆得到了一個PPase基因，通過相關生物信息學分析該基因編碼的蛋白序列理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域及該基因的其他物種的親緣關系，并進一步構(gòu)建了PPase基因的過表達載體，成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，為進一步研究PPase基因在芒果果實中的表達機制提供了依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 本實驗從貴妃芒果采集果肉作為原材料。貴妃芒果是由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所儋州芒果種質(zhì)圃提供。

1.1.2? 試劑? Primer STAR MAX高保真酶、rTaq酶（TaKaRa公司）;pEASY-blunt克隆載體、大腸桿菌 DH5α感受態(tài)、RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、TransScript? -Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒、T4連接酶（北京全式金公司）;SMARTTM RACE cDNA AmplificationKit（clontech公司）;農(nóng)桿菌EH105菌株由本實驗保存;引物由天一輝遠公司合成。

1.2? 方法

1.2.1? 貴妃芒果果實總RNA提取及cDNA獲取? 本實驗采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取貴妃芒果果肉總RNA，提取方法參照試劑盒說明書。cDNA獲取方法參見TransScript? -Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒操作說明書。

1.2.2? MiPPase基因全長的獲取? 采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）試劑盒以貴妃芒果果實總RNA為模板合成目的基因MiPPase的第一鏈的cDNA序列，然后分別擴增MiPPase的3′端和5′端序列，連接到pMD-19T克隆載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)，挑取陽性菌落送測序，根據(jù)測序結(jié)果拼接目的基因的cDNA全長，再設計含有酶切位點的特異引物（表1）擴增獲得MiPPase基因的cDNA全長序列。

1.2.3? MiPPase基因生物信息學分析? 使用NCBI上的ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.html）查找MiPPase基因的開放閱讀框并推測其氨基酸序列。利用ExPASY中的ProtParam在線分析工具（http：//www.expasy.org/ tool/protparam.html）分析MiPPase蛋白序列理化性質(zhì)。使用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi）中的Conserved domains 在線分析MiPPase蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域。利用DNAMAN6.0軟件預測MiPPase蛋白的結(jié)構(gòu)組成及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4? MiPPase基因表達載體的構(gòu)建? 構(gòu)建含目的基因的克隆載體pEASYblunt-MiPPase，提取pEASYblunt-MiPPase質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶Xbal I和Kpn I分別雙酶切pEASYblunt-MiPPase質(zhì)粒和pGreenII 62-SK空表達載體，切膠并利用膠回收試劑盒回收所需片段。使用T4連接酶將膠回收的2個片段連接起來，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞。利用Plasmid Mini KitⅠ試劑盒（OMEGA 公司）提取pGreenII 62-SK-MiPPase質(zhì)粒，使用相同酶進行雙酶切鑒定正確后并轉(zhuǎn)入EH105農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，菌液PCR檢測，挑取陽性菌液按體積1∶1比例加入50 %甘油，于?80 ℃保存。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 貴妃芒果果實總RNA提取

本研究提取貴妃芒果的果實總RNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀測定其濃度和純度，OD260/280的比值在1.9～2.0之間，濃度為200～500 ng/μL，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA，結(jié)果顯示RNA完整性較好（圖1），可用于后續(xù)實驗。

2.2? 芒果PPase基因全長的獲取

根據(jù)已經(jīng)報道的PPase基因的序列設計引物，利用RACE方法分別獲得MiPPase的5′端序列和3′端序列，將其拼接后獲得MiPPase的cDNA全長，重新設計含有Xbal I和Kpn I酶切位點的引物進行PCR擴增，凝膠電泳檢測獲得目的條帶約1000 bp（圖2），連接克隆載體送測序，測序

2.3? MiPPase基因生物信息學分析

2.3.1? MiPPase基因序列分析? 貴妃芒中克隆到的PPase基因全長cDNA序列為1014 bp，開放閱讀框為837 bp，編碼278個氨基酸，相對分子量為30.85 ku，預測其等電點為4.68。利用ExPASy在線軟件中的ProtParam分析MiPPase蛋白的理化性質(zhì)。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為37.67，較穩(wěn)定，疏水性GRAVY（grand average of hydropathicity）值為?0.074，說明該蛋白為親水性蛋白。根據(jù)軟件分析獲得該蛋白氨基酸組成及含量，并做柱狀圖3A。由圖3A可知構(gòu)成MiPPase蛋白的氨基酸中Ile和Leu含量較高，推測可能與該蛋白的空間結(jié)構(gòu)維持有關。采用Kyte & Doolittle標度，Window Size=13時計算，得到MiPPase蛋白的親疏水性信號圖（圖3B），圖中顯示峰值分布在?0.5 以下的比分布在0.5 以上的多，再次證明該蛋白為親水性蛋白。

2.3.2? MiPPase蛋白結(jié)構(gòu)域分析及結(jié)構(gòu)預測? 在NCBI上運用Blastp比對，發(fā)現(xiàn)MiPPase蛋白含有一個Put-Phosphatase（Putative Phosphatase）結(jié)構(gòu)域（圖4）。運用 DNAMAN6.0在線分析軟件Prabi預測MiPPase 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn) α-螺旋（Alpha helix）和無規(guī)則卷曲（Random coil）為其主要的結(jié)構(gòu)原件，占據(jù)比例分別為41.01%和38.13%。

