CRISPR—Cas9系統(tǒng)在農(nóng)作物中的研究進(jìn)展

張青霞 吳龍芬 苗貴東

摘 要：從技術(shù)發(fā)展、原理及應(yīng)用等方面進(jìn)行闡述，并對(duì)CRISPR-Cas9應(yīng)用前景進(jìn)行展望，旨在為農(nóng)作物的基因功能研究提供一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：農(nóng)作物；Cas9系統(tǒng)；RNA干擾；人工核酸酶技術(shù)；基因組

文章編號(hào)：1004-7026（2019）01-0111-02 中國(guó)圖書分類號(hào)：D033 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cas9系統(tǒng)是最新發(fā)現(xiàn)的一種可以與分子克隆和PCR等技術(shù)相媲美的、簡(jiǎn)單高效的、由RNA指導(dǎo)的第三代核酸內(nèi)切酶技術(shù)，由相關(guān)蛋白、重復(fù)序列和間隔序列交替排列組成，使大部分細(xì)菌和古細(xì)菌避免受外來核酸、噬菌體入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)。其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，成本較低，具有特異性、適用范圍廣、與多位點(diǎn)同時(shí)編輯等特點(diǎn)，使研究者實(shí)現(xiàn)特定目標(biāo)基因高效精準(zhǔn)的定點(diǎn)敲除、插入和替換[1]，對(duì)控制作物重要性狀基因的功能鑒定及遺傳改良具有巨大的應(yīng)用潛力。

目前，農(nóng)作物基因編輯技術(shù)主要有ZFNS、TALEN和CRISPR/Cas系統(tǒng)等，其中Ⅱ型CRISPR相關(guān)系統(tǒng)應(yīng)用最多。Cas9系統(tǒng)首次在人類與動(dòng)物細(xì)胞系中建立，經(jīng)過不斷改造后被廣泛應(yīng)用于多種模式生物（線蟲[2]、果蠅[3]、水稻[4]等）的基因組學(xué)和基因功能等各方面研究中。Cas9系統(tǒng)具有簡(jiǎn)單性、高效性和多功能性等特點(diǎn)，成為繼ZFNs和TALENs之后的第三代SSNs技術(shù)。

為順應(yīng)農(nóng)作物全基因組學(xué)、基因功能、基因調(diào)控機(jī)制研究及第二代高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，煙草、水稻、玉米等作物的基因組測(cè)序已順利完成，為研究者提供比以往更為豐富的遺傳信息庫。利用Cas9系統(tǒng)調(diào)控“產(chǎn)量”相關(guān)性狀基因，產(chǎn)生有益變異，打破產(chǎn)量壁壘，實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)量性狀的控制，比直接刪除或失活其編碼蛋白質(zhì)更可觀。因此，開展農(nóng)作物基因功能研究，揭示其遺傳發(fā)育規(guī)律，發(fā)掘和利用遺傳資源，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病抗蟲的最佳品種，具有重要的科學(xué)意義與巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

1 農(nóng)作物主要基因編輯技術(shù)

基因組編輯技術(shù)被《Science》評(píng)為2012年十大重要科學(xué)進(jìn)展之一，利用基因組編輯技術(shù)對(duì)植物基因進(jìn)行改造，是進(jìn)行農(nóng)作物遺傳改良的重要輔助手段。在開展功能基因組分析和反向遺傳學(xué)研究過程中，誕生了基因重組、RNAi干擾、基因敲降和人工核酸酶技術(shù)。目前農(nóng)作物基因編輯技術(shù)主要有轉(zhuǎn)錄水平中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控技術(shù)RNAi和核酸水平人工核酸酶技術(shù)，當(dāng)前作物在遺傳改良方面應(yīng)用的人工核酸酶技術(shù)主要包括ZFNs、TALEN和CRISPR/Cas系統(tǒng)。

2 農(nóng)作物基因編輯技術(shù)的發(fā)展與建立

2.1 RNA干擾技術(shù)

RNA干擾是指在進(jìn)化過程中高度保守，由雙鏈RNA誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機(jī)制，在基因功能研究和藥物開發(fā)中具有重要作用。CropDesiRn公司通過RNA干擾技術(shù)，對(duì)谷物的個(gè)別有益農(nóng)藝性狀基因進(jìn)行改造，增加谷物的產(chǎn)量，該技術(shù)也被用于改造模式生物秀麗線蟲的基因組。

2.2 人工核酸酶技術(shù)

人工核酸酶技術(shù)是最近幾年發(fā)展起來的一類全新的基因編輯技術(shù)。第一代（ZFNs）是由人工改造應(yīng)用的，含有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子和非特異性的核酸內(nèi)切酶FokI的切割結(jié)構(gòu)域組成，組裝昂貴、設(shè)計(jì)困難、耗時(shí)長(zhǎng)等劣勢(shì)限制其發(fā)展。第二代（TALENs）是類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與非特異性的核酸內(nèi)切酶FokI的切割結(jié)構(gòu)域相融合，使蛋白質(zhì)與核苷酸一一對(duì)應(yīng)，比ZFNs更易打靶和組裝設(shè)計(jì)。Li等在2012年利用該技術(shù)破壞水稻感病基因Os11N3的啟動(dòng)子序列而提高了水稻的抗病能力。逐步取代ZFNs和TALEN的第三代全新CRISPR/Cas9技術(shù)，只需設(shè)計(jì)和目標(biāo)核苷酸對(duì)應(yīng)的RNA序列，更易實(shí)現(xiàn)多基因編輯優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于生物界各個(gè)領(lǐng)域。

