廣東花生黑腐病病原菌鑒定及防治藥劑的室內(nèi)毒力測(cè)定

李娜 王澤鈿 何桂碧 向梅梅 張?jiān)葡?/p>

摘? 要? 花生黑腐病是花生的重要病害，對(duì)生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響，被列為我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性病害。為明確花生黑腐病的病原菌種類(lèi)和篩選有效防治藥劑，采用形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)花生黑腐病害進(jìn)行了病原菌鑒定，同時(shí)采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了8種殺菌劑對(duì)花生黑腐病菌的抑制作用。結(jié)果表明：花生黑腐病害的病原菌為冬青麗赤殼Calonectria iliciola。8種殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果顯示，10%戊唑醇EC對(duì)花生黑腐病菌的毒力最強(qiáng)，EC50值為1.12 μg/mL;300 g/L苯甲·丙環(huán)唑EC、29%吡萘嘧菌酯SC、25%咯菌腈SC、15%吡唑嘧菌酯SC和22.5%啶氧菌酯SC對(duì)花生黑腐病菌也有較好的抑制作用，EC50均低于10 μg/mL;30%精甲惡霉靈的抑制作用最差，EC50值為76.71 μg/mL。以上研究結(jié)果可為花生黑腐病的防治提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 花生;黑腐病;殺菌劑;毒力測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)? Q93? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

花生（Arachis hypogaea）是我國(guó)重要的油料作物，黑腐病是影響花生生產(chǎn)的重要病害之一。1965年，美國(guó)喬治亞州首次發(fā)現(xiàn)該病害，隨后，迅速擴(kuò)散至美國(guó)東南部的花生種植區(qū)，受害嚴(yán)重時(shí)損失率高達(dá)50%[1-2]。目前該病害分布于美國(guó)、日本、韓國(guó)、澳大利亞等10多個(gè)國(guó)家[3]。2009年，我國(guó)廣東省首次發(fā)現(xiàn)花生黑腐病，隨后，在福建、江西和云南等省先后發(fā)現(xiàn)該病害[4-7]。2010年，廣東省農(nóng)業(yè)廳將該病原菌增列入《廣東省農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物補(bǔ)充名單》。

花生黑腐病主要通過(guò)土壤和種子帶菌傳播，病害一旦發(fā)生，防控極為困難。目前花生黑腐病沒(méi)有高抗的品種，農(nóng)業(yè)防治極其困難，土壤熏蒸具有一定的效果，但費(fèi)用高且易造成環(huán)境污染[8]，迄今沒(méi)有有效的防治措施。本文擬在病原菌鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)病原菌進(jìn)行殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定和有效藥劑的篩選，為生產(chǎn)上病害的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株? 供試菌株于2017年5月采自廣東省翁源縣三華鎮(zhèn)，從發(fā)病組織的根莖部分離獲得病原菌。

1.1.2? 供試培養(yǎng)基? 病原菌分離用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、菌落形態(tài)鑒定培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基（MEA），顯微形態(tài)觀察培養(yǎng)基為康乃馨葉片培養(yǎng)基（CLA）。單菌絲分離培養(yǎng)基為水瓊脂培養(yǎng)基（WA）。

1.1.3? 供試藥劑? 供試殺菌劑共8種：30%精甲噁霉靈水劑、10%戊唑醇乳油，浙江禾本科技有限公司;22.5%啶氧菌脂酯懸浮劑，上海農(nóng)化生化有限公司;20%噻夫吡唑醚懸浮劑、15%吡唑醚菌酯懸浮劑，北京燕化永樂(lè)生物科技有限公司;29%吡萘嘧菌脂懸浮劑、300 g/L苯甲·丙環(huán)唑乳油、25%咯菌腈懸浮劑，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 病原真菌的分離和純化? 參照方中達(dá)[9]的組織分離法：新鮮病株的莖基部病組織切成3 mm×3 mm小塊，依次用75%酒精消毒10～15 s、2.5%次氯酸鈉消毒25～35 s，無(wú)菌水洗滌3次，再用無(wú)菌濾紙吸干水分，移至PDA平板、25 ℃培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，純化并保存菌種。

單菌絲分離：挑取菌落邊緣少量菌絲，放入WA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)24 h，于顯微鏡下切取單根菌絲，放入MEA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)。

1.2.2? 病原菌的致病性測(cè)定? 參照袁匯濤[10]的方法：花生種子水培發(fā)芽后，選取長(zhǎng)勢(shì)好的幼芽，于菌絲懸浮液中浸泡10 min，以無(wú)菌水處理為對(duì)照，每個(gè)處理接種5株。將接種處理后的幼芽插入水培棉中，移入裝有水的托盤(pán)中，25 ℃光照培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

