超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析梨和土壤中阿維菌素的降解動(dòng)力學(xué)及殘留量

范文靜 張文君 李慧冬 等

摘要 [目的]確保阿維菌素在梨果病害防治上的安全使用。[方法]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立梨和土壤中阿維菌素的檢測(cè)方法，通過(guò)田間樣品分析阿維菌素在梨果及土壤中的消解趨勢(shì)、殘留水平。[結(jié)果]該方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確性等指標(biāo)均滿(mǎn)足農(nóng)殘分析要求，適用于梨果和土壤中阿維菌素的測(cè)定;阿維菌素在梨果與土壤中消解動(dòng)態(tài)滿(mǎn)足一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程，梨果中半衰期分別為山東3.0 d、安徽1.7 d、河北1.3 d，土壤中半衰期分別為山東2.4 d、安徽3.8 d、河北1.2 d;在梨果及土壤中最終殘留均低于0.02 mg/kg。[結(jié)論]建議1.8%阿維菌素水乳劑防治梨木虱，藥劑稀釋1 500～3 000倍（有效成分6～12 mg/kg），施藥2次，距采收間隔期14 d為宜。

關(guān)鍵詞 阿維菌素;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;梨;降解動(dòng)力學(xué);殘留量

中圖分類(lèi)號(hào) S482.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）04-0198-04

Abstract [Objective] The research aimed to ensure the safe use of avermectin in the control of pear fruit diseases.[Method]Ultrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UHPLCMS/MS） was used to establish the detection method of avermectin in pear and soil. The field samples were analyzed and evaluated for the digestion trend and residual level of avermectin in pear fruit and soil.[Result]The sensitivity， precision and accuracy of the method met the requirements of pesticide residue analysis， and were suitable for the determination of avermectin in pear fruit and soil;the avermectin dynamics in the pear fruit and soil met the firstorder degradation kinetics equation.The halflives of pear fruit were 3.0 d in Shandong， 1.7 d in Anhui， and 1.3 d in Hebei. The halflives in soil were 2.4 d in Shandong， 3.8 d in Anhui， and 1.2 d in Hebei.The final residue in pear fruit and soil was less than 0.02 mg/kg.[Conclusion]It is recommended that 1.8% avermectin water emulsion can prevent pear hibiscus， and the drug is diluted 1 500-3 000 times （active ingredient 6-12 mg/kg）， and the application is 2 times. The interval between harvesting is 14 days.

Key words Abamectin;UPLCMS/MS;Pear;Degradation kinetics;Residue

阿維菌素是一種殺蟲(chóng)、殺螨、殺線蟲(chóng)活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，作用機(jī)制獨(dú)特，其通過(guò)干擾害蟲(chóng)神經(jīng)生理活動(dòng)，刺激其釋放γ-氨基丁酸，致使螨類(lèi)成、若螨以及昆蟲(chóng)和幼蟲(chóng)出現(xiàn)麻痹癥狀，2～4 d后死亡，對(duì)皮膚無(wú)刺激作用，對(duì)眼睛有輕微刺激作用，在試劑量?jī)?nèi)對(duì)動(dòng)物無(wú)致畸、致癌、致突變作用，對(duì)水生生物、蜜蜂高毒，對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)低毒，但按照WHO五級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，阿維菌素仍屬高毒化合物。阿維菌素易降解[1]，但若不規(guī)范使用，仍存在超標(biāo)的可能性。農(nóng)藥在植物體和土壤化學(xué)行為研究是制定農(nóng)藥殘留最大殘留限量（MRL）的基本數(shù)據(jù)之一，同時(shí)也是建立良好農(nóng)業(yè)生產(chǎn)規(guī)范（GAP）、保證農(nóng)藥等不超標(biāo)的重要依據(jù)[2-3]，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全意義重大。梨果鮮美，肉脆多汁，酸甜可口，風(fēng)味芳香優(yōu)美。富含糖、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物及多種維生素，具有清肺養(yǎng)肺的作用，科學(xué)家和醫(yī)師把梨稱(chēng)為“全方位的健康水果”或“全科醫(yī)生”。目前，中國(guó)農(nóng)業(yè)部現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)《GB 2763—2016》規(guī)定在梨中MRL為0.02 mg/kg，國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）規(guī)定在梨中的MRL為0.02 mg/kg。因此研究阿維菌素在梨果和土壤中的降解行為，考察其殘留量及使用安全性，對(duì)于梨果中合理使用阿維菌素有重要的意義。

