2型糖尿病患者常見體質(zhì)與IL-6、IL-10、IL-10R1基因多態(tài)性的相關(guān)性研究

沈 艷，唐 紅，周 端，陳昕琳，王佑華

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

糖尿病是由先天遺傳和后天環(huán)境等因素共同作用而導(dǎo)致的一組以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。在個人稟賦和環(huán)境因素影響下，不同個體有不同的證候表現(xiàn)，而相對穩(wěn)定和整體性的癥狀和體征便會成為研究一種疾病異質(zhì)性從而更有效地指導(dǎo)臨床的線索[1]。這種相對穩(wěn)定和整體性的癥狀和體征常反映個體的中醫(yī)體質(zhì)，而體質(zhì)與基因間有著密切的相關(guān)性。臨床研究也顯示，2型糖尿病患者常伴隨多種炎癥因子濃度的改變，考慮其發(fā)病可能與相關(guān)炎癥因子有關(guān)[2-3]。因此，筆者研究2型糖尿病患者常見體質(zhì)陰虛質(zhì)和痰濕質(zhì)與炎癥因子白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)及其受體的多態(tài)位點的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 采用1999年WHO制定的2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，即有癥狀者，空腹血糖≥7.0 mmol/L，或口服葡萄糖耐量試驗中糖負(fù)荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L，或隨機血糖≥11.1 mmol/L；癥狀不典型者，必須另選一天重復(fù)測試以確診。

1.2 中醫(yī)體質(zhì)分類標(biāo)準(zhǔn) 按照中華中醫(yī)藥學(xué)會《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》[4]進行中醫(yī)體質(zhì)類型的判定。

1.3 臨床資料 395例2型糖尿病患者均來自2015年1月至2016年6月龍華醫(yī)院及4家社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，均經(jīng)門診或體檢確診，其中男172例，平均年齡(74.71±7.35)歲，女223例，平均年齡(73.12±8.37)歲。按是否陰虛質(zhì)分為：陰虛質(zhì)137例，其中男50例，女87例，平均年齡(71.72±7.97)歲；非陰虛質(zhì)258例，男122例，女136例，平均年齡(74.33±7.47)歲。按是否痰濕質(zhì)分為：痰濕質(zhì)92例，其中男29例，女63例，平均年齡(71.89±7.92)歲；非痰濕質(zhì)303例，其中男143例，女160例，年齡(74.32±7.79)歲。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡45～85歲，性別不限，符合診斷標(biāo)準(zhǔn)。研究對象陰虛質(zhì)轉(zhuǎn)化分≥40分，判定為“是”者，或30～39分，判定為“傾向是”者，均被納入陰虛質(zhì)組。痰濕體質(zhì)轉(zhuǎn)化分≥40分，判定為“是”者，或30～39分，判定為“傾向是”者，均被納入痰濕質(zhì)組。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn) 伴有心、肺、肝、腎、血液及胃腸道嚴(yán)重原發(fā)病者；各種病毒、細(xì)菌感染者，傳染性疾病、精神疾患或行為障礙者；因文化程度等因素不能很好地理解調(diào)查問卷內(nèi)容者。

1.6 觀察指標(biāo)和檢測方法

1.6.1 中醫(yī)體質(zhì)分類 采用問卷調(diào)查法，《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》共分9種中醫(yī)體質(zhì)類型，共有9個亞量表構(gòu)成67個條目，信息采集形式采用自我評價結(jié)合臨床中醫(yī)師訪談。收集所有研究對象的臨床資料，包括姓名、性別、年齡等。

1.6.2 基因檢測 本研究選取IL-6、IL-10及白細(xì)胞介素-10受體1(interleukin-10 receptor 1, IL-10R1)基因多態(tài)性研究作為切入點。對入選對象均進行中醫(yī)體質(zhì)辨識并檢測IL-6的rs1800796位點、IL-10的rs1800871位點、IL-10R1的rs2228055位點的基因分型。抽取患者外周血作為檢測樣本，所有研究對象抽血前空腹10 h，均于上午7:00-8:00抽取靜脈血2 mL，然后注入含肝素抗凝劑的真空管中混勻，置于4 ℃冰箱保存待用。首先采用QIAGEN的Flexigene DNA試劑盒提取全血提取DNA，再運用SNP技術(shù)平臺的多重PCR進行DNA的基因多態(tài)性檢測。根據(jù)基因多態(tài)性位點的位置，由上海生工生物工程股份有限公司分別用Primer3設(shè)計合成引物，并做ePCR驗證。實驗步驟：①對DNA片段進行擴增；②對PCR產(chǎn)物進行純化；③進行SNaPshot PCR擴增；④對SNaPshot PCR產(chǎn)物進行純化；⑤電泳樣品制備；⑥GeneMapper 4.0軟件分析。IL-6的rs1800796位點上游引物為GCACAGAGAGCAAAGTCCTC，下游引物為AGCTGAAGTCATGCACGAAG；IL-10的rs1800871位點上游引物為CATTCTATGTGCTGGAGATGG,下游引物為TTGCCCATTCCAGAATACAA；IL-10R1的rs2228055位點上游引物為TCATTTTTGTTTCAGTTCACACAC，下游引物為AGCAGCACCTAACACAGTGG。