1987年日本石野良純[5]在E.coli堿性磷酸酶序列時(shí)發(fā)現(xiàn)5個(gè)重復(fù)成簇間隔短回文結(jié)構(gòu)的DNA片段，后來Jansen[6]利用生物信息工具對(duì)這個(gè)片段進(jìn)行命名并分析功能，直到20年后，Barrangou [7]才首次使用CRISPR-associated（Cas）概念并用實(shí)驗(yàn)證明CRISPR是與細(xì)菌免疫功能有關(guān)的結(jié)構(gòu)。CRISPR/Cas9是單個(gè)Cas蛋白行使生物學(xué)功能，由成熟的反式激活tracrRNA、Cas基因和CRISPR序列區(qū)組成，其工作原理是crRNA通過堿基配對(duì)與tracrRNA結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)處剪切雙鏈DNA對(duì)基因組DNA序列進(jìn)行精準(zhǔn)編輯。

4 CRISPR-Cas9技術(shù)在農(nóng)作物領(lǐng)域的應(yīng)用

采用輔助標(biāo)記選擇并構(gòu)建遺傳圖譜，通過數(shù)量性狀定位尋找農(nóng)作物基因組中的目的基因，該方法育種耗時(shí)耗力，且難以鑒定基因功能，但如果將數(shù)量性狀定位與CRISPR/Cas9技術(shù)相結(jié)合，就可以對(duì)1個(gè)或同時(shí)對(duì)多個(gè)基因功能進(jìn)行精確編輯并控制，省時(shí)省力，在農(nóng)作物品種改良中起到重要作用。高通量二代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，使得40多種植物基因組（擬南芥和水稻各2.5萬、3～5萬個(gè)基因）測(cè)序完成[8]，獲得的大量遺傳信息為研究植物適應(yīng)各種生態(tài)環(huán)境提供幫助。聶云夢(mèng)[9]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建NtDXR敲除載體，獲得DXR基因突變的植株能阻斷色素合成，推測(cè)該基因參與煙草葉綠素等色素合成。各種生物和非生物脅迫造成產(chǎn)量和品質(zhì)的重大損失，傳統(tǒng)抗病蟲育種主要是利用抗病蟲雜交育種和誘變育種誘發(fā)新的抗病蟲基因，但由于作物遺傳多樣性單一且存在生殖隔離，很難有預(yù)期性狀的突變體，而利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)植物基因序列進(jìn)行高效定點(diǎn)剪輯，可以定向育種，培育出高產(chǎn)抗病、抗逆或一些具有特殊應(yīng)用價(jià)值的農(nóng)作物。2014年高彩霞課題組[10]就是利用CRISPR/Cas9技術(shù)首次獲得廣譜抗白粉病的六倍體小麥。

隨著作物輕簡(jiǎn)化栽培技術(shù)和除草劑的廣泛使用，培育抗除草劑的作物新品種尤為重要。2015年，杜邦先鋒公司利用ALS中特定氨基酸突變提高玉米對(duì)乙酰乳酸合酶抑制類除草劑的抗性，是通過Cas9技術(shù)將脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸獲得抗氯磺隆玉米突變體。夏蘭琴團(tuán)隊(duì)將ALS編碼區(qū)特定堿基定點(diǎn)替換，使2個(gè)氨基酸變異而獲得抗磺酰脲類除草劑的水稻。同時(shí)，ENDO也通過類似方法獲得ALS編碼區(qū)W548L和S627I位置處堿基定點(diǎn)替換的水稻突變體，從而提高水稻對(duì)乙酰羥酸合酶抑制類除草劑的抗性。最近，SHIMATANI利用CRISPR/Cas9的Target-AID方法將水稻ALS編碼區(qū)的第96位丙氨基酸突變成纈氨酸，獲得抗磺酰脲類除草劑水稻突變體。

總之，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)敲除作物抗性負(fù)調(diào)控因子基因，或定點(diǎn)修飾抗逆性正調(diào)控基因的啟動(dòng)子，以增強(qiáng)基因的表達(dá)，或?qū)剐韵嚓P(guān)基因編碼區(qū)定點(diǎn)替換改變基因功能，都能在不同程度上改良作物的抗病或抗逆性，是作物抗性分子育種的有效途徑。

5 CRISPR/Cas9技術(shù)在農(nóng)作物領(lǐng)域的應(yīng)用前景

Cas9系統(tǒng)在農(nóng)作物中的應(yīng)用已成為一種趨勢(shì)，由于重要農(nóng)藝性狀的不利基因被發(fā)現(xiàn)，Cas9技術(shù)必將在遺傳改良和作物育種上發(fā)揮重大作用。但由于CRISPR技術(shù)存在脫靶效應(yīng)及如何合理設(shè)計(jì)sgRNA等限制因素，全基因組篩選工作處于初級(jí)階段，有待改善。雖然轉(zhuǎn)基因育種已有多年歷史且在多個(gè)國(guó)家種植，但令人擔(dān)憂的是轉(zhuǎn)基因的生物安全問題。美國(guó)認(rèn)為基因編輯誘導(dǎo)的突變與自然突變以及物理和化學(xué)誘導(dǎo)突變性質(zhì)相同，即通過CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制的抗褐化雙孢菇不屬于轉(zhuǎn)基因育種。即使存在劣勢(shì)，也比其他分子技術(shù)在植物基因功能研究和作物遺傳改良上更有優(yōu)勢(shì)。

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