加味陽(yáng)和湯對(duì)腎陽(yáng)虛型骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度及血清微量元素的影響

曹端廣，夏漢庭，楊文龍，楊 佛，劉 璞，李 威，王書(shū)豪，楊鳳云

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨骼強(qiáng)度下降，骨量丟失為典型特征的一種骨代謝性疾病。其具有高發(fā)病率、高致殘率的特點(diǎn)，危害巨大，是僅次于心血管疾病的第二大高發(fā)疾病[1-2]。隨著人口的老齡化，OP的發(fā)病率也在持續(xù)上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前中國(guó)的OP患者約有9 000萬(wàn)人，到2050年將驟增至2億多人，占總?cè)丝诘?3.2%[3]。

加味陽(yáng)和湯是江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)許鴻照的經(jīng)驗(yàn)方，由陽(yáng)和湯加雞血藤、木瓜、漢防己發(fā)展而來(lái)。許鴻照在臨床診治OP的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，OP患者多有腎陽(yáng)虛的表現(xiàn)，而加味陽(yáng)和湯具有“補(bǔ)腎、溫陽(yáng)通絡(luò)”之功，在臨床上有針對(duì)性地運(yùn)用于腎陽(yáng)虛型OP患者，取得了較好的臨床療效。

在臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)從基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的角度出發(fā)，通過(guò)維甲酸灌胃、氫化可的松臀部肌肉注射復(fù)制腎陽(yáng)虛型OP模型大鼠，檢測(cè)大鼠股骨骨密度(bone mineral density，BMD)及血清微量元素的變化，探究加味陽(yáng)和湯對(duì)腎陽(yáng)虛型OP模型大鼠的治療作用及其可能機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SD大鼠48只，3月齡，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(贛)2018-0003]。

1.2 主要儀器 Hologic QDR-2000型雙光能骨密度儀、Bio-Tek ELx800型連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)生產(chǎn)；W2-100SP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生。

1.3 藥物及試劑 維甲酸(存貨編號(hào) R817255)、羧甲基纖維素鈉(存貨編號(hào) C804638)：上海麥克林生物科技有限公司；氫化可的松(國(guó)藥準(zhǔn)字 H12020885，每支2 mL，含氫化可的松10 mg)：天津金耀藥業(yè)有限公司；戊酸雌二醇(estradiol valerate，E2V；國(guó)藥準(zhǔn)字 J20130009，每片1 mg)：拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測(cè)試劑盒：北京四正柏生物科技有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)檢測(cè)試劑盒：武漢華美生物工程有限公司；鎂(magnesium，Mg)、鐵(ferrum，F(xiàn)e)、鋅(zinc，Zn)檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 不同濃度加味陽(yáng)和湯的制備 加味陽(yáng)和湯[雞血藤20 g，熟地黃15 g，肉桂、鹿角膠(烊化)、麻黃、白芥子、漢防己各10 g，木瓜、炮姜各6 g，甘草3 g]飲片均購(gòu)于江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，按照比例取飲片浸泡、濾過(guò)，由江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究實(shí)驗(yàn)室制備成煎劑，分別減壓濃縮至每毫升含生藥0.5、1、2 g，4 ℃冰箱下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 腎陽(yáng)虛型OP模型鼠的制備 維甲酸用1%羧甲基纖維素鈉混懸，按每日80 mg/kg灌胃給藥，持續(xù)2周，同時(shí)每日臀部肌肉注射氫化可的松，劑量為2 mg/kg，復(fù)制腎陽(yáng)虛型OP大鼠模型。模型復(fù)制完成后，取正常及模型組大鼠行BMD檢測(cè)，觀察大鼠是否有神疲、乏力、靜臥、小便多等腎陽(yáng)虛表現(xiàn)。確認(rèn)模型復(fù)制成功后，將48只正常大鼠及制備的腎陽(yáng)虛型OP模型鼠分為空白對(duì)照組，模型組，加味陽(yáng)和湯低、中、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組，共6組。各組藥物制成溶液后，分別用等容積1%羧甲基纖維素鈉、不同濃度(5、10、20 g/kg)加味陽(yáng)和湯、E2V(0.000 2 g/kg)灌胃(10 mL/kg)，連續(xù)6周。

2.3 大鼠一般情況觀察 觀察模型復(fù)制過(guò)程中及給藥過(guò)程中大鼠的活動(dòng)、精神、毛發(fā)、體質(zhì)量、食欲、食量、大小便等的變化。

2.4 骨及血清標(biāo)本的采集與檢測(cè) 用烏拉坦將大鼠麻醉后，從腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min，6 000 r/min離心10 min，分離血清，置于-20 ℃冰箱保存。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)血清ALP、TRAP，采用比色法檢測(cè)血清Mg水平，采用分光光度法檢測(cè)血清Fe、Zn水平。取大鼠右側(cè)股骨，采用美國(guó) Hologic QDR-2000型雙光能骨密度儀檢測(cè)BMD值。