2 結(jié)果

2.1 基因測序結(jié)果 IL-6 rs1800796存在C/G多態(tài)性，有GG型、CC型和GC型3種基因型。IL-10 rs1800871存在C/T多態(tài)性，有CC型、TT型和CT型3種基因型。IL-10R1 rs2228055存在A/G多態(tài)性，有AA型、GG型和GA型3種基因型。

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗 采用χ2檢驗對各觀察組3種基因的基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，以上結(jié)果顯示陰虛質(zhì)組、痰濕質(zhì)組IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055基因型分布實際值與預(yù)期值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。結(jié)果表明納入的2型糖尿病人群樣本來自一個較大的、處于隨機分配平衡狀態(tài)的群體，具有群體代表性。見表1、表2。

表1 陰虛質(zhì)、非陰虛質(zhì)各組基因的Hardy-Weinberg平衡定律檢驗

注：純合子預(yù)期基因型頻率=某等位基因頻率的平方，雜合子預(yù)期基因型頻率=2×兩種等位基因頻率的乘積，預(yù)期例數(shù)=總數(shù)×預(yù)期頻率

表2 痰濕質(zhì)、非痰濕質(zhì)各組基因的Hardy-Weinberg平衡定律檢驗

注：純合子預(yù)期基因型頻率=某等位基因頻率的平方，雜合子預(yù)期基因型頻率=2×兩種等位基因頻率的乘積，預(yù)期例數(shù)=總數(shù)×預(yù)期頻率

2.3 陰虛質(zhì)、痰濕質(zhì)IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055基因型與等位基因分布情況比較 采用R行×C列χ2檢驗，痰濕質(zhì)與非痰濕質(zhì)2型糖尿病患者IL-10 rs1800871基因型分布的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，進一步分析顯示：痰濕質(zhì)組CT基因型比例明顯低于非痰濕質(zhì)CT基因型比例(30.4%vs45.9%，χ2=6.137，P=0.013)。兩組間IL-6 rs1800796、IL-10R1 rs2228055基因分型分布的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。陰虛質(zhì)和非陰虛質(zhì)2型糖尿病患者IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055基因型分布的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3、表4、表5。

表3 陰虛質(zhì)和痰濕質(zhì)2型糖尿病患者IL-6 rs1800796基因型與等位基因分布頻率比較

表4 陰虛質(zhì)和痰濕質(zhì)2型糖尿病患者IL-10 rs1800871基因型與等位基因分布頻率比較

注：與非痰濕質(zhì)比較，*P<0.05

表5 陰虛質(zhì)和痰濕質(zhì)2型糖尿病患者IL-10R1 rs2228055基因型與等位基因分布頻率比較

2.4 陰虛質(zhì)、痰濕質(zhì)IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055基因型非條件Logistic回歸分析 以陰虛質(zhì)(1=是，0=否)為應(yīng)變量，以IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055各基因型為自變量，進行二項分類Logistic回歸分析。結(jié)果提示，以IL-10 rs1800871 CC為參照，L-10 rs1800871 CT為2型糖尿病陰虛質(zhì)的主要危險因素(P=0.019，OR值為2.593，95% CI為1.710～5.746)。以痰濕質(zhì)(1=是，0=否)為應(yīng)變量，以IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055各基因型為自變量，進行二項分類Logistic回歸分析。結(jié)果提示，以IL-10 rs1800871 CT為參照，IL-10 rs1800871 TT為2型糖尿病痰濕質(zhì)的主要危險因素(P=0.025，OR值為1.809，95% CI為1.076～3.041)。見表6、表7。