1.2.3? 病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定? 參照Lombard等[11]的方法。在培養(yǎng)5 d后獲得單菌絲菌落的邊緣打孔，取菌餅置于新的MEA培養(yǎng)基上，于25 ℃條件下培養(yǎng)，觀察菌落特征。取菌餅置于CLA培養(yǎng)基上，于25 ℃條件下培養(yǎng)，待產(chǎn)孢后于光學(xué)顯微鏡下觀察其顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)，拍照并測(cè)量分生孢子、產(chǎn)孢細(xì)胞和泡囊大小。

1.2.4? 病原真菌的分子鑒定? 采用CTAB法提取待鑒定菌株的DNA。參照Carbone等[12]的方法，選取組蛋白H3（histone H3，HIS3）、翻譯延伸因子-1α（translation elongation factor 1-alpha，TEF- 1α）和β-微管蛋白（β-tubulin，TUB2）共3個(gè)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

特異性引物：HIS3選用引物CYLH3F和CYLH3R[13]。TEF-1α選用引物EF1-728F[12]和引物EF2[14]。TUB2選用引物CYLTUB1R[13]和T1[15]。

PCR反應(yīng)體系（總體積25 μL）：2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，10 μmol/L上游引物和下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。

His3 和TEF-1α的PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。TUB2的退火溫度為50 ℃。

將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序，最后將獲得的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析。

1.2.5? 室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)? 含毒培養(yǎng)基的配制：每種供試藥劑按有效成分含量分別用無(wú)菌水稀釋成一定濃度梯度的母液，向PDA培養(yǎng)基中加入已配制好的殺菌劑母液，制成不同濃度梯度的含藥平板。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果每種藥劑設(shè)置5個(gè)處理濃度（100、10、1、0.1、0.01 μg/mL）。CK加入等量的無(wú)菌水于PDA培養(yǎng)基作空白對(duì)照。

菌落測(cè)定方法：供試菌株培養(yǎng)5 d后，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打孔，取菌餅接種于含毒培養(yǎng)基中央，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。接種后的平板置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對(duì)照菌落長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿時(shí)，采用“十”字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑，計(jì)算平均值，得出抑菌率。抑菌率=（對(duì)照組菌落直徑藥劑處理組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑菌餅直徑）100%。

以藥劑濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（x），以校正抑菌率幾率值為縱坐標(biāo)（y），得到線(xiàn)性回歸方程y=a+bx和相關(guān)系數(shù)r值。計(jì)算供試藥劑對(duì)花生黑腐病菌的抑菌中濃度EC50及EC95值，比較各供試藥劑的抑制效果及花生黑腐病菌對(duì)各供試藥劑的敏感性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 花生黑腐病菌的病原菌鑒定

2.1.1? 花生黑腐病的癥狀及致病性測(cè)定? 花生幼苗期和成株均可受害，受害莖基部和果針上出現(xiàn)黑色的凹陷病斑，莢果和根受害后期會(huì)變黑腐爛，植株葉片變黃、萎蔫，嚴(yán)重時(shí)枯死。在潮濕狀況下，發(fā)病部位產(chǎn)生紅色的子囊殼（圖1）。

健康的花生幼苗在接種5 d后接種部位開(kāi)始出現(xiàn)褐色小病斑，病斑逐漸擴(kuò)大蔓延至整條根變褐色，后期植株萎蔫。接種發(fā)病癥狀與田間病狀一致。對(duì)照組未發(fā)病。

從接種發(fā)病的植株進(jìn)行再分離，得到的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)與接種菌株一致，說(shuō)明分離菌株為花生黑腐病的病原菌。

2.1.2? 花生黑腐病病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定? MEA培養(yǎng)基上菌落初期為白色，逐漸變?yōu)榛野咨翜\褐色，菌落背面中央紅褐色，邊緣白色。氣生菌絲絨毛狀，茂盛，菌落邊緣較整齊（圖2A，圖2B）。

在CLA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分生孢子梗多級(jí)帚狀分枝，分枝末端產(chǎn)生2～4個(gè)瓶梗，大小為（10～25）μm（3～6.5）μm;末端泡囊球形或近球形，大小為（15～28）μm（5.5～15）μm，延伸梗具隔膜，大小為（200～280）μm（3.5～6.5）μm;大型分生孢子直，圓柱形，無(wú)色透明，一端稍窄，大小為（60～75）μm（7.5～8.0）μm，1～3個(gè)隔膜，隔膜處縊縮不明顯。子囊殼卵球形或近球形，紅褐色，單生或聚生，大小為（300～600）μm（300～500）μm;子囊棍棒狀，每個(gè)子囊含8個(gè)子囊孢子;子囊孢子紡錘形，直或稍彎，無(wú)色透明，兩端鈍圓，1～3個(gè)隔膜，隔膜處稍有縊縮，大小為（30～85）μm （5～9.5）μm（圖2C～圖2J）。其顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)與Pan等[4]報(bào)道的冬青麗赤殼Calon ectria ilicicola基本一致。