3 結(jié)果

3.1 一般狀況 模型復(fù)制期間，大鼠拱背、毛色晦暗、食量下降、脾氣暴躁、小便多，考慮是維甲酸及氫化可的松的不良反應(yīng)，大鼠灌胃后死亡1只，尸體解剖后考慮灌胃不當(dāng)，藥液灌入氣管致死。給藥后，不同劑量加味陽(yáng)和湯組及陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠乏力、靜臥、小便多等腎陽(yáng)虛表現(xiàn)得到明顯改善，活動(dòng)增加，毛發(fā)漸光澤，食量及體質(zhì)量均有不同程度的上升。

3.2 各組大鼠股骨BMD比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠股骨BMD顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，加味陽(yáng)和湯中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組BMD顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

3.3 各組大鼠血清ALP、TRAP水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALP和TRAP活性均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清ALP、TRAP活性均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

3.4 各組大鼠血清Mg、Fe、Zn水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清Mg、Fe、Zn水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組血清Fe、Zn水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血清Mg水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；且加味陽(yáng)和湯升高血清Mg、Fe、Zn水平呈現(xiàn)劑量依賴性。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠股骨BMD，血清ALP、TRAP活性比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表2 各組大鼠血清Mg、Fe、Zn水平比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

OP是以骨量下降為主要特征的代謝性骨病，發(fā)病率高，多集中于50歲以上的中老年人，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量。西醫(yī)針對(duì)OP的治療相當(dāng)局限，主要以降鈣素、雙膦酸鹽、氟化物等治療為主，而這些藥物都具有一定的不良反應(yīng)[4]。中醫(yī)稱OP為“骨痿”。腎主藏精，主骨生髓，腎陽(yáng)虛是引起OP的主要原因，血瘀次之，故中醫(yī)治療重補(bǔ)肝腎、溫陽(yáng)通經(jīng)絡(luò)。方中君藥鹿角膠、熟地黃補(bǔ)髓強(qiáng)骨補(bǔ)肝腎；臣藥麻黃、白芥子溫陽(yáng)通絡(luò)；甘草調(diào)和諸藥。該方有溫補(bǔ)腎陽(yáng)、散寒通絡(luò)之功，能通督脈而補(bǔ)陽(yáng)，主治腎中陽(yáng)虛、血絡(luò)瘀阻之骨痿。此外，現(xiàn)代研究表明，鹿角膠有減少骨膠原分解，抑制骨吸收的作用[5]。

維甲酸誘導(dǎo)OP模型操作簡(jiǎn)便，時(shí)間短，成功率高，在復(fù)制OP動(dòng)物模型中被普遍采用。且該模型會(huì)出現(xiàn)全身皮毛卷曲、無(wú)光澤、懶動(dòng)、少食的情況，按中醫(yī)理論，有腎陽(yáng)虛表現(xiàn)，可用于復(fù)制OP腎陽(yáng)虛模型。

BMD是臨床診斷OP的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。模型組大鼠股骨BMD顯著低于空白對(duì)照組，有神疲、乏力、靜臥、小便多等腎陽(yáng)虛表現(xiàn)，說(shuō)明模型復(fù)制成功。各給藥組大鼠股骨BMD均高于模型組，且與加味陽(yáng)和湯的濃度呈劑量依賴性，說(shuō)明各給藥組對(duì)大鼠OP有治療作用，高劑量加味陽(yáng)和湯改善大鼠股骨BMD效果最明顯。

ALP主要由成骨細(xì)胞合成，是骨形成的生化標(biāo)志物，反映成骨細(xì)胞的活性；TRAP主要由破骨細(xì)胞分泌，是骨吸收的生化標(biāo)志物，反映破骨細(xì)胞的活性[7-9]。模型組ALP、TRAP顯著高于正常對(duì)照組，可佐證維甲酸所致骨質(zhì)疏松為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，骨形成及骨吸收活動(dòng)加強(qiáng)，但骨吸收速度遠(yuǎn)高于骨形成，骨量丟失，形成OP[10-11]。各給藥組大鼠血清ALP均高于空白對(duì)照組，說(shuō)明各給藥組均可不同程度地促進(jìn)骨形成。各給藥組大鼠血清TRAP活性均降低，說(shuō)明各給藥組的骨吸收被不同程度地抑制。

微量元素在人體中含量極少，但在抗病、防癌等方面作用巨大，與人的健康息息相關(guān)，維持人體正常的生理活動(dòng)[12-13]。不同濃度的加味陽(yáng)和湯對(duì)血清Mg、Fe、Zn等微量元素均具有上調(diào)作用，可引起礦物質(zhì)的沉積，增加骨密度，抗骨質(zhì)疏松。

綜上所述，不同劑量加味陽(yáng)和湯組給藥后，大鼠乏力、靜臥、小便多等腎陽(yáng)虛表現(xiàn)得到明顯改善，大鼠股骨BMD及血清微量元素均有不同程度的上升，說(shuō)明加味陽(yáng)和湯對(duì)OP的防治作用與其補(bǔ)肝腎、溫陽(yáng)通經(jīng)絡(luò)的功效密不可分。加味陽(yáng)和湯能改善維甲酸、氫化可的松所致的腎陽(yáng)虛型OP模型鼠股骨BMD，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，引起礦物質(zhì)的沉積，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。