阿維菌素的殘留檢測(cè)多采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[4-6]、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法[7-8]、酶聯(lián)免疫法[9]及高效液相色譜-質(zhì)譜法[10-14]等，其中關(guān)于食品的報(bào)道比較多，有蔬菜[12]、水果[14]、動(dòng)物制品[13]、谷物[10-11]等。目前，紫外檢測(cè)器檢測(cè)阿維菌素的靈敏度已不適應(yīng)殘留分析，熒光檢測(cè)器雖然靈敏度較高，但衍生方法繁瑣，而且衍生后的阿維菌素易降解，ELISA方法存在假陽(yáng)性。筆者參照已有研究文獻(xiàn)，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC- MS/MS）分析阿維菌素在梨果和土壤中的降解動(dòng)力學(xué)和殘留量，旨在為農(nóng)業(yè)合理用藥及確定休藥期提供可參考理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜系統(tǒng)，ACQUITY Ultra Performance LC（Waters 公司）;質(zhì)譜系統(tǒng)，Micromass Quattro Ultima IMPT 質(zhì)譜儀（Waters 公司）;WERLE T25BS2 高速分散勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司）;Hei-VAP Value旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）;LDZS-2 高速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)公司）;BSA224S - CW 萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó) Sartorius公司）;Eppendorf移液槍等其他實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。

阿維菌素（99.6%，德國(guó)Sigma公司）;乙腈、甲醇（HPLC級(jí)，美國(guó) Fisher 公司）;氯化鈉、醋酸銨（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)。

梨果實(shí)和土壤中進(jìn)行消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)中1.8%阿維菌素水乳劑防止梨木虱，施藥劑量為推薦最高使用劑量的4倍，即稀釋375倍（有效成分48 mg/kg）。按照《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》要求，于2010年在山東、安徽、河北三地開(kāi)展試驗(yàn)。采用噴霧法施藥，施藥次數(shù)為1次，每個(gè)處理重復(fù)3次。每小區(qū)2棵樹(shù)，土壤消解動(dòng)態(tài)每小區(qū)空白地30 m 同時(shí)設(shè)空白對(duì)照小區(qū)。于梨果實(shí)生長(zhǎng)至成熟個(gè)體一半大小時(shí)噴霧施藥1次。

梨果樣品：施藥后間隔1 h、6 h、12 h、1、2、3、5、7、14、21 d采集梨果樣品2 kg，隨機(jī)在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)不同方向及上、中、下、里、外等不同部位采集12個(gè)以上生長(zhǎng)正常的果實(shí)，切為4瓣，取對(duì)角兩瓣，切成1 cm以下的碎塊，-20 ℃冰箱保存。土壤土壤樣品：施藥后間隔1 h、6 h、12 h和1、2、3、5、7、14、21 d采土壤樣品1 kg，棋盤(pán)式選點(diǎn)6～12個(gè)，取樣深度0～10 cm，樣品于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 最終殘留試驗(yàn)。

設(shè)2個(gè)使用施藥劑量：稀釋1 500倍和稀釋1 000倍;每個(gè)劑量分別設(shè)2個(gè)施藥次數(shù)：2次和3次。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，小區(qū)間設(shè)保護(hù)行，每小區(qū)2棵樹(shù)。于梨果生長(zhǎng)中期開(kāi)始施藥，施藥間隔期為10 d，背負(fù)式手動(dòng)噴霧器進(jìn)行噴霧，噴藥時(shí)保持勻速，使藥液盡可能均勻地分布在處理區(qū)果樹(shù)的果實(shí)上。

梨果樣品：距最后一次施藥14、21 d，隨機(jī)在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)不同方向及上、中、下、里、外等不同部位采集12個(gè)以上生長(zhǎng)正常的果實(shí)，切為4瓣，取對(duì)角兩瓣，切成1 cm以下的碎塊，-20 ℃冰箱保存。土壤樣品：樹(shù)冠覆蓋范圍內(nèi)棋盤(pán)式選點(diǎn)6～12個(gè)，取樣深度0～15 cm，樣品于-20 ℃冰箱保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.01 g（精確至0.000 1 g）阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成0.01、0.02、0.04、0.100、0.200 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于0～4 ℃ 冰箱中貯存，待用。

1.4 樣品制備

田間樣本在采集后8 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并立即制備成實(shí)驗(yàn)室樣品冷凍保存。

梨：采集后的梨打碎混勻，于- 20 ℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)定。

土壤：將采集到的土壤樣本碾碎后過(guò)篩，收集于搪瓷盤(pán)中或其他適宜容器中，充分混勻，用四分法分取200～300 g樣品2份，分別裝入封口樣品容器中，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)定。

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取。

1.5.1.1

梨樣品。稱(chēng)取10.0 g試樣置于200 mL廣口瓶中，加入50 mL乙腈，以10 000 r/min高速勻漿1 min，過(guò)濾至盛有5～7 g NaCl的具塞量筒中，劇烈振蕩2 min，靜置30 min直至分層。準(zhǔn)確吸取20.0 mL乙腈相溶液至圓底燒瓶中，50 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，加入2.0 mL乙腈+水溶液（2∶3，V/V）。