2.3.3? MiPPase蛋白親緣進化關系分析? 根據(jù)MiPPase基因編碼序列分析蛋白序列，在NCBI上利用BlastP搜索并下載該基因同源序列，利用MEGA6.0中ClustX多序列比對，鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。結(jié)果顯示，MiPPase蛋白與紅花煙草的PPase蛋白親緣關系較近。

2.4? MiPPase基因表達載體的構(gòu)建

使用限制性內(nèi)切酶Xbal I和Kpn I分別雙酶切pEASYblunt-MiPPase質(zhì)粒和pGreenII 62-SK空表達載體，用T4連接酶連接雙酶切后的目的基因和空表達載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞。使用相同限制酶對pGreenII 62-SK-MiPPase表達載體進行雙酶切檢測驗證（圖6A），說明該基因表達載體構(gòu)建完成。將pGreenII 62-SK-MiPPase

3? 討論

無機焦磷酸酶（PPase）既是H+轉(zhuǎn)運酶[11]，也能催化焦磷酸（PPi）水解為2個無機正磷酸（Pi），是蔗糖合成途徑中關鍵的節(jié)點?？扇苄缘腜Pase可為植物細胞的生物合成反應提供能源，促進植物生長和發(fā)育。一些生物體有膜結(jié)合的PPase，這些PPase能夠為生物體提供PPi中磷酸酐鍵的能量，以此來完成跨膜的離子梯度，起質(zhì)子泵的作用。除此之外，膜結(jié)合焦磷酸酶（V-PPase）還具有調(diào)節(jié)細胞質(zhì)pH、保存生物能源、轉(zhuǎn)換Pi-PPi、響應逆境脅迫等作用[12-14]。有相關研究報道已從擬南芥、大麥、水稻等多種植物中克隆得到H+-PPase基因，并進行了深入研究[15-16]。與植物 H+-PPase 相比，關于 sPPase的研究進展相對緩慢，主要還集中在對分離基因、基因結(jié)構(gòu)、亞細胞定位等方面的研究，對基因的表達分析及轉(zhuǎn)基因功能鑒定研究較少。

1962年Kunite[17]首次從酵母中分離純化到PPase。隨后，20世紀80年代Lahti等[18]從大腸桿菌中克隆獲得PPase的部分基因序列。Visser等[19]1998年從大麥中克隆分離到一個PPase基因，該基因在大麥根、胚乳、嫩芽等代謝器官中均有大量表達。George等[3]沉默煙草PPase基因的表達后，PPi累積量增加，伴隨著葉綠素、淀粉的含量減少，進而降低了煙草光合作用的強度。

葉片光合作用產(chǎn)物主要以蔗糖形式，經(jīng)韌皮部運輸?shù)焦麑崈?nèi)，經(jīng)過一系列酶的催化及代謝過程，最終以果糖、蔗糖等形式存在于果實中。因此，果實品質(zhì)主要由糖積累決定。果實主要在液泡中積累糖分，光合作用產(chǎn)物從韌皮部運輸?shù)焦麑崈?nèi)儲存必須穿過質(zhì)膜和液泡膜，而該過程是需要消耗能量的。H+-ATPase和H+-PPase分別水解ATP和PPi來為光合產(chǎn)物運輸提供能量[20]，轉(zhuǎn)運物質(zhì)量越多，H+-ATPase越豐富，活性也越強。章英才等[21]探究得出靈武長棗果實的生長曲線為“雙S”型，呈現(xiàn)慢-快-慢-快-慢的生長趨勢，在2個快速生長的發(fā)育階段，質(zhì)膜H+-ATPase活性均較強，糖分跨質(zhì)膜運輸能力也隨之較強。李明等[22]發(fā)現(xiàn)蘋果PPase基因是影響蘋果酸積累的關鍵基因，且高酸果實中PPi的轉(zhuǎn)錄量變化趨勢與蘋果酸積累量變化一致。在植物的細胞質(zhì)和質(zhì)體中，PPi也聯(lián)系蔗糖降解、淀粉合成以及淀粉貯藏器官中糖酵解代謝的紐帶。PPi水平的高低將細胞中的合成反應和質(zhì)體中的分解反應有機協(xié)調(diào)，從而在蔗糖-淀粉的轉(zhuǎn)換中起到重要的調(diào)節(jié)作用。成熟的芒果果實風味獨特，其果實的甜味主要來源果糖、蔗糖等物質(zhì)。在芒果未成熟時，其果實的淀粉含量較高，隨著果實的發(fā)育，淀粉逐漸減少，蔗糖含量升高。不同芒果品種蔗糖含量有一定的差異，從而表現(xiàn)在品質(zhì)、風味的差異。例如，象牙白品種，其果肉較淡。這些差異可以與PPase基因的表達有一定的關系。本研究從貴妃芒果果實中成功克隆獲得一個PPase基因，對其編碼的蛋白序列進行分析，并進一步構(gòu)建了過表達載體，為人工調(diào)控芒果果實蔗糖含量奠定基礎，為PPase基因在芒果蔗糖代謝中的調(diào)控作用提供一定的理論依據(jù)。

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