2.1.3? 花生黑腐病病原菌的分子鑒定? 利用翻譯延伸因子-1α（TEF-1α）蛋白H3（HIS3）和β-的DNA序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，實(shí)驗(yàn)菌株ws（NCBI登錄號(hào)為MK120359、MK120360、MK120361）與Calonectria ilicicola（NCBI登錄號(hào)為AY725728.1、GQ267256.1、EF159730.1）的相似度最高，都為99%。因此，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和DNA序列分析，將分離的花生黑腐病的病原菌鑒定為C. ilicicola。

2.2? 花生黑腐病菌毒力測(cè)定

2.2.1? 供試藥劑對(duì)花生黑腐病菌的毒力活性? EC50值的大小是衡量殺菌劑對(duì)病原菌毒力作用的重要指標(biāo)。8種供試藥劑對(duì)花生黑腐病菌表現(xiàn)出不同的毒力作用，抑菌效果存在明顯的差異（表1）。其中，戊唑醇對(duì)花生黑腐病菌毒力最高，EC50為1.12 μg/mL，其次為苯甲·丙環(huán)唑、吡萘嘧菌酯、咯菌腈、吡唑嘧菌酯、啶氧菌酯，EC50均低于10 μg/mL，精甲噁霉靈對(duì)花生黑腐病菌毒力最低，EC50為76.71 μg/mL。

2.2.2? 花生黑腐病菌對(duì)殺菌劑敏感性比較? 毒力測(cè)定試驗(yàn)中，回歸方程的斜率越大說(shuō)明病原菌對(duì)藥劑的反應(yīng)敏感性越強(qiáng)。由表1可知，花生黑腐病菌對(duì)吡萘嘧菌酯最敏感，其次為戊唑醇、精甲噁霉靈、苯甲·丙環(huán)唑、噻夫吡唑醚，花生黑腐病菌對(duì)吡唑嘧菌酯和啶氧菌酯敏感性較低。

3? 討論

本研究通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)條件下菌落特征、形態(tài)學(xué)特征及3個(gè)基因的DNA序列分析，明確了采自廣東省翁源縣的花生黑腐病菌為冬青麗赤殼（Calonectria iliciola）。該結(jié)果和Pan等[4]的研究一致。前人研究中，花生黑腐病菌多以其無(wú)性態(tài)命名，為寄生帚梗柱孢菌（Cylindrocladium parasiticum），按照真菌分類(lèi)命名的最新法則[16]，該屬真菌應(yīng)以有性態(tài)命名，所以花生黑腐病菌應(yīng)訂正為冬青麗赤殼（Calonectria iliciola）。

已有研究表明，三唑類(lèi)的殺菌劑對(duì)Calonectria引起的植物病害具有較好的效果。馬海賓等[17]在研究殺菌劑對(duì)桉樹(shù)焦枯病菌（Cy. quinqueweptatum）毒力作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，供試的6種殺菌劑中戊唑醇對(duì)桉樹(shù)焦枯病菌的毒力最高，EC50為4.1237 mg/L。在林地防效中，丙環(huán)唑使桉樹(shù)林地的病情指數(shù)下降33%。本研究中，戊唑醇對(duì)花生黑腐病菌毒力最高，其次為苯甲·丙環(huán)唑，研究結(jié)果與其一致。由于殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果不能完全反映其大田的防效，因此戊唑醇對(duì)花生黑腐病菌的田間防效還需要進(jìn)一步大田驗(yàn)證。

花生黑腐病菌在我國(guó)南方地區(qū)發(fā)生普遍，生產(chǎn)中應(yīng)引起重視。我國(guó)從2009年在廣東首次發(fā)現(xiàn)該病害后，相繼在福建、江西和云南等地發(fā)現(xiàn)有該病害危害[4-7]。本文作者前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害在廣東省的大部分花生產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。目前對(duì)花生黑腐病的研究主要局限于病原菌上，而對(duì)該病的防治技術(shù)研究較少，僅袁匯濤[10]和藍(lán)國(guó)兵等[18]通過(guò)人工接種方法對(duì)花生黑腐病的抗病品種進(jìn)行了篩選，對(duì)花生黑腐病藥劑方面的防治還未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果可為花生黑腐病的藥劑防控提供一定的參考。

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