1.5.1.2

土壤樣品。稱(chēng)取10.0 g試樣置于200 mL廣口瓶中，加5 mL水浸濕平衡，加入50 mL乙腈，振蕩1 h，過(guò)濾至盛有5 g NaCl的具塞量筒中，劇烈振蕩2 min，靜置30 min直至分層。準(zhǔn)確吸取20.0 mL乙腈相溶液至圓底燒瓶中，50 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，加入2.0 mL乙腈+水溶液（2∶3，V/V），待凈化。

1.5.2 凈化。

用6 mL乙腈、6 mL水依次預(yù)洗C18固相萃取柱，當(dāng)溶劑液面流至吸附填料表面時(shí)，立即加入樣品濃縮液，用8 mL乙腈+水溶液（2∶3，V/V）淋洗萃取柱，棄去淋洗液，最后用2 mL乙腈洗脫，收集洗脫液，0.2 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.6 儀器分析條件

1.6.1 液相色譜條件。

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫40 ℃，樣品室溫度10 ℃;進(jìn)樣體積5.0 μL;流動(dòng)相A為5 mmol/L醋酸銨（pH=3）;流動(dòng)相B為乙腈。流速0.2 mL/min，梯度洗脫，色譜分離梯度條件見(jiàn)表1。

1.6.2 質(zhì)譜條件。

大氣壓電噴霧離子源（ESI），正離子模式;毛細(xì)管電壓3.5 kV;離子源溫度110 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃;錐孔氣流量60 L/h，脫溶劑氣流量430 L/h;光電倍增器電壓650 V;碰撞室真空度7.22 e-3（mbar），質(zhì)量分析器真空度8.00 e-6（mbar）。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞電壓和錐孔電壓等質(zhì)譜條件參數(shù)詳見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍、檢出限及定量限

在“1.6”儀器條件下，注射0.01、0.02、0.04、0.10、0.20 mg/L標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，阿維菌素的MRM離子流圖見(jiàn)圖1，其保留時(shí)間為3.35 min，峰型較好。以阿維菌素絕對(duì)進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、定量離子（m/z 567.44）的色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，其線性方程為Y=7 448.23X-59.273 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，最小檢出量為1×10-11 g，在梨、土壤中的最低檢測(cè)濃度均為0.001 mg/kg。

2.2 精密度及準(zhǔn)確度

對(duì)空白梨、土壤樣品在0.001、0020、0.100 mg/kg 3個(gè)濃度水平上進(jìn)行添加，每個(gè)平行重復(fù)5次，測(cè)定其回收率。梨中回收率為78.0%～100.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～8.7%;土壤中回收率為84.0%～101.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～5.2%（表3），梨和土壤的空白樣品、添加樣品的阿維菌素圖譜分別見(jiàn)圖2～3。

2.3 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

農(nóng)藥在大田環(huán)境下的降解是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，通常采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程描述其降解規(guī)律，以半衰期T1/2表示農(nóng)藥在土壤和植物體中的消解程度，以施藥后的時(shí)間（T）為橫坐標(biāo)、殘留量（CT）為縱坐標(biāo)，繪制指數(shù)曲線（圖4）。

2.4 甲基硫菌靈在馬鈴薯中的最終殘留量

據(jù)2010年山東、安徽、河北三地的最終殘留試驗(yàn)，1.8%阿維菌素水乳劑按稀釋1 500倍（有效成分12 mg/kg）和稀釋1 000倍（有效成分18 mg/kg）施藥的情況下，距最后一次施藥14、21 d采集梨和土壤，阿維菌素在梨和土壤中的殘留量均低于0.02 mg/kg，滿(mǎn)足最大殘留限量要求。

3 結(jié)論

該研究建立了梨果實(shí)和土壤中阿維菌素檢測(cè)方法，在001～0.20 mg/L阿維菌素的儀器響應(yīng)值與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為78.0%～1011%，RSD為1.1%～8.7%，精確度、準(zhǔn)確度和檢出限均符合農(nóng)藥殘留分析要求，且前處理操作簡(jiǎn)單。通過(guò)田間樣品分析和評(píng)價(jià)阿維菌素在梨果中的消解趨勢(shì)、殘留水平，消解動(dòng)態(tài)殘留試驗(yàn)結(jié)果表明阿維菌素屬于易降解農(nóng)藥，其消解動(dòng)態(tài)滿(mǎn)足一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程，梨果中半衰期分別為山東3.0 d、安徽1.7 d、河北1.3 d，土壤中半衰期分別為山東2.4 d、安徽3.8 d、河北1.2 d;阿維菌素用藥14 d后殘留值已較低，消解量均達(dá)95%以上，對(duì)環(huán)境安全;阿維菌素在梨和土壤中的殘留量均低于0.02 mg/kg，滿(mǎn)足最大殘留限量要求。綜上所述，建議1.8%阿維菌素水乳劑防治梨木虱，藥劑稀釋1 500～3 000倍（有效成分6～12 mg/kg），施藥2次，距采收間隔期14 d為宜。

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