表6 2型糖尿病患者陰虛質(zhì)的多因素非條件Logistic回歸分析

表7 2型糖尿病患者痰濕質(zhì)的多因素非條件Logistic回歸分析

3 討論

炎癥因子是形成慢性炎癥的一個重要因素[5]，能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的炎癥和免疫應(yīng)答[6]，它由促炎因子和抗炎因子所組成，二者決定著炎癥的形成、發(fā)展和消退。目前認(rèn)為炎癥因子中腫瘤壞死因子、IL-6和C反應(yīng)蛋白是反映慢性炎癥的主要指標(biāo)。IL-10與心血管事件的相關(guān)性研究顯示其對動脈粥樣硬化斑塊的形成具有保護作用[7]。rs1800871位于IL-10基因啟動子區(qū)域，其變異對IL-10基因的表達具有影響作用[8]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，IL-10 rs1800871基因位點的C等位基因與頸動脈內(nèi)膜中層厚度具有相關(guān)性[9]。有學(xué)者對中國人群IL-10基因多態(tài)性與2型糖尿病遺傳關(guān)聯(lián)性作薈萃分析顯示，IL-10基因的SNP43位點多態(tài)與2型糖尿病存在一定遺傳關(guān)聯(lián)性[10]。

中醫(yī)治未病思想源遠(yuǎn)流長，《素問·四氣調(diào)神大論》明確指出：“圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂。”這一思想對糖尿病及其并發(fā)癥早期防治具有重要意義[11-12]。1980年代王琦等主編的《中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說》標(biāo)志著中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說的正式確立。中醫(yī)體質(zhì)稟受于先天，得養(yǎng)于后天，說明先天的遺傳基因是中醫(yī)體質(zhì)形成的基礎(chǔ)，它決定著個體的某些特性在生命過程中不會輕易受環(huán)境改變。不同中醫(yī)體質(zhì)人群疾病的轉(zhuǎn)歸及對邪氣的易感性存在差異。孫理軍等[13]對糖尿病患者進行體質(zhì)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)痰濕質(zhì)與陰虛質(zhì)占一半以上。韓文壇[14]對糖尿病患者進行研究，顯示以平和質(zhì)、陰虛質(zhì)、氣虛質(zhì)及痰濕質(zhì)為主，陰虛質(zhì)、氣虛質(zhì)及痰濕質(zhì)是導(dǎo)致生存質(zhì)量嚴(yán)重下降的主要體質(zhì)。結(jié)合筆者前期的研究結(jié)果，糖尿病患者的體質(zhì)主要是陰虛質(zhì)及痰濕質(zhì)?！鹅`樞·五變》曰：“五臟皆柔弱者，善病消癉?！庇纫躁幪擉w質(zhì)最易患病，糖尿病患者多見陰虛質(zhì)，與其“陰虛為本，燥熱為標(biāo)”基本病機相一致；過食肥甘厚味，導(dǎo)致脾胃運化失職，釀生痰濕，日久導(dǎo)致肥胖，胰島素敏感性降低引起糖尿病，正如《素問·奇病論》所說“此肥美之所發(fā)也”。

本研究結(jié)果顯示，痰濕質(zhì)2型糖尿病患者IL-10 rs1800871 CT基因型比例明顯低于非痰濕質(zhì)(P<0.05)，可能IL-10 rs1800871 CT基因型為痰濕質(zhì)保護因素。多因素非條件Logistic回歸分析結(jié)果提示，以L-10 rs1800871 CC基因型為參照，IL-10 rs1800871 CT基因型為2型糖尿病陰虛質(zhì)的主要危險因素(P=0.019)；以IL-10 rs1800871 CT基因型為參照，IL-10 rs1800871 TT基因型為2型糖尿病痰濕質(zhì)的主要危險因素(P=0.025)。結(jié)果提示IL-10 rs1800871基因變異可能是2型糖尿病陰虛質(zhì)、痰濕質(zhì)的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)之一。

本研究從分子生物學(xué)角度探討IL-6、IL-10、IL-10R1基因多態(tài)性與2型糖尿病常見體質(zhì)的相關(guān)性，初步證實IL-10 rs1800871基因多態(tài)性與2型糖尿病陰虛質(zhì)、痰濕質(zhì)的相關(guān)性，為糖尿病患者的早期防治提供一定的客觀依據(jù)。以此針對性地改善中醫(yī)體質(zhì)，調(diào)和陰陽，有利于改善體質(zhì)偏頗，從而截斷或延緩疾病的發(fā)生發(fā)展[15]。但是，2型糖尿病是一種多基因相關(guān)疾病，病因涉及遺傳、環(huán)境等多種因素，其發(fā)生發(fā)展過程極其復(fù)雜，同時，IL-10也是一種多效性的細(xì)胞因子，因此本研究結(jié)果只能說明IL-10的基因多態(tài)性參與了2型糖尿病常見體質(zhì)易感性的形成。IL-10基因多態(tài)性對2型糖尿病常見體質(zhì)易感性的確切診斷價值，以及本研究涉及的基因與其他基因間的相互關(guān)系等，仍需擴大樣本量進一步研究。